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人源中和性抗高致病性禽流感病毒H5N1基因工程全抗体的研制
运用噬菌体表面呈现技术,从禽流感病人恢复期血中获得淋巴细胞,通过基因工程手段,构建了人源抗H5NI禽流感病毒基因工程抗体文库.用纯化的人源H5N1禽流感病毒颗粒(A/Anhui/1/2005)及重组血凝素蛋白HA(A/Viet Nam/1203/2004)对Fab噬菌体抗体库进行富集筛选,成功地获得了抗禽流感病毒H5N1血凝素蛋白HA的人源单抗Fab段基因,并在大肠杆菌中获得有效表达.通过序列测定确定抗体轻重链型别,然后将阳性克隆的轻链和重链Fd段基因分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc后转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达.用ELISA、IFA和流式细胞术对所获人源单抗的功能特性进行鉴定.结果表明,我们获得了2株特异性针对H5N1禽流感病毒血凝素蛋白HA而与甲1型和甲3型人流感病毒无交叉反应的人源单抗(AVFlulgG01、AVFlulgG03).微量中和试验结果表明,除A/Guangdong/1/2006外,AVFlu-IgG01能够广泛地中和HA基因进化上属于Clade 2的中国南方、北方及中部地区的H5N1禽流感病毒分离株,同时还对属于Clade Ⅰ的越南H5N1分离株A/Viet Nam/1203/2004具有中和活性;AVFluIgG03虽然不能中和A/Viet Nam/1203/2004,但是对属于Clade 2的所有中国H5N1分离株均具有中和作用.人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程全抗体的获得不仅为高致病性禽流感病毒H5N1的预防和治疗带来了希望,同时也为其疫苗研制提供了新的思路.
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人源性抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌中的表达及活性测定
目的:制备有活性的人源性抗HBsAg单链抗体.方法:应用噬菌体表面呈现技术获得人抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抗体的Fab片段,并将VH和VL基因以(Gly4Ser)3linker连接成单链,插入表达载体pQE40,筛选大肠杆菌高表达菌株.结果:工程菌表达优化试验表明,在OD600为0.6时开始诱导,持续6 h,目的蛋白表达量高可达菌体总蛋白的31%.包涵体变性后上样镍离子螯合层析柱一步纯化,收集目的峰,透析复性,得纯度为97%的重组单链抗体,其亲和常数为0.23×108mol/L.结论:抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌内获得高效表达,经变性和复性,得到有活性的单链抗体,氨基酸组成正确.为进行临床前研究打下基础.
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结肠癌患者淋巴结构建抗结肠癌噬菌体Fab抗体库
目的构建2个结肠癌患者自然致敏淋巴结抗体Fab段噬菌体呈现库.方法取2个结肠癌患者转移淋巴结,提取淋巴结总RNA,逆转录PCR扩增重链Fd和κ轻链cDNA.依次将PCR产物插入载体pComb3的相应部位,噬菌体VCSM13辅助感染.以点印迹检测噬菌体表面Fab的表达.结果所选2种Ig亚类的重链Fd片段、2种κ轻链cDNA得到扩增.Fd片段和κ轻链均插入pComb3的重组率为40%,Fab噬菌体表达库容量达1.48×106.噬菌体悬液的点印迹免疫染色显示有Fab表达.结论构建了2个结肠癌患者自然致敏淋巴结抗体Fab段噬菌体呈现库,为筛选结肠癌相关抗体奠定了基础.
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噬菌体随机肽库技术的进展与应用
正由于Smith 率先在1985年将外源基因插入丝状噬菌体f1的外壳蛋白基因Ⅲ区,才使目的基因编码的多肽呈现在噬菌体表面,从而建立了噬菌体表面呈现状技术[1].
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噬菌体表面呈现技术在疫苗研制方面的应用
噬菌体表面呈现技术已被广泛地应用于生物技术的许多领域.文章从用噬菌体表面呈现技术鉴别抗原或抗原表位和用噬菌体作为疫苗载体两个方面对噬菌体表面呈现技术在新型疫苗研制方面的应用进行了综述.
