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基因芯片筛选肝硬化相关基因
目的:应用基因芯片技术研究肝硬化相关基因的基因表达谱.方法:乙肝肝硬化组织为实验组,以正常肝组织为对照.按一步法抽提实验组和对照组标本的总RNA并纯化mRNA;将等量的实验组和对照组标本mRNA分别逆转录合成荧光分子掺入的cDNA做探针,混合后杂交1 568点BioDoorChipLiver-16S芯片.经严格洗片后用ScanArray3000扫描仪扫描芯片获取荧光信号图像,计算机分析后比较两种组织中差异表达的基因.结果:在1 568种基因中,肝硬化组织与正常肝组织间存在差异表达的基因.所检测的3例临床标本中,2例共有的差异表达基因66-76条(4.2-4.8%),3例共有的差异表达基因28条(1.8%).其中包含有与细胞外基质降解相关的基因,与细胞生长因子有关的基因,与信号传导有关的基因等.结论:应用基因芯片技术筛选肝硬化相关基因有助于阐明肝硬化发展机制.
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肠癌细胞株dynamin Ⅱ的差异表达
目的:应用半定量RT-PCR方法检测dynaminⅡ基因在大肠侧向发育型肿瘤细胞株同SW480细胞株及Lovo细胞株之间的差异表达.方法:以三种肠癌细胞株为标本,分别提取总RNA,逆转录合成cDNA,选择加入的模板量及循环数,优化PCR反应条件,确定适宜的反应体系,凝胶图像分析结果.结果:在大肠侧向发育型肿瘤细胞株同普通隆起型肠癌细胞株之间存在着dynaminⅡ基因的差异表达.结论:半定量RT-PCR方法具有简单,方便,经济的特点,通过该方法,我们发现在大肠侧向发育型肿瘤癌细胞株同SW480细胞株及Lovo细胞株之间存在dynaminⅡ基因的差异表达,此结果同我们基因芯片的筛选结果一致,结合dynaminⅡ基因的功能,我们推测该基因可能在LST的形态学或癌变机制中发挥一定作用.
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miRNA-30在肿瘤细胞中的作用
microRNA( miRNAs)是一种长度约为22核苷酸的非编码的单链小RNA,由内源基因编码,主要功能是负性调节靶基因的表达。从1993年Lee和Ambros[1]在C.elegans中发现lin-4以来,至今发现的miRNAs已经超过1000种。成熟的miRNAs分子的形成过程包含若干个步骤:miRNAs基因通过RNA 聚合酶Ⅱ转录合成原始 microRNA ( pri-microRNA),pri-microRNA具有5’端的帽子、3’端的polyA尾的结构;pri-microRNA 经过两次酶的剪切产生成熟的miRNAs。动物 pri-microRNA第一次剪切在细胞核内,经Dorsha酶剪切产生大小约70个核苷酸并形成茎环结构的microRNA前体( pre-microRNA);pre-microRNA通过Ran-GTP依赖性核浆转运子Exportin5从核内转移至细胞质中。在细胞质中,Dicer酶将pre-microRNA剪切形成一个不完全配对的双链RNA片段即microRNA和microRNA*双体,其中一条形成成熟的21~23个核苷酸长度的microRNA分子,另一条则可能迅速降解。成熟的microRNA形成RNA诱导复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),从而引起靶基因mRNA降解或翻译抑制。 miRNA与靶基因的mRNA 3’端非翻译区(3’-UTR)完全或部分结合,使得mRNA降解或抑制翻译产物的生成,从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化。目前报道的miRNAs 靶基因大约有5300个。一个miRNA可以与多个mRNA结合,而一个mRNA可以同时被多个miRNAs 调节,据统计约30%的基因受到 miRNA 的调节。
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基因表达谱芯片筛选瘢痕疙瘩差异表达基因
