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流式细胞仪检测直方图在常见故障维护中的应用
本文介绍了将流式细胞仪检测直方图与仪器含义性报警结合,更有效地发现仪器不良工作状态的方法,以及相应故障的检修和维护.
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液态生物芯片技术及其应用
目前,在核酸和蛋白质研究领域出现了一种全新的、称之为悬浮式点阵(suspension array)的检测手段和技术,该技术在很大程度上依赖近在光电转换和数字信号处理的进步,通过一束激光识别高分子(如聚苯乙烯)微球所产生的特异性荧光,另一束激光识别微球表面发生生物学反应后所产生的荧光信号,荧光编码不同的微球来实现检测指标的分类,进而实现高通量生物样品的分析;而通过生物学反应所产生的荧光信号可以实现分析的特异性.目前,这种基于荧光编码微球的高通量分析技术可提供快速、敏感、对一个样品进行至多可达100个分析指标的检测.分析荧光微球的速度高可达5000个/秒.应用时,把对应不同检测物的乳胶颗粒混合后再加入微量样品,在悬液中与微球进行特异性结合.结合的结果可以在瞬间经激光判定后由电脑数据信息的形式记录下来.因为分子杂交是在悬浮溶液中进行,检测速度快,所以又有"液态生物芯片"之称.
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Bactec 9120血培养仪用于活菌计数的初步研究
临床微生物检验和抗生素药效动力学研究过程中,经常会用到活菌计数技术,经典的浇注MH琼脂过夜培养后计数菌落的方法,耗时、费力、且难以标准化[1].Bactec 9120血培养系统(简称Bactec 9120)系利用荧光增强的原理快速检测血液及无菌体液标本中细菌的生长,该系统配套使用的培养瓶内有微生物生长的各种营养物质,而微生物在生长过程中的代谢产物之一CO2会激活瓶内底部荧光感应物质而发出荧光,荧光信号变化与CO2变化成正比,该荧光信号的变化经一组运算公式的运算,得出荧光信号变化的各种参数,从而判断培养瓶内是否有微生物生长.Bactec 9120设定瓶位探测器检测与计算时间间隔为每10min一次,可以准确提供标本阳性报警时间,并保存在联机计算机内供实验室人员查询[2].过去,国内外学者只关心报警时间长短对标本诊断周期的影响,本研究旨在探讨报警时间长短与初始接种菌量的关系及其临床活菌计数中的潜在应用价值.
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基因芯片技术及其在药学领域的应用
1 引言1995年,Schena[1]在
杂志上发表文章,他把拟南芥菜植物的cDNA文库中的48个cDNA用PCR方法扩增后,把PCR产物固化在玻璃片上,制成基因芯片(DNA microarray,也称DNA芯片).然后从拟南芥菜的不同组织中提取mRNA 反转录得到带荧光标记的cDNA,把不同组织来源的 cDNA混合后与玻璃片上的DNA进行杂交,用荧光双通道扫描系统对杂交点的荧光信号进行扫描分析,得到了拟南芥菜不同组织中基因的表达情况.自Schena的成功报道后,短短四﹑五年时间,有关基因芯片技术的研究与应用的报道已大量出现在多种新闻与学术媒体中. -
双重免疫组化技术在乳腺癌组织芯片中的应用
在生物医学和临床研究实践中,经常需要检测两种不同物质是否在同一样品或同一种细胞中共存,好使用双重染色法在同一个组织样本上进行杂交.双重染色的方法有两种类型,免疫酶组织化学和免疫荧光化学法.目前,在实体肿瘤中,由于甲醛固定石蜡包埋组织过高的荧光信号,免疫荧光法更适合用于冰冻保存的组织[1].双重免疫酶组织化学需要选择不同显色底物、不同的抗体、不同修复方法进行搭配,操作繁琐,在科研使用比较广泛,但临床操作要求稳定性高、操作简单,所以在临床不常规使用.
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现代免疫细胞化学和荧光图像技术
近20年来,生命科学、计算机科学、物理学、化学、生物信息学取得了巨大进步.人们已经可以表达、合成和突变体内的各种蛋白及其片段;已经可以随心所欲的制备出数以万计的抗各种天然蛋白、突变蛋白、翻译后经各种修饰(磷酸化、甲基化、乙酰化等)的蛋白、各种蛋白亚区、不同基序的抗体以及标记不同的细胞器的特异性抗体;已经可以合成许多稳定性好,不易淬灭,不受pH环境影响,水溶性好,发射光谱特异,适于多重标记的有机荧光色素,如分子探针Alexa Fluor系列[1]、Amersh的Cy系列[2]以及其他活体荧光标记分子;如FIAsH,ReAsH等二砷荧光色素[3]和O6-苯基鸟嘌呤荧光素(BGFL)[4],纳米量子颗粒(quantum dot)[5, 6]和荧光蛋白(GFP)[7]等;共聚焦扫描显微镜、全内反射荧光显微镜[8,9]及其他三维、四维荧光显微镜[10,11]和荧光图像数字图像系统的出现,又大大提高了对荧光信号的感知水平,即可感知细胞内低丰度(甚至单个分子)的标记荧光,其时间分辨率已可达微秒水平,其空间分辨率亦可与电镜匹敌[12].
