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反义IGF-Ⅰ寡核苷酸转染对人肝癌细胞生长的抑制作用
目的:利用反义核酸技术,研究体外胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)反义寡核苷酸转染对肝癌细胞增生、分化及凋亡的影响,探讨寡核苷酸转染治疗肝癌的可行性.方法:合成针对IGF-Ⅰ的寡核苷酸片段,利用脂质体包裹反义IGF-Ⅰ寡核苷酸片段瞬时转染人肝癌细胞系BEL-7402细胞,MTT法检测细胞增生;放免法检测培养细胞上清中AFP,CEA的分泌量;免疫组化法检测转染细胞AFP,PCNA表达的变化;采用末端标记(Tunel)法检测细胞凋亡的变化.结果:MTF法检测转染反义IGF-Ⅰ寡核苷酸的人肝癌细胞系BEL-7402A值由0.44±0.09下降为0.30±0.07(P<0.01),上清液AFP和CEA水平分别由12.5±2.2 μg/L和6.8±2.3μg/L下降为2.5±0.3μg/L和2.2±1.5μg/L(P<0.01,P<0.05),凋亡阳性细胞数由16.4±2.3%增加至23.1±3.7%(P<0.05).结论:反义IGF-Ⅰ寡核苷酸转染人肝癌细胞系BEL-7402细胞可以降低细胞增生,减少细胞去分化并诱导肝癌细胞凋亡.
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雷公藤抑制致敏小鼠T细胞IL-5 mRNA表达及GATA3活性
通过对致敏小鼠T细胞IL-5 mRNA表达和GATA3活性的观察,探讨雷公藤内酯醇(TP)对IL-5基因转录水平的调节机制,并与地塞米松(DM)的作用比较。 材料与方法(1)动物模型建立及分组:BALB/c小鼠24只,随机平均分为4组:正常对照组,以生理盐水代替卵蛋白(OVA)致敏和激发;致敏组,以OVA致敏和激发[1];TP组,每次激发前1 h腹腔注射TP 40 μg/kg体重;DM组,每次激发前1 h腹腔注射DM 10 mg/kg体重。TP组与DM组后一次激发后24 h再给药1次。(2)原位杂交(ISH):制备脾脏T细胞涂片。IL-5寡核苷酸探针序列:5′TCT CAA AGA ACC ACA TTA CTT GTG GCT CAC 3′。随机观察200个细胞,计数杂交阳性T细胞数。(3)凝胶电泳迁移率实验(EMSA):BALB/c小鼠30只,随机分为正常对照组(5只)和致敏组(25只),致敏方法同上。Panning法[2]分离CD+4T细胞,用丝裂霉素C处理的B细胞作为抗原呈递细胞(APCs)。将CD+4T细胞分为4组:A组:正常对照组,即正常小鼠CD+4T细胞;另3组分别为将致敏小鼠CD+4T细胞随机分成的B组:刀豆蛋白A(ConA)刺激组,C组:TP组和D组:DM组。各组加入OVA至终浓度0.2 g/L、ConA至终浓度25 mg/L、1×107个APCs,相应组加入TP至终浓度10-4mol/L,DM至终浓度10-5mol/L。B组取0.5 h、1 h、2 h和4 h时相点,其余组取2 h时相点。GATA3寡核苷酸序列:P1 5′CCT CTA TCT GAT TGT TAG CA,P2 5′ TGC TAA CAA TCA GAT AGA GG,末端标记[γ-32P] ATP。EMSA反应产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳3 h,-70℃放射自显影8 h。相同实验重复3次。(4)凝胶电泳迁移率竞争实验:特异性竞争抑制实验组:加入100倍和200倍未标记GATA3探针;非特异性竞争抑制实验组:加入200倍非特异性的其它未标记探针序列:P1 5′ATA AAA TTT TCC AAT GTA AA,P2 5′TTT ACA TTG GAA AAT TTT AT。
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干扰素治疗增生性瘢痕的机制
增生性瘢痕的产生与成纤维细胞的增殖过度有关.干扰素α-2b(IFNα-2b)局部注射治疗瘢痕有一定疗效[1-3].为探讨INFα-2b治疗瘢痕的机制,我们应用末端标记、原位杂交以及免疫组化的方法,对局部注射IFNα-2b后增生性瘢痕成纤维细胞(FB)进行了细胞凋亡及相关基因Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因、PDGF-BB基因、c-myc和p53基因以及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的研究,旨在进一步明确INFα-2b治疗瘢痕的机制.
