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不脱钙骨超薄切片的制备
对于骨折和骨病的深入研究,要求建立不脱钙骨超薄切片技术。在超微结构水平观察骨组织内钙盐的沉积、构筑及其变化,有助于阐明骨病、骨吸收和骨修复过程中,钙盐的代谢活动;运用脱钙骨制备的标本,不能提供相应的资料。1 材料和方法1.1 动物和取材 试验用成年雄性Wistar大鼠,在戊巴比妥钠腹腔麻醉下,迅速取出股骨头、股骨颈和腰椎椎体。1.2 依次按以下步骤制备超薄切片:(1)立即投入2%多聚甲醛-3%戊二醛溶液内固定2小时,4℃;(2)4℃0.1M磷酸缓冲液冲洗2小时;(3)4℃1%锇酸溶液后固定2小时;(4)梯度丙酮脱水;(5)浸渗Spurr:用丙酮-Spurr混合液分3步浸渗,每步2小时。丙酮:Spurr的比例依次为3∶1,1∶1和1∶3;(6)Spurr包埋液包埋;(7)LKB-V超薄切片机和钻石刀切片,厚度500埃;(8)醋酸铀-枸橼酸铅双重复染。
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两种不同缓冲系统的多聚甲醛对鼠脑组化结果的影响
哺乳动物大脑皮质的发育长期以来都是发育生物学研究的焦点和热点.目前用于研究大脑发育的组织化学技术主要有原位杂交技术和免疫荧光染色,而这些技术均需要前期的标本制备,尤其是取材后的组织固定.组织固定的主要目的是尽可能保持组织内待检测物的原位性、完整性和免疫活性[1],所以组织固定的效果往往决定着组化实验终结果的成败.4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)因其优良的理化性质成为目前固定标本组织的常用固定剂之一[2-3],而关于其配制方法,尤其是用于溶解它的溶剂的选择目前还未有定论.本研究以此问题为出发点,比较不同溶剂的4%PFA对鼠脑组织的固定效果,探讨佳的组织固定方法.
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木瓜蛋白酶致大鼠肺气肿中碱性成纤维细胞生长因子mRNA的表达
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种具有促进细胞生长增殖作用的多肽类生长因子,在维持机体的生长发育及促进多种组织的损伤修复中起着十分重要的作用。我们通过对木瓜蛋白酶(Papain)致大鼠肺气肿模型肺组织和肺泡巨噬细胞bFGF mRNA表达的研究,来探讨其在肺气肿形成过程中与肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原增长的关系。 材料与方法(1)肺气肿动物模型的制备与分组:健康Wistar大鼠42只,体重200~250 g,雌雄不拘(由同济医科大学实验动物中心提供),随机分为肺气肿模型1,3,5,7,15,30天组和正常对照组,每组6只。以2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉动物后,实验组气管内注射8%木瓜蛋白酶(美国Sigma公司)0.05 ml/100 g,对照组以同样方法注入相应量的生理盐水。(2)组织细胞标本制作:以2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后,行气管插管,向肺内灌注生理盐水,每次5~10 ml,共8次,回收支气管肺泡灌洗液,离心,弃上清,同法用RPMI1640(美国Gibco产品)培养液洗涤细胞1次,用含10%新生小牛血清(Gibco产品)的RPMI1640调细胞浓度至1×106/ml,加入铺有盖玻片的6孔培养板中,置37℃,5% CO2培养箱(Hera Cell德国产)培养24 h后,肺泡巨噬细胞贴壁,取出长有细胞的盖玻片,用4%多聚甲醛固定20~30 min,再用酒精梯度脱水后,置-70℃冰箱保存备用。灌洗肺后取下双肺,向肺内注入4%多聚甲醛,直至肺膨胀边缘变锐、胸膜展平,结扎气管,浸泡于4%多聚甲醛中固定10 h。取左下肺叶常规石蜡包埋、切片、HE染色。(3)免疫组织化学染色:用即用型链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(Strept Avidin-Biotin-enzyme Complex,SABC)免疫组织化学染色试剂盒和兔抗鼠collagen Ⅰ及collagen Ⅲ多克隆抗体及DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)进行免疫组织化学染色。(4)bFGFmRNA原位杂交:用bFGF寡核苷酸探针和敏感加强型原位杂交检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)对组织细胞标本原位杂交。
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颅脑损伤后转移生长因子β1表达的研究
一、材料与方法1.研究对象:大鼠70只,随机分为对照组、伤后30min、1h、6h、24h、48h、168h等7组.2.研究方法:采用改进后Feeney's自由落体装置造成大鼠脑创伤模型.对照组不做处理.大鼠颅脑损伤后于相应观测时间点进行镧醛固定液灌注,取大鼠损伤区组织块,对照组取材部位同脑创伤,电镜观察血脑屏障变化.大鼠颅脑损伤后于相应观测时间点采用含有4%多聚甲醛的磷酸缓冲液原位灌注固定,取损伤区脑组织,免疫组织化学染色观察.