目的:瘢痕疙瘩是皮肤真皮伤愈合后遗留的高出周围皮肤、发红、坚硬的病理结构.患者不仅有瘙痒、刺痛等症状,关节部位瘢痕挛缩常限制肢体的功能活动,在面部等暴露部位还可导致毁容,从而严重影响患者的身心健康和受损部位的功能恢复,成为影响严重烧、创伤病人康复的一大难题.从分子水平了解瘢痕疙瘩发生机制,将为治疗这一病症提供可靠的线索,因此本课题探讨与瘢痕疙瘩发生相关基因群的表达变化,并对部分基因的功能进行初步分析.方法:按一步法抽提瘢痕疙瘩和正常皮肤组织的总RNA并纯化mRNA将8464条人类基因PCR产物按微阵矩排列点样于化学涂层的载玻片上,制成基因芯片.将等量的瘢痕疙瘩和正常皮肤的mRNA分别逆转录合成荧光分子(Cy5或Cy3)掺入的cDNA一链做探针,混合后与上述基因芯片杂交.经严格洗片后扫描芯片荧光信号图像,计算机分析后比较两种组织中差异表达的基因.通过RT-PCR技术和Northern杂交检测TGF-β1和c-myc基因在不同组织中的表达变化.结果:在8464种基因中,瘢痕疙瘩和患者自身正常皮肤组织间存在差异表达基因,在所测的3对临床标本中共有差异表达基因436条.根据这些基因表达蛋白的结构和功能,可以分为15类,如:癌基因和抑癌基因,运输蛋白基因,细胞信号和传导蛋白基因,细胞应急蛋白基因,与细胞骨架和运动相关的蛋白基因,细胞凋亡蛋白基因等,其中上调基因有282条(3.33%),包括TGFβ1和c-myc基因;下调基因有154条(1.82%).RT-PCR和Northern杂交方法证实,瘢痕疙瘩内TGFβ1和c-myc的mRNA含量都明显高于正常皮肤.结论:瘢痕疙瘩的发生是一个复杂的过程,多种基因表达的变化与其形成相关.微阵矩基因芯片在筛选瘢痕发生相关基因的改变时,具有快速、高通量和高敏感等特点,瘢痕疙瘩差异表达谱的分析为治疗瘢痕提供了新的思路和线索.
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HSP70生物学特性及在原发性肝癌中的表达意义
1962年Ritossa在制备果蝇唾液腺细胞染色体的过程中,因疏忽而调高孵箱温度,结果从25℃至30℃的环境变化中观察到特异的染色体松解现象,提示某些位点转录活性增加,称之为热休克反应(heat shock response).1974年Tissieres用放射自显影证实热休克反应中转录合成一组特殊蛋白质,命名为热休克蛋白(hot shock proteins, HSPs).1993年Udono等研究发现肿瘤组织来源的HSP70具有抗肿瘤特异性免疫机能后,其生物学功能和免疫治疗前景得到更为广泛的关注,并取得了重要研究进展[1,2].HSP70在原发性肝癌中表达及作用的研究亦方兴未艾,现就此综述如下.
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不同分化胆管癌差异表达基因的分离、克隆和功能研究
从分子水平研究胆管癌发病机理及病理过程,对认识及防治胆管癌都具有重要的理论和实际意义.基于临床研究的结果[1],我们采用Liang 1992年建立的差异显示法(DDRT-PCR)[2],来寻找高、低分化胆管癌间差异表达基因的cDNA.1.材料和方法:(1)采用TRIzol总RNA提取试剂盒,分别提取高分化、低分化胆管癌新鲜组织总RNA,逆转录合成单链cDNA.(2)DDRT-PCR:在20 μL体系中对2 μL逆转录产物进行扩增,加入2 μmol/L 4dNTPs, 5 μmol/L 锚定引物T15M, 1 μmol/L随机引物, 37Bqα-32P-dCTP,1.5UTaq酶.(3)DD-PCR产物取6 μL上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,恒定功率50W,电泳约3 h,滤纸揭胶,覆保鲜膜后压X光片,-70 ℃曝光14 h,显影.确定感兴趣的差异片段的位置并切胶,将切下的凝胶常规方法提纯并进行再扩增.(4)反向Northernblot鉴定:点样后,用化学变性及热变性法交联,标记探针基本上按照文献[3]进行.常规方法68℃杂交12 h,中等强度洗膜后放射自显影,-80 ℃压片22 h,显影.(5)PCR产物经纯化后可以直接用来测序,测序引物用T15N,PCR产物的核苷酸序列分析采用全自动DNA序列分析仪及配套的ABI试剂.
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电离辐射对不同乳腺癌细胞株端粒酶的影响
端粒是真核细胞染色体末端的一种特殊结构,主要由(TTAGGG)n串联组成.它的作用主要是维持染色体的稳定与完整,防止染色体融合.端粒酶是一种反转录酶,是能以自身RNA为模板逆转录合成端粒的核糖核酸酶,使端粒维持一定长度,从而使细胞获得无限分裂的能力.
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端粒酶检测诊断白血病的进展
端粒酶(Telomerase,TLMA)是由RNA和蛋白质组成的复合体,为依赖于RNA的一种特殊DNA聚合酶,能以自身携带的RNA为模板,逆转录合成DNA,加至染色体末端,从而维持端粒长度的稳定性.
