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引入易错PCR和DNA-shuffling技术构建单链抗体库
目的 引入易错PCR和DNA-shuffling技术构建高库容量的单链抗体库.方法 收集不同年龄、性别、健康状态的人的静脉血各5 mL,提取单个核细胞总RNA,反转录为cDNA,PCR扩增VH和VL基因,应用易错PCR对VH和VL基因进行突变,同时用DNA-shuffling技术对全长单链抗体基因进行体外改组,获得的分子与T载体连接,转化E.coli DH5α,选取阳性克隆,经菌落PCR后酶切鉴定抗体库多样性,计算分析单链抗体库容量.结果 成功构建了库容量为4.37×1013的单链抗体库,经酶切鉴定,初步判定抗体库多样性良好.结论 引入易错PCR和DNA-shuffling技术,成功构建了单链抗体库,为后续筛选高亲和力抗体奠定了实验基础.
关键词： 易错PCR DNA-shuffling 单链抗体库 -
SARS病毒N蛋白特异性单链抗体的筛选
目的利用大容量人源性SARS单链抗体库筛选N蛋白的特异性单链抗体. 方法利用RT-PCR的方法克隆了SARS病毒的N蛋白基因,克隆入原核表达载体pBV220,在大肠杆菌DH5α中进行表达并经离子交换色谱纯化后得到了纯度达95%以上的N蛋白,然后以此蛋白包被25 cm2组织培养瓶,对SARS单链抗体库进行先松弛,后严谨的筛选、富集,进行4轮筛选后对所筛的抗体进行ELISA鉴定. 结果经过4轮的筛选、富集,得到了1株高亲和力的N蛋白单链抗体N18. 结论在对SARS疾病的早期检测或筛查、SARS病毒的生活周期及发病机理的研究中N18将起到重要的作用.
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全人源肝癌噬菌体单链抗体库的鉴定及筛选
目的:对全人源肝癌噬菌体单链抗体库进行鉴定,筛选肝癌抗体,同时对抗体的活性进行鉴定.方法:PCR鉴定阳性重组菌TG1中人肝癌ScFv的插入率.先以人成纤维细胞黏附后再以肝癌细胞SMMC-7721为抗原对所建抗体库进行3轮"黏附-洗脱-扩增"的亲和筛选.将筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定;通过ELISA法鉴定其与人肝癌细胞的结合活性.结果:ScFv基因插入率为70%.在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第3轮为第1轮的214倍.筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定后,均可检测到目的基因.得到3株特异性肝癌单链抗体.结论:利用噬菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌体单链抗体及其基因,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性.
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人源性抗丙型肝炎病毒核糖体展示单链抗体库的构建
核糖体展示抗体库技术是制备人源性单链抗体的良好技术平台,该技术将表型与基因型相联系,可以从构建的抗体库中筛选到高亲和力的抗体,同时可找到编码此抗体的基因.本实验从丙型肝炎病毒(HCV)阳性患者的外周血淋巴细胞中扩增VH和VL基因,通过重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)构建了大容量的人源性核糖体展示scFv,文库,为获得特异的人源性抗HCv scFv奠定了基础.
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高通量DNA测序技术在抗体新药研发中的应用
自2005年首次报道了一种基于微乳液PCR技术的高通量DNA测序技术(high-throughput DNA sequencing technology)以来,高通量DNA测序平台已经发展为基因组和各种基因文库序列检测的强大工具.大容量的抗体基因库是日前获得抗体新药的基础,高通量DNA测序技术为从海量的抗体基因库中快速发现功能抗体分子提供了可能.本文就近几年高通量DNA测序技术在抗体基因库的多样性分析,抗体CDR3区的高通量测序、频率分析、功能基因发现及各种展示技术与高通量DNA测序技术的对接应用等方面进行了综述,以期为抗体新药的研发提供一条新的技术路线.