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体外培养小鼠睾丸间质细胞的形态学特征
本研究初步观察了睾丸间质细胞体外培养的形态学特征,以期为深入研究其分泌睾酮的影响因素奠定基础.方法为无菌取成年雄性昆明小白鼠的双侧睾丸,置于盛有适量PBS的培养皿中;用尖镊撕去附睾及白膜,用吸管吹打至曲细精管与间质组织分散;加入10倍体积的胶原酶,37℃下消化10~15 min后移入10 mL离心管,待曲细精管及间质组织沉降后移出上层细胞悬液;取一滴细胞悬液,加入适量台盼蓝混匀后用红细胞记数板计算细胞数目,调整细胞密度至3×105个/mL;将细胞接种在直径35 mm的塑料培养皿中,常规条件下培养;当细胞开始贴壁时,小心吸去旧液,加入新鲜培养液(D-MEM+10%小牛血清+1%双抗+1%谷氨酰胺)培养,定时观察;当培养细胞80%汇合时,弃去培养液,用PBS缓冲4%多聚甲醛室温固定1 h,PBS洗2次;用异丙醇油红法略加改进后进行脂质染色,苏木精复染;另用95%乙醇和PBS缓冲4%多聚甲醛(9∶1)室温下固定细胞40 min,PBS洗2次,1.4%甲基蓝染色后进行观察.本实验每次所获细胞悬液量均为3 mL,细胞密度为1.76×106个/mL,平均每侧睾丸可获间质细胞5.28×106个,其中活细胞、死细胞的平均百分比分别为88.94%、12.06%.在体外,间质细胞贴壁性状良好,不需特殊粘附分子.接种后一般8~10 h后即发生极化,胞质铺展,伸出突起.培养约14~15 h后即开始贴壁.镜见贴壁细胞透明,基本无颗粒,轮廊不清,增殖的细胞相互连接成单层膜状.细胞化学:甲基蓝染色显示,间质细胞核呈圆形或卵圆形,嗜碱性,位于胞质中央;核仁1~2个,清晰可见,一般位于核的边缘部;其胞质轮廊为多角形,一般有3~4个突起,遥抟中可见有多量大小不一的空泡状结构.油红O脂质染色显示,这些空泡状结构为脂质小滴,呈红色或红褐色,大小不一,圆形悬浮状存在,聚集于胞质两极或散布于核的四周.本实验结果表明,间质细胞胞质中存在大量脂滴,推测这些脂质是为其雄激素分泌功能提供必备前体物质而存在的.