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基因芯片筛选肝硬化相关基因
目的:应用基因芯片技术研究肝硬化相关基因的基因表达谱.方法:乙肝肝硬化组织为实验组,以正常肝组织为对照.按一步法抽提实验组和对照组标本的总RNA并纯化mRNA;将等量的实验组和对照组标本mRNA分别逆转录合成荧光分子掺入的cDNA做探针,混合后杂交1 568点BioDoorChipLiver-16S芯片.经严格洗片后用ScanArray3000扫描仪扫描芯片获取荧光信号图像,计算机分析后比较两种组织中差异表达的基因.结果:在1 568种基因中,肝硬化组织与正常肝组织间存在差异表达的基因.所检测的3例临床标本中,2例共有的差异表达基因66-76条(4.2-4.8%),3例共有的差异表达基因28条(1.8%).其中包含有与细胞外基质降解相关的基因,与细胞生长因子有关的基因,与信号传导有关的基因等.结论:应用基因芯片技术筛选肝硬化相关基因有助于阐明肝硬化发展机制.
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实时定量PCR技术(real-time PCR,RT-PCR)
所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 Ct值扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长根据样品扩增的Ct值就可计算出样品中所含的模板量。
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基因表达谱芯片筛选瘢痕疙瘩差异表达基因
目的:瘢痕疙瘩是皮肤真皮伤愈合后遗留的高出周围皮肤、发红、坚硬的病理结构.患者不仅有瘙痒、刺痛等症状,关节部位瘢痕挛缩常限制肢体的功能活动,在面部等暴露部位还可导致毁容,从而严重影响患者的身心健康和受损部位的功能恢复,成为影响严重烧、创伤病人康复的一大难题.从分子水平了解瘢痕疙瘩发生机制,将为治疗这一病症提供可靠的线索,因此本课题探讨与瘢痕疙瘩发生相关基因群的表达变化,并对部分基因的功能进行初步分析.方法:按一步法抽提瘢痕疙瘩和正常皮肤组织的总RNA并纯化mRNA将8464条人类基因PCR产物按微阵矩排列点样于化学涂层的载玻片上,制成基因芯片.将等量的瘢痕疙瘩和正常皮肤的mRNA分别逆转录合成荧光分子(Cy5或Cy3)掺入的cDNA一链做探针,混合后与上述基因芯片杂交.经严格洗片后扫描芯片荧光信号图像,计算机分析后比较两种组织中差异表达的基因.通过RT-PCR技术和Northern杂交检测TGF-β1和c-myc基因在不同组织中的表达变化.结果:在8464种基因中,瘢痕疙瘩和患者自身正常皮肤组织间存在差异表达基因,在所测的3对临床标本中共有差异表达基因436条.根据这些基因表达蛋白的结构和功能,可以分为15类,如:癌基因和抑癌基因,运输蛋白基因,细胞信号和传导蛋白基因,细胞应急蛋白基因,与细胞骨架和运动相关的蛋白基因,细胞凋亡蛋白基因等,其中上调基因有282条(3.33%),包括TGFβ1和c-myc基因;下调基因有154条(1.82%).RT-PCR和Northern杂交方法证实,瘢痕疙瘩内TGFβ1和c-myc的mRNA含量都明显高于正常皮肤.结论:瘢痕疙瘩的发生是一个复杂的过程,多种基因表达的变化与其形成相关.微阵矩基因芯片在筛选瘢痕发生相关基因的改变时,具有快速、高通量和高敏感等特点,瘢痕疙瘩差异表达谱的分析为治疗瘢痕提供了新的思路和线索.
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定量PCR的误差分析
定量PCR是在传统PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术,目前应用多的是荧光定量PCR (FQ-PCR)[1].它是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号来实时监测整个PCR进程,后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析.
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尿沉渣及干化学分析与镜检结果差异分析
随着检验医学的迅速发展,全自动尿沉渣分析仪出现,其中UF-50是利用流式细胞技术来分析尿样的有形成分,主要过程是用激光束照射某些部分被荧光燃料染色的细胞颗粒,再通过检测每个细胞由此产生的散射光和荧光信号,由此得到的化学信号便作为分析细胞的参数.