关键词： 高通量DNA测序技术 单链抗体库 抗体多样性 抗体CDR区 抗体新药 -
抗前列腺癌细胞特异抗体库的构建及特异结合抗体的筛选
目的: 获得前列腺癌的噬菌体呈现型单链抗体库,筛选与前列腺癌特异结合的抗体,为前列腺癌的诊断和治疗奠定基础. 方法: 用两种恶性程度较高的前列腺癌细胞PC3,DU145膜蛋白混合物免疫Balb/c小鼠.取脾脏提取总RNA,用RT-PCR分别扩增抗体重、轻链可变区基因(VH和VL), 经Linker连接形成ScFv基因片段,将ScFv基因片段与噬菌粒载体pCANTAB 5E的连接产物转化大肠杆菌TG1.用辅助噬菌体M13KO7进行超感染,获得重组噬菌体抗体.以恶性程度低的前列腺癌细胞LNCap为对照,用PC3细胞对重组噬菌体抗体库进行五轮筛选后,随机挑取克隆,经phage-ELISA筛选特异性结合PC3细胞的ScFv.结果: 用所构建的库容量为3.5×106的单链抗体库筛选特异结合抗体,得到一个与PC3细胞特异结合的噬菌体-单链抗体.结论: 本研究所构建的抗体库中可筛选到与前列腺癌细胞结合特异性较好的抗体,可用于前列腺癌的诊断和治疗中.
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人源抗胃癌单链抗体的构建及初步鉴定
目的 构建库容大、多样性好的噬菌体展示人源抗胃癌单链抗体.方法 收集胃癌患者外周血分离淋巴细胞,利用噬菌体展示技术,构建人源单链抗体库并初步筛选抗胃癌单链抗体,用ELISA方法检验该抗体与胃癌细胞结合活性.结果 成功构建了次级库容达4.0×109 pfu/ml的噬菌体展示人源单链抗体库,并初步筛选到与胃癌细胞特异性结合的单链抗体.结论 成功构建和筛选人源抗胃癌单链抗体,为进一步表达和应用特异性抗胃癌单链抗体奠定基础.
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特异性抗肝癌噬菌体单链抗体库的构建及鉴定
噬菌体单链抗体（ScFv）弥补了传统McAb制备繁琐、抗原性强、穿透力弱等不足，为HCC临床和基础研究提供新的手段。我们用基因工程技术和噬菌体表面呈现技术构建和筛选特异性抗HCC噬菌体ScFv库。 1. 材料与方法：(1)抗HCC噬菌体ScFv库的构建：应用HCC细胞常规免疫BALB/C小鼠，从其脾脏提取tRNA并纯化mRNA，逆转录合成cDNA，PCR扩增抗体轻链和重链可变区，应用linker-（Gly4Ser）3装配ScFv基因，在其5′端和3′端分别引入内切酶SfiⅠ和NotⅠ酶切位点，连接到噬菌体载体pCANTAB 5E，转化大肠杆菌TG1细胞，铺SOBAG平板，记数菌落。
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抗人SARS病毒单链抗体库的构建
目的:利用细胞内重组的方法, 构建大库容量的人源性抗SARS病毒单链抗体(scFv)库, 为筛选SARS病毒抗原的人源性抗体奠定基础.方法: 取6例SARS康复患者的80 mL 外周血, 分离淋巴细胞后提取总RNA.分离纯化mRNA 并反转录成cDNA后, 扩增抗体重链、轻链可变区基因片段.然后经重叠延伸PCR装配成scFv基因并克隆入噬粒载体pDAN5中, 电转化大肠杆菌TG1构建初级抗体库.制备初级库噬菌体后, 感染大肠杆菌BS1365进行细胞内重组制备次级抗体库.结果: 初级库库容量为3×109, 在大肠杆菌BS1365中重组后得到3×1011的次级抗体库.结论: 细胞内重组方法的应用可使大库容量抗体库的构建变得简单易行.构建的抗SARS病毒单链抗体次库不仅接近人类天然抗体库的水平, 而且多样性好, 为筛选抗SARS病毒抗原的抗体提供了保证.