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端粒酶检测在妇科恶性肿瘤诊疗中的应用
端粒酶是由RNA和蛋白质组成的依赖于RNA的DNA聚合酶,能以自身携带的RNA为模板,逆转录合成DNA加至染色体末端,从而维持端粒长度的稳定性.绝大多数正常的体细胞和组织端粒酶均为阴性,端粒酶的激活与细胞的无限增殖有关,大量研究结果表明,端粒酶活化是许多肿瘤发生的必经之路,肿瘤的发生发展需要端粒酶的参与[1].本文就端粒酶检测在妇科恶性肿瘤诊疗中的应用概述如下.
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大便脱落细胞端粒酶活性与结直肠癌的早期诊断的临床应用前景
端粒酶(telomerase)是一种逆转录酶,它以自身RNA为模板,逆转录合成端粒DNA,可以避免因DNA复制时端粒缩短所致的细胞衰亡,使细胞获得无限增殖的能力.
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HSP70与肿瘤
1974年,Tissieres 等证实高温引起的果蝇染色体蓬松是由于热休克激发染色体内基因转录合成特异性的蛋白,即热应激蛋白(又称热休克蛋白)引起的.热休克蛋白(Heat Shock Protein,HSP)按分子量大小分为以下几个家族:小分子HSP(相对分子质量为22~32 ku)、HSP60、HSP70、HSP90、HSP100和泛素(相对分子质量为7~8 ku),其中重要、诱导后表达量大的是HSP70家族.
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特异性抗肝癌噬菌体单链抗体库的构建及鉴定
噬菌体单链抗体(ScFv)弥补了传统McAb制备繁琐、抗原性强、穿透力弱等不足,为HCC临床和基础研究提供新的手段。我们用基因工程技术和噬菌体表面呈现技术构建和筛选特异性抗HCC噬菌体ScFv库。 1. 材料与方法:(1)抗HCC噬菌体ScFv库的构建:应用HCC细胞常规免疫BALB/C小鼠,从其脾脏提取tRNA并纯化mRNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增抗体轻链和重链可变区,应用linker-(Gly4Ser)3装配ScFv基因,在其5′端和3′端分别引入内切酶SfiⅠ和NotⅠ酶切位点,连接到噬菌体载体pCANTAB 5E,转化大肠杆菌TG1细胞,铺SOBAG平板,记数菌落。
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热休克蛋白与胃粘膜病变
热休克蛋白(Heat shock protein,Hsp)是一组具有重要生理功能、高度保守的蛋白质分子.1962年,Ritossa把25℃培育的果蝇幼虫置于32℃热环境中,30min后发现果蝇唾液腺染色体上出现很大的膨突.随后于1974年由Tissieres证实该膨突与热休克激发基因转录合成的一种特异蛋白有关,遂称之为热休克蛋白.现已知Hsp普遍存在于各种生物细胞中,与细胞耐受应激损伤关系密切.
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HSP90的功能及HSP90抑制剂的研究进展
热休克蛋白[1](heat shock protein,HSP)初是在1962年Ritossa P研究果蝇唾液腺时发现的,是一种在热应激环境下合成并被激活的一组特殊蛋白质。随后研究进一步证明高温导致果蝇染色体出现蓬松是由于热休克使染色体内基因转录合成特异性的蛋白,因是在热应激条件下产生的新蛋白质,故称为热休克蛋白,又被称为应激蛋白。细胞在进行生长、发育、分化、基因转录等功能的时候,HSP发挥着重要作用。在应激状态下,保护细胞生命活动必需的蛋白质是其主要生物学功能,从而使细胞生存和生长得到维持。HSP需要与其他不同功能的多种蛋白形成复合体才能完成上述功能。HSP与靶蛋白结合或使其解离从而对靶蛋白活性功能进行调节,包括对靶蛋白的折叠、亚基之间的装配,并参与细胞内的运输及降解。在肿瘤细胞中多种HSP家族成员表达是增强的,说明HSP在肿瘤的发生及发展中具有重要作用。某些HSP在恶性肿瘤中常高表达,并保护肿瘤在不利环境中生长。HSP在生物体中是普遍存在的,它是一组高度保守的蛋白质,相对分子质量为(6~170)×103,是一个具有多成员的庞大的糖蛋白超基因家族。按照其相对分子质量大小可分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP (HSP25, HSP27,HSP28)五大家族。