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SYSMEX尿沉渣计数仪激光调整1例
SYSYMEX全自动尿沉渣仪(UF-50/UF-100)采用先进的核酸染色和激光流式细胞技术.它将染色的尿液中有形成分液路聚焦,使其通过鞘流细胞检测室,用激光光束照射每个有形成分.产生前向散射光(FSC)信号,尿液中有形成分前向荧光(FL)信号、FSC和FL通过分光滤光器后分别照射到光电倍增管和放大器,仪器同时对散射光信号和荧光信号进行测定和分析,可精确地测出尿液中红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、上皮细胞(EC)、管形(CAST)、细菌(BACT)等有形成分.
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谷氨酸对海马神经元钙信号的影响
细胞内游离钙作为一种重要的第二信使,与细胞功能、细胞代谢和信号转导密切相关, 细胞内钙信号的失调会引起细胞功能异常。这也是某些神经系统疾病的重要环节,如癫痫、 Alzheimer病、脑水肿、细胞凋亡等。谷氨酸的毒性作用诱发的Ca2+跨膜内流和细胞 内游离钙平衡的失调可能参与癫痫的病理过程。本实验应用单细胞Ca2+显微荧光测量 技术,对其进行了初步研究。1 材料和方法 (1)试剂 胎牛血清、HEPES、EGTA、Fura-2/AM、胰蛋白酶、MK-801(Sigma产品),1 640培养基(Gibco产品),其它的试剂为国产分析纯。 (2)细胞制备 从新生1~3 d的Wistar大鼠无菌取出海马,在Hanks液内剪碎、吹打,在 37℃下0.1%胰酶-EDTA消化 10 min,离心、洗涤3次,接种于培养板中涂过0.01%poly -lysine的盖玻片上,贴壁后加入1 ml 1640培养液,置CO2培养箱,每隔3 d换培养液一 次。 (3)单个细胞[Ca2+]i的显微荧光测量 用 Hanks液冲洗细胞两次,加入荧光 染料Pura-2/AM(终浓度1.6 μmol/L)孵育15~30 min(37℃)。细胞外液为Hanks液,无 钙细胞外液则将Hanks的CaCl2以MgCl2代替。 实验用的显微荧光测量系统包括:倒置显微镜(Zeiss Axiovert100)、单色光系统(TILL 公司)、计算机(Macintosh Quadra 650)、X-CHART软件(HEKA公司)。用计算机控制氙光源 以提供340 nm和380 nm波长的激发光。荧光信号由光电倍增管转化为电信号送入计算机进 行处理。钙浓度由以下公式计算:[Ca2+]i=Keff*(R-Rmin)/(Rmax- R),R=F1/F2。 其中Keff为有效结合常数,F1、F2分别为340 nm和380 nm波长单色光激发的荧光 强度。Rmin、Rmax分别是在零钙浓度和高钙浓度(10 mmol/L)时的荧光比值。
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实时荧光定量RT-PCR检测TGF-β1 mRNA表达
利用荧光TaqMan技术(5′核酸外切酶活性)和一种可以实时检测荧光信号的仪器(ABI Prism 7700序列检测系统),在PCR反应完全封闭的情况下可实时检测PCR扩增的动力学变化,能够对标本扩增过程中的起始拷贝数快速、准确地定量,极大地克服了原有PCR技术存在的不足,已逐步成为PCR更新换代的新技术[1,2].目前常规检测β1转化生长因子(TGF-β1)表达多采用竞争RT-PCR及内源性参比基因RT-PCR,它们都属于PCR终点法检测,很难对起始模板数准确定量.我们利用实时荧光定量RT-PCR技术建立了检测TGF-β1 mRNA表达的方法.
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乙型肝炎患者血清中HBV DNA定量测定及意义
笔者通过聚合酶链反应(PCR)过程中,掺入荧光信号引物能量的转移,对血清中乙型肝炎病毒核酸(HBVDNA)进行定量测定,灵敏度高,特异性好,现将结果报道如下.
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双道原子荧光光谱法同时测定饮用水的铝和硒
铅和硒是生活饮用水中必测的项目.分别测定铅、硒的方法较多,主要有分光光度法、氢化物发生-原子吸收法、氢化物发生-原子荧光光谱法等.同其它方法相比,氢化物发生-双道原子荧光光谱法具有同时测定2种元素的优势,该方法灵敏度高、准确性高、干扰少、选择性好、线性范围宽、操作简单、节约成本,能较快的得出检测结果,从而提高检测效率.本文采用断续流动注射-氢化物发生技术测定生活饮用水中的铅和硒.在酸性介质中,样品中的铅、硒与硼氢化钾反应生成氢化铅和氢化硒,以氩气为载气,将氢化物导入电热石英原子化器中原子化,在特种空芯阴极灯照射下,用双道原子荧光光谱仪同时检测铅、硒的原子荧光信号.通过优化氢化物发生条件及仪器操作条件,实现生活饮用水中铅和硒的同时测定.