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抗华支睾吸虫噬菌体抗体库的构建
目的构建抗华支睾吸虫噬菌体抗体库，以期筛选出抗循环抗原的抗体组合。方法应用噬菌体表面呈现技术，从感染华支睾吸虫病人淋巴细胞中提取总RNA，逆转录成cDNA后，用相应引物PCR扩增出重链Fd和轻链基因，经Xho I和Spel、Sac I和Xba I双酶切，先后克隆入噬粒载体pComb3，再电转化大肠杆菌XL1-blue菌株，辅助噬菌体VCSM13超感染。结果从感染华支睾吸虫病人淋巴细胞中扩增出约700bp重链γ1、γ3Fd段和轻链κ、λ基因，分别和pComb3连接后成功导入XL1-blue，得到滴度为7.5×1010cfu／ml，库容量为5.6×106噬菌体抗体库。结论抗华支睾吸虫Fab段噬菌体抗体库的构建，为进一步筛选抗华支睾吸虫循环抗原单克隆抗体奠定了基础。
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人源抗肝癌单链抗体的构建及鉴定
目的构建人源抗肝癌单链抗体.方法从肝癌患者外周血中分离淋巴细胞,利用噬菌体展示技术,构建人源抗肝癌噬菌体抗体库并筛选人源抗肝癌单链抗体,用ELISA方法检验该抗体与抗原结合活性.结果成功构建了库容为4.0×106的人源抗肝癌单链抗体库,初步筛选到与肝癌细胞特异性结合的单链抗体.结论成功构建人源抗肝癌单链抗体,为进一步临床应用奠定基础.
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应用激光显微分离技术在骨肉瘤组织原位筛选噬菌体肽库
目的将激光显微分离(1aser capturemicrodissection,LCM)技术应用于噬菌体表面呈现肽库的筛选过程,建立一种可以直接在天然组织中筛选肽库的方法.方法将新鲜人骨肉瘤组织块在噬菌体肽库溶液振荡孵育后制成组织冰冻切片,免疫组化染色检测噬菌体在组织中的浸润扩散.改进常规LCM切片处理方法,以冻干法替代酒精/二甲苯法脱水,以期在LCM操作过程中提高切片上噬菌体的存活率.LCM法分离摄取骨肉瘤切片上的肿瘤靶细胞,转染回收这些细胞上特异结合的噬菌体.滴定法检测所筛选的噬菌体对特异性细胞的亲和力.结果利用LCM技术,可以由肿瘤冰冻切片上收集到足够的与特异性噬菌体短肽,应用于噬菌体表面呈现肽库筛选.经过3轮筛选后所获得的噬菌体与人骨肉瘤组织的特异性亲和力提高16倍.结论本研究首次将LCM技术应用于噬菌体表面呈现肽库的筛选,可以使我们直接在新鲜人肿瘤组织中筛选与特定细胞群甚至单个细胞亲合的短肽;同时又避免了天然组织中其他杂质细胞的污染,为研制细胞特异性导向载体提供了一个新的途径.
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噬菌体呈现技术研制特异性人抗骨肉瘤干扰素
目的利用噬菌体表面呈现技术研制高活性、特异性抗骨肉瘤干扰素.方法将干扰素IFNa 1c/86D DNA插入噬菌体质粒载体pCANTAB5E,并构建噬菌体IFNa 1c/86D AB环突变文库;通过在OS732细胞上竞争性亲合洗脱、MTT法对比检测抗肿瘤活性,筛选针对OS732细胞的高活性噬菌体-IFN突变体.结果获得2个噬菌体-IFN突变体,其抗OS732细胞增殖活性较突变母体分别提高4和16倍.结论 a 1型干扰素可在噬菌体表面正确折叠表达.这一技术可用于研制高活性特异性IFN.
