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FKBP12/BAX双聚体诱导细胞凋亡模型的建立
目的建立FKBP12/BAX双聚体可诱导细胞凋亡生物效应的细胞模型,并利用阳性药物对其进行鉴定.方法RT-PCR扩增鼠源性BAX全长基因,插入pUC18载体进行测序鉴定.将鉴定正确的mBAX插入载体pC4FV1E中,构建pC4FV1E/BAX表达质粒.将表达质粒与pcDNA3.1共转染HEK293细胞,建立pC4FV1E/BAX-neo和neo基因稳定表达的细胞模型.利用形态学方法、流式细胞术等对化学药物诱导FKBP12/BAX双聚体介导的细胞凋亡进行定性及定量的分析.结果RT-PCR、Western blot法分别从mRNA及蛋白水平检测到FKBP12-mBAX融合基因的整合及表达;阳性化合物AP20187作用4～6 h后,Giemsa染色可见明显的凋亡小体;钙依赖核酸内切酶亦被激活,出现典型的"DNA ladder";天然产物FK506可竞争性地抑制这种阳性药物诱导的细胞凋亡.结论FKBP12/BAX双聚体可诱导细胞凋亡生物效应的细胞模型的建立,为FK506类小分子化合药物的高通量筛选提供可应用的技术平台.
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CD4拮抗类肽分子和非肽类小分子化合物筛选的细胞模型的建立
目的建立基于CD4分子和MHC Ⅱ类分子相互作用的细胞黏附模型. 方法 RT-PCR扩增人源性CD4胞浆缺陷型基因,克隆入绿色荧光表达载体pEGFP-N1中.将pEGFP-N1/CD4转染HEK293细胞,G418筛选稳定克隆.利用Western blot方法及激光共聚焦显微技术检测和观察细胞中CD4分子的表达及定位. 结果 RT-PCR、Western blot法分别从mRNA及蛋白水平检测到细胞中CD4分子的整合及表达;激光共聚焦显微镜观察到CD4分子于细胞核外周尤其是胞膜分布.HEK293/CD4稳定细胞克隆与Raji细胞孵育1*!h后,可见玫瑰花环的形成(rosette formation),而CD4抗体能够明显抑制这种玫瑰花环的形成. 结论 HEK293/CD4-Raji细胞黏附模型的建立,为CD4拮抗类肽分子和非肽类小分子化合物的筛选提供了一个可应用的技术平台.
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肝细胞生成素核受体的确定及特性
目的:肝细胞生成素(HPO)特异性刺激肝细胞增生的信号转导存在特异性核受体信号转导途径.方法:利用125I标记的HPO,通过受体结合和特异性竞争抑制实验及Scatchard分析原代培养大鼠肝细胞和肝癌细胞核抽提物中核受体.结果:原代培养大鼠肝细胞和肝癌细胞核抽提物中存在核受体,核受体数量分别为1.7×109/g、和5.0×109/g,平衡解离常数(Kd)分别为35 pmol及1 2 pmol,且存在数量上和亲和力的差异,此结合不能被EGF、生长激素和甲状腺激素所竞争抑制.HepG2细胞放射自显影显示HPO核受体的存在.结论:HPO促肝细胞增生作用可以通过肝细胞核受体介导.