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顺铂诱导人肝癌细胞凋亡机理研究
顺铂是多种化疗方案的核心药物,在对人卵巢癌细胞和大鼠肝癌细胞的研究中,发现其具有诱导凋亡的作用.本实验从细胞形态、DNA裂解片段、细胞周期、DNA断裂点末端标记,凋亡相关基因观察顺铂诱导人肝癌细胞凋亡的作用机理.
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睾酮类避孕药对大鼠生精细胞凋亡的影响
目的:研究睾酮类避孕药丙酸睾丸酮对大鼠生精细胞凋亡的影响及其机制.方法:30只35日龄雄性SD大鼠,随机分为实验组和对照组,每组15只.实验组每天肌内注射内酸睾丸酮40 mg/kg,对照组注射生理盐水.于大鼠出生第50天取血,并处死大鼠切取双侧睾丸.应用原位末端标记检测、流式细胞测定(FCM)、电镜及放射免疫等技术,对大鼠睾丸生精细胞的凋亡进行定性、定位和定量研究.结果:与对照组相比,实验组大鼠睾丸生精细胞凋亡数量增多,主要为初级精母细胞;实验组、对照组大鼠生殖细胞凋亡率分别为(11.3±0.9)%和(3.6±2.3)%,1C峰细胞的百分比分别为(21.8±7.1)%和(33.8±7.5)%,2C峰细胞的百分比分别为(52.6±8.2)%和(37.1±12.5)%,差别均有统计学意义(P<0.01).实验组和对照组大鼠血清中睾酮水平分别为(3486.8±333.3)ns/L和(846.9±167.5)ng/L,卵泡刺激素水平分别为(2.5±0.8)IU/L和(5.2±1.7)IU/L.差别均有统计学意义(P<0.01).结论:外源性丙酸睾丸酮可能通过反馈性抑制垂体性腺轴而诱导生精细胞凋亡,发挥其避孕的作用.
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补阳还五汤对脑缺血再灌注损伤大鼠神经元凋亡的影响
目的:研究补阳还五汤对脑缺血再灌注损伤大鼠神经元凋亡的影响.方法:利用末端标记法,测定补阳还五汤干预后,脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中神经元的凋亡情况.结果:补阳还五汤能明显降低神经元凋亡百分率,减轻病理损害.结论:补阳还五汤可显著抑制由缺血再灌注诱导的脑神经元凋亡,从而起到一定程度的神经保护作用.
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p27蛋白表达与结肠癌细胞增殖和凋亡的关系
以29例结肠癌标本为研究对象,同时以18例正常结肠及30例溃疡性结肠炎标本为对照。用免疫组化(SABC)法检测其增殖细胞核抗原(PCNA)、p27蛋白的表达,用DNA片段末端标记(TUNEL)法检测其凋亡,探讨p27蛋白这一细胞增殖负调控因子在结肠癌生长机制中的意义[1]。
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5-氟尿嘧啶诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡及其机制研究
目的研究5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)体外诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡作用,及细胞凋亡与Ki-67抗原、核增殖抗原(PCNA)、P53蛋白、Bax蛋白、死亡受体Fas表达的关系.探讨5-FU诱导胃癌细胞凋亡作用的机制.方法应用流式细胞仪和3'-OH末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞,电镜观察凋亡细胞的形态改变,免疫组织化学法检测细胞Ki-67、PCNA、P53、Bax和Fas表达.结果 SGC-7901细胞经5-FU诱导后,凋亡指数(DI)明显增加,且具有剂量、时间依赖性.实验组细胞Ki-67、PCNA表达明显低于对照组,伴Bax表达,而P53、Fas则在诱导前后均无表达.结论 5-FU具有诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡及抑制细胞增殖作用.5-FU诱导SGC-7901细胞可能是通过P53非依赖途径.