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特异性抗肝癌噬菌体单链抗体库的构建及鉴定
噬菌体单链抗体（ScFv）弥补了传统McAb制备繁琐、抗原性强、穿透力弱等不足，为HCC临床和基础研究提供新的手段。我们用基因工程技术和噬菌体表面呈现技术构建和筛选特异性抗HCC噬菌体ScFv库。 1. 材料与方法：(1)抗HCC噬菌体ScFv库的构建：应用HCC细胞常规免疫BALB/C小鼠，从其脾脏提取tRNA并纯化mRNA，逆转录合成cDNA，PCR扩增抗体轻链和重链可变区，应用linker-（Gly4Ser）3装配ScFv基因，在其5′端和3′端分别引入内切酶SfiⅠ和NotⅠ酶切位点，连接到噬菌体载体pCANTAB 5E，转化大肠杆菌TG1细胞，铺SOBAG平板，记数菌落。
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结合酪氨酸蛋白激酶受体EphB2的功能短肽的筛选
目的筛选能结合酪氨酸蛋白激酶受体EphB2的功能短肽.方法PCR扩增EphB2的配体结合区,定向克隆到融合表达质粒载体pRSET A中,阳性克隆经IPTG诱导表达融合蛋白,并利用Ni-NTA金属螯合亲和层析在变性条件下对表达的蛋白进行纯化,以此纯化蛋白为靶,将其包被于ELISA板上,进行3轮亲和筛选.结果电泳分析表明:表达的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,纯化蛋白质的纯度大于95%.从噬菌体随机12肽库中筛选到1 3个噬菌体阳性克隆.结论获得了具有结合EphB2活性的阳性噬菌体克隆且有共同的基序.
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噬菌体肽库技术与肿瘤的靶向治疗
噬菌体肽库是用基因工程手段在丝状噬菌体pⅢ基因的一侧插入特定长度的随机寡核苷酸,从而在噬菌体表面呈现与其次要外壳pⅢ融合的随机多肽,每一个噬菌体呈现一种序列的外源多肽,呈现特定长度的各种不同序列外源多肽的噬菌体集合体,即构成一个完整的肽库.其特点是:(1)融合蛋白不影响重组噬菌
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胃癌相关抗原表位模拟短肽的筛选
目的: 筛选能模拟胃癌相关抗原表位的功能短肽.方法: 利用离子交换层析, 对抗胃癌相关抗原单克隆抗体(mAb)进行纯化, 并以此mAb为靶标,将其包被于ELISA板上,以噬菌体随机12肽库对其进行3轮亲和筛选.结果: 从噬菌体随机12肽库中, 筛选到12个噬菌体阳性克隆.结论: 获得了具有模拟胃癌相关抗原表位的阳性噬菌体克隆, 且有共同的基序.
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利用噬菌体肽库筛选汉滩病毒受体结合表位的研究
目的确定汉滩病毒(HTNV)上可与宿主细胞受体结合的一段配基表位.方法型特异性mAb 3G1,与HTNV 糖蛋白G2及核蛋白(NP)具有双结合活性,且中和效价很高.以纯化的mAb3G1作为配基,淘筛噬菌体随机12肽库,经ELISA法鉴定后,对阳性克隆进行测序并与天然病毒蛋白G2及NP的序列进行同源性比较分析.结果经3轮筛选,噬菌体显示有良好的富集效果.从第3轮筛选产物中,随机挑取21个克隆进行ELISA结合实验.结果显示,9个克隆与mAb 3G1有较强的特异结合活性;DNA测序结果表明,具有保守性序列模式PX(1-2)HX(0-2)H.该基序分别与G296YPWHTAKCHY105及NP 81PTGVEPGDHLKERS94相似. 结论从噬菌体随机肽库中,筛选到能与mAb3G1特异性结合的一段短肽基序PX(1-2)HX(0-2)H,其与HTNVG2部分氨基酸的同源性较高,可能是与宿主细胞受体结合的表位,为进一步证实和研究HTNV的受体奠定了基础.
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抗胃癌单克隆抗体识别的噬菌体呈现肽与天然抗原的关系
噬菌体呈现的随机肽库已成功地用于筛选B细胞或T细胞表位.为进一步研究胃癌相关抗原与相应单克隆抗体(mAb)结合的结构基序及其相互作用,我所通过两株胃癌mAbMG7和MGb2筛选噬菌体呈现的随机九肽库,获得一些可与mAb结合的噬菌体呈现肽.我们采用竞争抑制实验,研究了这些肽与天然胃癌相关抗原的关系.
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抗人卵巢癌单链抗体噬菌体表面呈现文库的构建、初步筛选及鉴定
目的: 构建抗人卵巢癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现文库.方法: 利用噬菌体表面呈现技术,构建基因文库,经过panning筛选富集后,用ELISA方法检验抗原结合活性.结果: 从单个噬菌体克隆中筛选到26个具有抗原结合活性的阳性克隆.结论: 噬菌体表面呈现技术为构建抗人卵巢癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现文库提供了一条更为有效的新途径.
