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组织细胞固定保护液在AKP组化染色中的应用
传统的碱性磷酸酶(AKP)组织化学染色法,染色前多采用10%福尔马林-钙液及丙酮等固定液在4℃冰箱内对组织进行处理后,再进行冷冻制片或低温石蜡包埋切片.在实际应用过程中,我们发现经这些方法处理的组织,染色后酶活性明显降低且定位不佳.我们在酶染色前改用自行研制的组织细胞固定保护液(tissue cell fix protection solution,TCFPS)对组织进行前期处理,可收到理想染色效果.
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微阵列抗体捕获技术在脑脊液恶性肿瘤细胞中的应用
微阵列抗体捕获技术是以活细胞作为研究对象的一种生物芯片技术,它是适应后基因时代人类对生命科学探索的要求而产生的[1]。作为细胞研究领域的一种新技术,其既保持传统的细胞研究方法的优点,又满足了高通量获取活细胞信息等方面的要求[2]。为了更好地将科技应用于临床实践,我们在日常工作中设计了一种新型微阵列抗体捕获芯片,其原理是应用细胞膜表面的不同抗原物质与结合在玻片上的不同抗体发生特异性结合,通过自动捕获将所获目的细胞固定在特定区域,以此对脑脊液中恶性肿瘤细胞进行诊断和鉴别诊断。
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绿色荧光蛋白细胞的保存及细胞周期分析
目的 探讨在绿色荧光蛋白(GFP)质粒转染后的细胞中,既能大限度地保存GFP阳性细胞又有利于细胞周期分析的固定方法.方法 以胃癌MKN-28和乳腺癌MCF-7细胞为模型,脂质体Lipofectamine2000转染细胞,转染后的细胞分别用:①80%乙醇固定;②0.1%、0.25%、0.5%和1.0%的多聚甲醛固定;③0.1 0,4、0.25%、0.5%、1.0%多聚甲醛4℃固定30 min后再用80%乙醇固定等3种方法固定细胞,然后用含0.1%triton的PI染色,在流式细胞仪上检测GFP的自发绿色荧光及行细胞周期分析.结果 单纯乙醇固定的细胞中GFP均消失.单纯0.25%~1.0%的多聚甲醛固定后的细胞不能得到有效的DNA直方图,单纯0.1%的甲醛固定的细胞虽可得到良好的直方图,但PI染液中的triton破坏了大部分的GFP.先甲醛再乙醇固定的细胞中,0.5%~1.0%的甲醛可较好地防止乙醇和triton对绿色荧光蛋白的破坏作用,保留下2/3的GFP阳性细胞,0.5%的甲醛固定的细胞可得到CV值<8%的G0/G1期峰,而1.0%甲醛固定后的细胞CV值>8%.结论 在GFP质粒转染后的细胞中,先用0.5%的多聚甲醛固定细胞30 min后再用乙醇固定,既能大限度地保存GFP,又可得到CV值良好的DNA直方图.若不考虑保留GFP,或普通细胞作细胞周期分析时,单纯0.1%的多聚甲醛固定细胞,即可得到与传统的单纯乙醇固定细胞相似的CV值很小的DNA直方图.
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A20基因真核表达载体的构建及抑制内皮细胞组织因子(TF)表达的研究
本研究旨在克降人A20基因与真核表达载体进行连接,并对其在内皮细胞的表达及功能进行研究.方法:将N-末端标记E-tag的人A20cDNA与穿梭质粒pCAGG S进行连接后得到重组表达质粒pCAGGSEhA20,将pCAGGSEhA20用脂质体包裹转染培养的人脐静脉内皮细胞,同时转染pCAGGS空载体进行对照;G418加压筛选重组细胞克隆.随机挑选pCAGGSEhA20转染的内皮细胞5株,调整为1000 0/ml,用鼠抗人E-tag抗体进行免疫荧光染色.转染pCAGGSEhA20阳性的内皮细胞及pCAGGS空载体转染对照细胞调整为10000/ml,每孔加200μ l,加LPS致终浓度为(100ng/ml),作用4小时后细胞固定,用anti-T F抗体进行免疫荧光染色及行TF原位杂交,图象分析相应的参数.结果:重组表达质粒p CAGGSEhA20酶切鉴定证实含有人A20cDNA,将pCAGGSEhA20和 pCAGGS转染的内皮细胞随机挑选G418抗性克隆数个,用抗E-tag抗体染色后 ,FACS检测其A20基因的表达情况,结果显示大多数克隆均有不同程度的表达,表达率为90%以上,选取高表达克隆扩增传代.LPS作用后表达A20基因的阳性细胞TF 仅有微弱表达或不表达,而对照细胞TF表达呈强阳性.结论:组织因子是炎症内皮细胞表达的细胞因子,在血栓形成中起重要作用.本实验表明A20基因能抑制LPS所致炎症内皮细胞表达TF,从而抑制血栓形成,在血栓预防和治疗中有重要作用.