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雷公藤抑制致敏小鼠T细胞IL-5 mRNA表达及GATA3活性
通过对致敏小鼠T细胞IL-5 mRNA表达和GATA3活性的观察，探讨雷公藤内酯醇（TP）对IL-5基因转录水平的调节机制，并与地塞米松（DM）的作用比较。 材料与方法（1）动物模型建立及分组：BALB/c小鼠24只，随机平均分为4组：正常对照组，以生理盐水代替卵蛋白（OVA）致敏和激发；致敏组，以OVA致敏和激发［1］；TP组，每次激发前1 h腹腔注射TP 40 μg/kg体重；DM组，每次激发前1 h腹腔注射DM 10 mg/kg体重。TP组与DM组后一次激发后24 h再给药1次。（2）原位杂交（ISH）：制备脾脏T细胞涂片。IL-5寡核苷酸探针序列：5′TCT CAA AGA ACC ACA TTA CTT GTG GCT CAC 3′。随机观察200个细胞，计数杂交阳性T细胞数。（3）凝胶电泳迁移率实验（EMSA）：BALB/c小鼠30只，随机分为正常对照组（5只）和致敏组（25只），致敏方法同上。Panning法［2］分离CD+4T细胞，用丝裂霉素C处理的B细胞作为抗原呈递细胞（APCs）。将CD+4T细胞分为4组：A组：正常对照组，即正常小鼠CD+4T细胞；另3组分别为将致敏小鼠CD+4T细胞随机分成的B组：刀豆蛋白A(ConA)刺激组，C组：TP组和D组：DM组。各组加入OVA至终浓度0.2 g/L、ConA至终浓度25 mg/L、1×107个APCs，相应组加入TP至终浓度10-4mol/L，DM至终浓度10-5mol/L。B组取0.5 h、1 h、2 h和4 h时相点，其余组取2 h时相点。GATA3寡核苷酸序列：P1 5′CCT CTA TCT GAT TGT TAG CA，P2 5′ TGC TAA CAA TCA GAT AGA GG，末端标记［γ-32P］ ATP。EMSA反应产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳3 h，-70℃放射自显影8 h。相同实验重复3次。（4）凝胶电泳迁移率竞争实验：特异性竞争抑制实验组：加入100倍和200倍未标记GATA3探针；非特异性竞争抑制实验组：加入200倍非特异性的其它未标记探针序列：P1 5′ATA AAA TTT TCC AAT GTA AA，P2 5′TTT ACA TTG GAA AAT TTT AT。
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纳络酮的临床应用
纳络酮(Naloxone,NX)是人工合成的阿片受体拮抗剂,化学结构与吗啡相似,对阿片受体的亲和力比吗啡大,可竞争抑制β内啡肽(β-EP)受体,直接逆转β-EP的不利作用,而不产生对心血管、呼吸的抑制作用.自20世纪60年代合成以来,至今在临床应用广泛.
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乙型肝炎病毒YMDD突变检测方法学比较
拉米夫定(lamivudine)是近年用于抗乙型肝炎病毒(HBV)治疗的主要药物之一,属于脱氧嘧啶核苷类药物,其与乙肝多聚酶结合后竞争抑制该酶活性,使HBV-DNA链合成终止,从而抑制病毒复制[1].但长期用药可引起HBV多聚酶活性区核苷酸序列的变异,称为YMDD变异.变异后的病毒对拉米夫定的敏感性下降,从而导致治疗失败.长期应用拉米夫定时,发生YMDD变异的比率逐年增加.目前检测HBV YMDD突变的检测方法多种多样,对临床常见的几种方法进行比较分析,以期选择适合临床开展的方法种类,从而提高临床对HBV YMDD突变的诊断水平及对乙型肝炎患者的临床治疗水平.
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小肠结肠炎耶尔森菌O∶3与O∶9混合培养竞争关系
目的 探讨相对等量混合培养情况下不同血清型(O:3、O:9)小肠结肠炎耶尔森菌菌株是否存在竞争关系.方法 将O:3、O:9菌株等量混合于100 mL Luria-Bertani(LB)培养液内作为实验组,另将O:3、O:9单独培养于100 mL LB培养液中作为对照组,28℃培养,每隔3h取各组菌液涂板进行菌落计数,并以O:3单克隆抗体鉴定各菌落血清型.结果 在混合培养条件下,O:3在生长峰值处的生长量均较单独培养时有所下降；在培养21、33、39 h时,O:3单独培养生长量分别是混合培养的4.40、5.81、4.79倍,在生长高峰阶段表现出明显抑制(P＜0.05)；混合培养对O:9生长量无明显影响；在生长速度方面,2种血清型在混合培养和单独培养条件下均未表现出明显差异.结论 混合培养时,O:3对O:9的生长量无明显抑制作用,但O:9对O:3具有一定抑制作用.
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磺胺二甲嘧啶竞争抑制ELISA法检测
磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine,SM2)作为一种广谱抗生素,普遍应用于医药(抗球虫药)、畜牧(作饲料添加剂以提高畜禽抗病力)以及水产养殖中(用于鱼、虾、蟹细菌性疾病),预防和治疗细菌感染性疾病[1].短时间大剂量或长时间小剂量的作用可引起急性或慢性中毒;能够诱发人的甲状腺癌和影响机体泌尿系统、免疫系统,破坏肌肉和肾脏等组织,并具有三致作用[2],是国家农业部继克伦特罗后规定进出口检测必检项目之一.