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荧光定量聚合酶链反应技术在结核病诊断中的应用价值探讨
结核病是由结核分枝杆菌( MTB)感染引起的慢性传染病,对疑似结核病人进行痰抗酸杆菌涂片染色镜检及分枝杆菌培养,直接找到病原菌,对诊断结核病具有重要意义。但上述两种方法也有其局限性:涂片镜检法总的敏感性为22%~80%[1],并且无法在镜下区分与MTB形态、染色相同的非结核分枝杆菌( NTM ),而NTM 与MTB一样严重威胁人类健康[2-3]。分枝杆菌培养法是临床诊断结核病的“金标准”,但该方法灵敏度也不够高,阳性率约为40%~60%[4],并且该法检测周期长,从培养至菌种鉴定一般需要8周甚至更长,且对早期结核菌感染者、药物治疗后细胞壁缺损L型细菌难以检出。为此,找到一种适合基层医疗单位应用,并能快速、灵敏诊断结核病,有效区分MTB与NTM的实验室诊断方法,在临床上有重要应用价值。荧光定量聚合酶链反应( FQ-PCR)是一种在聚合酶链反应( PCR )体系中引入荧光基团,利用荧光信号实时监测整个PCR扩增进程的方法,可对标本中起始 DNA 模板进行定量,提高检测灵敏度,同时省去了电泳步骤,减少污染机会,特异性更好。 FQ-PCR结果以循环阈值( Ct值)表示, Ct值越小,说明起始模板核酸浓度越高。本研究试图应用FQ-PCR法检测痰标本中MTB,以为临床提供一种快速、灵敏、特异的结核病辅助诊断方法。
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基于金字塔连接与高斯混合模型算法的层析芯片荧光信号检测
提出了一种层析芯片荧光信号自动识别的算法.该算法使用基于RGB空间的数学形态学运算方法对图像滤波增强,并采用金字塔连接算法分割图像,然后使用高斯混合模型(GMM)检测荧光信号,后再计算荧光区域的平均亮度.经实验证明,该算法能将荧光区域完整地分割出来,并能快速准确地检测出荧光信号,实现层析芯片的定量检测.
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065绿色荧光蛋白报告系统用于单纯疱疹病毒感染的快速诊断和定量
单纯疱疹病毒(HSV)是免疫功能低下患者感染和死亡的常见原因之一,因而有必要对当前HSV的诊断方法进行改进.基于对HSV复制过程的了解,可以利用源于病毒启动子的转录来鉴定感染病毒的细胞.据此,已将多种报告基因,如氯霉素乙酰转移酶(CAT)、lacZ及荧光素酶,与控制核糖核苷酸还原酶大亚基的启动子HSV-1的ICP6或HSV-2的ICP10相连,即可在HSV感染后几个小时之内诱导其特异性表达作为检测方法,有些已用于临床.然而,这些方法需要固定细胞、加入底物或制备细胞裂解物,给操作带来不便.本文利用增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告系统建立一种简便直接的方法,可连续监测活细胞中HSV的感染.EGFP较绿色荧光蛋白(GFP)的荧光信号强35倍,可用荧光显微镜和流式细胞仪488nm氩离子激发光进行检测.
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流式细胞术检测化疗后患儿外周血网织红细胞成熟度的临床意义
为探讨小儿白血病化疗后骨髓红系的变化及临床意义,对35例小儿白血病和恶性淋巴瘤患儿化疗后用流式细胞术(FCM)检测网织红细胞(Ret)计数及其成熟度,现分析如下.资料和方法一、临床资料对象为1994年9月~1996年2月河北医科大学附属四院儿科收治的急性白血病和恶性淋巴瘤患儿,急性白血病19例,恶性淋巴瘤16例,年龄5岁~14岁.全血标本在化疗开始前采集,化疗后每天采耳血1次,直至末梢血象恢复正常.采集的标本用FCM测定Ret计数及Ret成熟度的分析.二、样本制备及FCM检测样品制备按Tanke[1]的方法进行.FCM分析采用美国FACS 420流式细胞仪.设置Ret、高荧光率(HFR)荧光信号的电子窗口,直接显示Ret计数并进行Ret成熟度的分析.HFR即为在高荧光强度区域的Ret占全部Ret的百分率,即幼稚Ret占Ret总数的百分率(以下类推).数据处理用HP-300 CONSORT 30计算机分析.