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潘氏细胞固定和染色法探讨
潘氏细胞位于小肠腺基底部,细胞呈锥形,核园或卵园,细胞内有粗大嗜酸性颗粒,细胞常三、五成群的存在于细胞底部. 经电镜观察,细胞有胞膜,粗面内质网较多,高尔基复合体较大.分泌颗粒内含有糖蛋白、粘多糖(PAS阳性)、精氨酸、锌及溶菌酶.潘氏细胞来源尚不清楚,未见细胞分裂相,也有学者认为细胞分泌多肽酶.根据我们多次实验观察,当动物饥饿时潘氏细胞颗粒明显集聚 ,摄取食物后细胞颗粒释放而消失.潘氏细胞易被酸性染料着色,如:伊红、藻红、酸性复红、丽春红、荧光桃红-酒石黄、焰红、玫瑰红、PAS、Best卡红等,颜色美丽鲜艳.技术书上有一种Lendrum氏荧光桃红-酒石黄染色方法,我们不用酒石黄,染出的潘氏细胞同样鲜艳,具体方法为:①取材:人十二指肠,福尔马林盐固定,常规石蜡切片.②切片移至水洗.③淡染苏木素.④流水洗至变蓝.⑤用0.5%荧光桃红氯化钙液在染色杯内染30min(配方:0.5g荧光桃红溶于100ml 0.5%的氯化钙中).⑥水洗,置室温下几乎将干.⑦用95%酒精浸洗.⑧脱水透明,常规封固.镜下观察,潘氏细胞又鲜又艳.体会:几十年来我们曾经看到过人、猴、小鼠小肠腺底部的潘氏细胞,而未发现狗、猫、荷兰猪及其它动物内存在较完整的潘氏细胞.是固定液的因素还是动物种属原因有待进一步的探讨.经多种固定液选择,经中性甲醛盐固定的效果佳,含有重铬酸钾的固定液效果较好 ,而Bouin氏固定液、AAF、Carnoy等固定液细胞易被破坏,不含醋酸固定液保存细胞颗粒良好.我们将进一步采取不同动物、不同固定液以及饥饿状态下和饱食状态下对潘氏细胞进行进一步的探讨.
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临床积液细胞学快速筛检
临床细胞学检查一般采用各种染色法(Hematoxylin-Eosin、Giemsa、免疫细胞化学等),它们的共同点是将细胞固定、染色后进行观察,准确可靠,但周期较长,特别是疑难细胞涂片往往染色后才能得知结果,诊断周期更长.近年来我们对积液细胞涂片未染色直接观察,发现对积液细胞学筛检尤其是腺癌的快速诊断颇有应用价值,现报道如下.
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免疫组化细胞标本的固定方法
用细胞涂片进行免疫组化反应常有细胞脱落现象.这是大多数实验者所面临的一个难题.本文介绍一种细胞涂片固定法以用于免疫组化反应.
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丫啶橙荧光染色结膜印迹细胞检查法
眼部印迹细胞检查是一种采用醋酸纤维素滤纸或生物孔膜获取结、角膜表层细胞标本的一种检查法[1].在判断结膜细胞功能状态方面,目前多采用醋酸纤维素滤纸,采取不同部位的结膜细胞固定后,经过碘酸雪夫氏(PAS)染色及苏木素染色,光学显微镜下观察.该方法所用试剂品种较多,染色步骤繁多,染色用时较长,一张片子大约需1 h左右,才能出结果.我们在查阅大量文献的基础上,根据既往细胞染色的经验,采用一种透明纤维素滤膜取材,建立了丫啶橙荧光染色法进行结膜印迹细胞学检查,取得了满意的效果,现报告如下.