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大脑中动脉栓塞再灌注鼠脑一氧化氮合酶活性变化及地塞米松的治疗效应
1.2 标本制备: 1.2.1 四氮唑(TTC)染色:大鼠断头取脑,经前联合冠状切片,厚约2 mm,浸入2% TTC液中置于37 ℃孵箱孵育60分钟,取出置于4%多聚甲醛中固定,TTC染色观察。 1.2.2 脑组织含水量:采用干湿重法: 含水量(%)=(1-干重/湿重)×100%。
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2%戊二醛制剂治疗成人早期牙髓病87例临床观察
目的 观察运用2%戊二醛制剂治疗成人早期牙髓病的临床疗效.方法 严格按照制定的纳入标准选择成人早期牙髓病患者87例,将2%戊二醛制剂取代多聚甲醛制剂应用于成人早期牙髓病.术后随访1~2年,观察患者治疗后的全身反应、主观症状和对治疗效果、治疗周期及治疗费用的满意程度.结果 ①87例患者均未出现全身不良反应.②81例未出现主观冷热刺激及自发性疼痛症状、检查未见牙折及根尖炎,总有效率为93%,其中6例1~1.5年内转为根尖炎,占总人数的7%.③满意率调查结果,87例患者中,81例患者对治疗效果、治疗周期及治疗费都感到满意,满意率为93%.结论 应用2%戊二醛氧化锌糊剂进行早期牙髓炎的治疗,可以有效的控制炎症,更多的保护健康的牙体组织且操作简便,减少患者复诊次数,降低患者的治疗费用和痛苦,有利于延长牙齿的寿命,值得研究和推广.
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氮酮多聚甲醛致牙龈严重烧伤
1 病例资料 女,40岁.因右下后牙自发性疼痛3天就诊.专科检查:64 远中邻面深龋,探痛(+),冷热刺激痛(+),叩痛(-);牙龈未见异常.初步诊断为慢性牙髓炎.治疗:去龋,做Ⅱ类洞,暴露穿髓点,将氮酮多聚甲醛失活剂放入洞中,氧化锌丁香油水门汀封固,预约1周后复诊.复诊时患者疼痛无缓解,有咬物不适感.
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多聚甲醛用于牙髓失活疗效观察
牙髓失活是治疗各类不可复性牙髓炎的初始步骤之一,而封失活剂又是使牙髓失活的常用方法,但常规失活剂三氧化二砷封药后疼痛发生率较高,患者较为痛苦.近几年,我们在传统失活法的基础上,应用多聚甲醛代替三氧化二砷减压失活取得了较为满意的效果.报告如下.
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巨噬细胞在榄香烯复合瘤苗对HCa-F的免疫效应中的作用
目的:研究巨噬细胞(Mφ)在榄香烯复合瘤苗(EC-TCV)对小鼠肝癌HCa-F的免疫保护效应中的应用.方法:榄香烯复合瘤苗主动免疫3次,体内用多聚甲醛固定的HCa-F致敏后3d检测腹腔巨噬细胞(Mφ)的抗肿瘤细胞毒活性、一氧化氮(NO)、细胞增殖活性的功能变化.结果:与对照组比较,腹腔巨噬细胞(PEMφ)对HCa-F的细胞毒活性增强,而在NO产生和细胞增殖方面无明显差异.结论:榄香烯复合瘤苗腹腔免疫可增强腹腔巨噬细胞的杀瘤活性.
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干髓术远期临床疗效观察评价
干髓术用于牙髓病的治疗,已有一百余年的历史.由于砷剂和多聚甲醛制剂的毒性、致抗原性和致癌活性,一些国家和地区已拼弃此法,但尚未见到否定干髓术的确切证据[1].近年来有实验报道,对干髓术后的根尖组织反应提出质疑[2],临床研究对干髓术后远期出的问题也有所涉及[3].
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盐酸曲马多的合成
盐酸曲马多,化学名为(±)-E-2-[(二甲氨基)甲基]-1-(3-甲氨基苯基)环己醇盐酸盐,本品为中枢镇痛药,适用于中度、轻度癌症疼痛[1],各种手术后疼痛以及口腔疾患所致的疼痛,也用于产妇疼痛,无呼吸抑制和心血管副作用,无耐受性,只有很弱的依赖性,其镇痛作用优于多数非阿片类药物,毒性低于吗啡和度冷丁,是较理想的镇痛新药[2].