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竞争抑制ELISA法检测FPA
人纤白蛋白制品是我国研制的一类新药,由人血白蛋白微球表面包裹人血纤维蛋白原制成.纤维蛋白原可以与激活的血小板表面的GPIIb-IIIa结合,因此,输入患者体内的人纤白蛋白微球与激活的血小板聚集起来,有效止血,同时也在凝血过程中发挥积极作用.人纤白蛋白制品主要用于因血小板减少引起的凝血障碍,有较好的临床应用前景.
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用中和试验评价四种ELISA试剂盒检测抗-HBe结果的准确性
目的 用中和试验方法验证酶联免疫吸附试验(ELISA)竞争抑制法和中和竞争法检测血清乙型肝炎e抗体(抗-HBe)的性能.方法 竞争抑制法选择A、B试剂,中和竞争法选择C、D试剂检测抗-HBe;4种试剂结果明显差异的标本,用中和试验确认抗-HBe.结果 4种试剂检测随机血清标本455份,其中195份(42.85%)抗-HBe结果有差异.4种试剂检测抗-HBe总阳性数279份(61.32%),其中均阳性84份(30.11%).经中和试验确认,A、B、C试剂假阴性率为35.0%～72.5%;假阳性率为31.4%～77.1%.D试剂假阳性率为37.1%,假阴性率为5.0%.结论 ELISA一步法检测抗-HBe,4种试剂均存在一定比例的假阳性或假阴性,D试剂准确性明显优于A、B、C试剂.中和试验对于确认抗-HBe结果的准确性简便而实用.
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老年人药物性肝病
一、概述由于老年人有其自身的特点,容易发生药物性肝病.如老年人肝脏本身的重量、血流量、肝药酶活性等均随增龄降低,影响了药物在肝脏的浓度、转化和代谢;又如肝外因素,老年人常有肾功能不全、心排出量减少、药物蛋白结合减少、老年人体内水分减少而脂肪相对增加,凡此都影响着药物的作用和不良反应的发生.再加老年人常身患多种慢性病,以致常联合多种药物治疗,且又长期服药.据研究,药物在单一应用时不引起肝损,但联合用药时容易引起肝损害,因为有些药物需通过同一亚型药物酶来代谢,竞争抑制致使未代谢药物堆积引起肝损[1].又据研究,用药时间延长后,易引起代谢此药的代谢酶合成增加,以致药物代谢加速,往往原有药物剂量不能有效控制疾病,需要加大剂量而诱发肝损.基于以上特点,老年人的药物性肝病比中青年人多见.据报道因急性肝炎住院的成年病例,药物性肝病约占10%,而在老年人中其比例高达20%或以上[2].又据法国报道,在老年人中因急性肝炎人院的40%为药物性肝病[3],老年人的黄疸原因中20%为药物所致[4].因此老年人药物性肝病,受到大家关注.