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人胎儿卵泡形成过程中卵细胞的凋亡
目的:研究人胎儿卵泡形成过程中卵细胞凋亡及其意义.方法:收集13例水囊引产胎儿(20~38孕周)的卵巢组织,其中孕中期(20~28孕周)7例、孕晚期(29~38孕周)6例.利用电镜和末端标记法(TUNEL)观察胎儿卵泡形成过程中卵细胞凋亡的发生.结果:部分卵细胞超微结构改变呈现细胞凋亡的特征:早期表现主要有染色质凝集趋边、核周间隙扩张;进一步发展出现胞浆空泡化、胞浆内凋亡小体和自噬体形成、线粒体嵴脱失等.另外,凋亡早期卵细胞内线粒体比正常卵细胞明显减少.末端标记见到阳性细胞(凋亡卵细胞),孕中期卵细胞凋亡指数(9.8±1.2)%明显高于孕晚期凋亡指数(3.1±1.0)%,P<0.01.结论:人胎儿卵泡形成过程中卵细胞发生凋亡,由此导致生殖细胞大量丢失.
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过氧化氢通过线粒体通路和死亡受体通路诱导心肌细胞凋亡
为探讨氧化应激诱导心肌细胞凋亡的分子机制,采用0.5 mmol/L过氧化氢作用于原代培养的新生大鼠心肌细胞.末端标记发现过氧化氢明显诱导心肌细胞凋亡;Caspase活性定量检测及Western-blot发现Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9同时被激活;而Western-blot及间接免疫荧光发现细胞色素C从线粒体释放入胞浆.以上结果提示,氧化应激通过同时激活线粒体通路与死亡受体通路导致心肌细胞凋亡,从而为临床防治与细胞凋亡相关的心血管疾病提供了新的信息.
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A20基因真核表达载体的构建及抑制内皮细胞组织因子(TF)表达的研究
本研究旨在克降人A20基因与真核表达载体进行连接,并对其在内皮细胞的表达及功能进行研究.方法:将N-末端标记E-tag的人A20cDNA与穿梭质粒pCAGG S进行连接后得到重组表达质粒pCAGGSEhA20,将pCAGGSEhA20用脂质体包裹转染培养的人脐静脉内皮细胞,同时转染pCAGGS空载体进行对照;G418加压筛选重组细胞克隆.随机挑选pCAGGSEhA20转染的内皮细胞5株,调整为1000 0/ml,用鼠抗人E-tag抗体进行免疫荧光染色.转染pCAGGSEhA20阳性的内皮细胞及pCAGGS空载体转染对照细胞调整为10000/ml,每孔加200μ l,加LPS致终浓度为(100ng/ml),作用4小时后细胞固定,用anti-T F抗体进行免疫荧光染色及行TF原位杂交,图象分析相应的参数.结果:重组表达质粒p CAGGSEhA20酶切鉴定证实含有人A20cDNA,将pCAGGSEhA20和 pCAGGS转染的内皮细胞随机挑选G418抗性克隆数个,用抗E-tag抗体染色后 ,FACS检测其A20基因的表达情况,结果显示大多数克隆均有不同程度的表达,表达率为90%以上,选取高表达克隆扩增传代.LPS作用后表达A20基因的阳性细胞TF 仅有微弱表达或不表达,而对照细胞TF表达呈强阳性.结论:组织因子是炎症内皮细胞表达的细胞因子,在血栓形成中起重要作用.本实验表明A20基因能抑制LPS所致炎症内皮细胞表达TF,从而抑制血栓形成,在血栓预防和治疗中有重要作用.