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99Tcm-octreotide体外受体结合法及其结合特性研究
直接标记法制备99Tcm-octreotide 已获得成功［1］，但标记过程的化学处理有可能影响受体结合特性，因此，笔者进行了体外细胞膜放射受体分析研究，以便为临床受体显像提供实验依据。 一、材料与方法 1.膜受体结合方法学研究。99Tcm-octreotide纯化后放化纯为93.8%，放射性比活度649 TBq/mol［1］，采用Wistar大鼠脑皮质细胞膜进行体外受体结合分析，其制备方法参照文献［2］，有改进。细胞膜蛋白质质量浓度为0.32 g/L。按照体外放射受体分析的一般流程，首先进行大结合活性测定，取定量99Tcm-octreotide 5×10-7 mol/L，细胞膜量逐级增加，直到过量，进行结合反应，以滤膜放射性总结合TB（放射性计数）与加入99 Tcm-octreotide量T（放射性计数）的比值得大结合率，即为99Tcm-octreotide的大结合活性。其次以大结合率为标准，分别改变反应体系中温度、保温时间、细胞膜和标记肽用量、分离条件等相关因素，按照受体分析流程进行分离和测定，以确定细胞膜受体结合反应的佳条件。后通过观察同一细胞膜在同一次结合实验中的变异系数CV1（n=5组）和同一细胞膜在不同天进行结合实验的变异系数CV2（n=5次），研究佳结合反应条件的可重复性。非特异性结合（NSB）包括细胞膜组织本身的NSB(采用竞争抑制曲线法)和实验材料（滤膜、试管等）的NSB。 2.受体结合特性研究。①饱和实验：TB组测定，在系列试管中依次加入细胞膜60 μL，标记肽(1～10)×10-7 mol/L，级差1×10-7 mol/L。NSB组测定，在系列试管中除上述试剂外，每管还须加入octreotide 2 μg，使细胞膜受体特异性结合受到充分抑制。两组试管均用含0.5% BSA Tris缓冲液补足至200 μL，25 ℃保温90 min，快速通过滤膜终止结合反应，测滤膜放射性即为TB或NSB，后求得亲和常数KD和受体大结合容量Bmax。②竞争抑制实验：在系列试管中依次加入细胞膜60 μL，标记肽5×10-7 mol/L， 非标记肽量10-12～10-5mol/L，级差10-1 mol/L，在相同反应条件下结合并终止反应。③对照物99Tcm-oxytocin体外结合实验：参照上述方法进行。
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罗汉果甜苷V特异性抗血清的制备与应用
目的 制备罗汉果甜苷V(MogV)特异性抗血清,建立MogV含量竞争性抑制酶联免疫检测法.方法 用罗汉果甜苷V-丁二酸酯-牛血清蛋白(MogV-HS-BSA)结合比约为44∶1为免疫抗原制备抗血清,用罗汉果甜苷V-丁二酸酯-人血清蛋白(MogV-HS-HSA)结合比约为64∶1为包被抗原,建立MogV含量竞争性抑制酶联免疫检测法.结果 包被抗原工作浓度为1 μg·mL-1,血清佳稀释倍数为1∶8000,在此工作浓度下,MogV浓度在1×10-4～1 μg·mL-1内回归方程Y=-0.158X+0.298,r=0.9910.结论 成功制备了MogV抗血清,MogV浓度在1×10-4～1 μg·mL-1内对抗血清的OD(405 nm)值抑制作用呈良好的线性关系.
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盐酸纳络酮抢救5例急性海洛因中毒的护理
海洛因(二乙酰吗啡)属阿片类,进人人体后迅速转化为脑啡肽,通过血脑屏障,对中枢神经系统呈现出先兴奋后抑制的作用,重度中毒者出现昏迷,呼吸慢,针尖样瞳孔的三合症状,引起呼吸循环衰竭至死[1].纳络酮是人工合成的阿片受体拈抗剂,化学结构与吗啡相似,对阿片受体的亲和力比吗啡大,可竞争抑制内啡肽受体,直接逆转内啡肽的不利作用,而不产生对心血管、呼吸的抑制作用.
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纳络酮的临床应用及常见副作用
纳络酮(Naloxone,NX)是人工合成的阿片受体拮抗剂,化学结构与吗啡相似,对阿片受体的亲和力比吗啡大,可竞争抑制β内啡肽(β-EP)受体,直接逆转β-EP的不利作用,而不产生对心血管、呼吸的抑制作用.
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扩张性心肌病大鼠心脏左室内皮素受体及其亚型分析
目的:用放射配基分析法检测心肌细胞膜内皮素受体及其亚型,观察其在扩张性心肌病大鼠模型左室中的变化.方法:用[125I]-ET-1探索在大鼠心肌细胞膜中建立内皮素受体及其亚型的放射配基分析法的佳条件,并对扩张性心肌病大鼠左室内皮素受体及其亚型进行饱和结合试验.结果:①适孵育温度为37℃;0～30 min内[125I]-ET-1与内皮素受体的结合量迅速增加,60 min已达平衡;膜蛋白在0～40 μg时,[125I]-ET-1结合量与膜蛋白浓度呈直线关系.②ET-1及非选择性拮抗剂Bosentan、选择性拮抗剂BQ123、BQ788等均能竞争抑制[125I]-ET-1与内皮素受体的结合,而去甲肾上腺素则不能抑制.③正常大鼠左室内皮素受体数量为92.21±34.34 fmol/mg protein.Kd值为0.044±0.007 nmol,扩张性心肌病大鼠左心室内皮素受体数量明显减低,Kd值则无明显变化;内皮素受体亚型A和B的比例不论在正常还是在心肌病大鼠均接近2比1,无明显差异.结论:通过放射配基分析法用[125I]-ET-1可以特异地检测内皮素受体及其亚型,并且扩张性心肌病大鼠左室内皮素受体较正常SD大鼠明显降低,但A和B两种受体亚型的比例均无明显变化.
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高原低氧对大鼠中脑区神经肽的影响
目的:选用Wistar大鼠由平原直接接运至海拔2260 m, 3460 m高海拔环境.以放射免疫分析法研究了大鼠在高海拔急性低氧24 h和30 d慢性低氧期脑内中脑区β-内啡肽(β-EP)、加压素(AVP)、生长抑素(SS)含量的变化.方法:实验动物按完全随机法分组.实验方法以现场依次提取中脑内神经肽免疫活性物质.上述三种放免药盒由上海第二军医大学提供.用西安产FJ2003/50型γ计数仪测定沉淀物的counts.min-1,以同批实验所做的竞争抑制标准曲线,换算并求出每毫克脑组织中β-EP、AVP、SS的含量.结果:1.在2260 m、3460 m 24 h急性低氧期实验组与对照组相比较,β-EP、AVP、SS含量显著降低(P＜0.01).2. 在3460 m 30 d慢性低氧期出现时相性变化:(1)2～3 d:β-EP、持续增加(P＞0.05),AVP趋于增加(P＜0.05),SS则出现持续降低(P＜0.01),β-EP、与AVP呈正相关(r=0.596)、与SS呈负相关(r＝-0.842).(2)3～15 d:β-EP、AVP、SS呈进行性降低(P＜0.01).经相关分析,均为正相关(分别为Rβ-EP、AVP=0.586,RAVP、SS=0.734, Rβ-EP、SS=0.847).(3)15～30 d:β-EP、趋于回升(P＞0.05),AVP、SS则持续性减少(P＜0.01).经相关分析,AVP与SS呈正相关(r＝0.723).结论:大鼠在高原低氧环境中急性和慢性低氧期中枢内中脑区神经肽含量受到明显影响.在急性低氧期3种神经肽低于对照组,可能与脑细胞的合成、分泌受到低氧抑制有关,在慢性低氧期出现时相性变化可能与神经内分泌的调控作用有关.据此认为神经肽在低氧反应中可能具有重要的生物学意义.
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抗胃癌单克隆抗体识别的噬菌体呈现肽与天然抗原的关系
噬菌体呈现的随机肽库已成功地用于筛选B细胞或T细胞表位.为进一步研究胃癌相关抗原与相应单克隆抗体(mAb)结合的结构基序及其相互作用,我所通过两株胃癌mAbMG7和MGb2筛选噬菌体呈现的随机九肽库,获得一些可与mAb结合的噬菌体呈现肽.我们采用竞争抑制实验,研究了这些肽与天然胃癌相关抗原的关系.
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他汀类药物临床新应用进展
他汀类药物是HMG-COA还原酶抑制药,具有良好的降脂效果,其作用机制主要是通过竞争抑制HMC-COA还原酶,减少胆固醇生物合成.近年来许多国内外资料显示,他汀类药物对机体的保护作用远远超出了其降脂作用.
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抗体芯片竞争抑制法检测尿液中吗啡含量
目的 建立抗体芯片竞争抑制法检测尿液中吗啡含量的方法.方法 将吗啡单克隆抗体固定在用琼脂糖包被的芯片上,与含有吗啡的尿液检材和Cy3荧光标记-吗啡-BSA复合物进行竞争抑制反应,共聚焦扫描仪采集反应图像并进行分析.结果 吗啡单克隆抗体及Cy3-吗啡-BSA的佳浓度是31.25 μg/ml、12.50 μg/ml,检测线性范围0.01～10 ng/m.回收率在91.2%～109.2%之间,尿液检测限为0.02ng/ml.甲基苯丙胺、安非他明与吗啡抗体之间无交叉反应,与可待因有一定的交叉反应.结论 抗体芯片竞争抑制法检测尿液中的吗啡含量具有灵敏度高,特异性好、操作简单、高通量等优点,可用于法医毒物检测、戒毒效果监测.