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一种显示尼氏体的简单方法
我们在科研工作中摸索出一种显示尼氏体的简单方法,对采用4%多聚甲醛(用10%甲醛或95%乙醇固定均可)固定的鸡胚背根节细胞悬液的涂片,用苏木精染色,清晰地显示了神经细胞浆内的嗜碱性物质-尼氏体.
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NOS阳性细胞在大鼠和小鼠睾丸内分布的比较
1 材料和方法选用雄性Waster大鼠8只,体重210±10 g,雄性昆明小鼠8只,体重22.1±2 g.4%水合氯醛(60 mg/kg)腹膜腔麻醉,经左心室灌注0.9%NaCl冲洗血液,4%多聚甲醛(2500 ml/kg)固定,取睾丸,后固定8 h,30%蔗糖过夜(4℃).液氮速冻后进行冰冻冠状切片,片厚30μm,裱于铬钒明胶片上.应用改进NADPH-d黄递酶组织化学方法进行NOS组织化学反应,常规脱水、透明、封片,光镜观察,每只动物随机选取10个高倍视野,将10个高倍视野的细胞数之和除以10,做为该只动物的NOS阳性细胞数,进行t检验.
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雀鹰舌肌的神经支配
鸟类的鸣叫发自气管与支气管交界处的特殊装置一鸣管。但需要舌的配合才能发出变化多样的鸣声。本文研究雀鹰(Accipiter nisus)舌肌的神经支配。1 材料和方法 用成年雀鹰5只,体重170~250克,雌雄不拘。经25%乌拉坦腹腔麻醉(1 g/kg),将CB-HRP溶液(中国医学科学院提供)0.5 μl分别注入一侧舌尖或舌体,动物存活48 h,麻醉后经颈动脉相继灌注;(1)生理盐水200 ml;(2)固定液(1%多聚甲醛,1.25%戊二醛,0.1 mol/L磷酸缓冲液)200~250 ml;(3)10%蔗糖磷酸缓冲液200 ml。立即取脑和舌,置入30%蔗糖磷酸缓冲液中过夜(4℃)。脑作冰冻冠状连续切片,舌作矢状或冠状切片,片厚均为40μm,TMB呈色反应,中性红复染,明视野观察。2 结果 雀鹰核团的划分和命名,参照家鸽脑定位图谱和作者以往的工作,其舌下神经核位于延髓上腹部,内侧纵束的外侧,核团呈椭圆形或不规则形。
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胰岛素对糖尿病大鼠海马病变的预防研究
选择与学习记忆密切相关的神经结构——大脑海马部位为研究对象,从普通光镜、透射电镜以及一氧化氮合酶(NOS)阳性细胞、乙酰胆碱酯酶(AchE)阳性纤维表达等方面观察胰岛素治疗对较长病程糖尿病大鼠脑病变的防治作用。 一、材料和方法 1.动物模型制备:6周龄SD大鼠,体重(250±30)g,腹腔注射2%链脲佐菌素(STZ)55 mg/kg,一周后尾静脉血糖大于16.7 mmol/L者作为糖尿病模型鼠〔1〕。正常对照组(N组10只);成模大鼠分2组:糖尿病组(D组10只);糖尿病治疗组(T组10只,皮 下注射鱼精蛋白锌胰岛素 2~3 U/日,保持空腹血糖<10 mmol/L)。分别于成模第3个月和第6个月末, 灌注2%多聚甲醛、 1.25%戊二醛固定取脑
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细胞间直接接触诱导BMSC软骨分化的初步研究
目的 探讨细胞间直接接触是否能够单独诱导骨髓基质干细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSC)软骨分化.方法 体外培养扩增猪BMSC与关节软骨细胞,将1.0×106的细胞总量以2 000 r/min离心8 min,制成细胞团块,即Pellet培养.实验分为5组,实验组:经0.5%多聚甲醛固定的软骨细胞与BMSC以1∶1混合;对照组1:同等数量的未经多聚甲醛固定的软骨细胞与BMSC 1∶1共培养制成Pellet;对照组2:同等数量的单纯软骨细胞制成Pellet;对照组3:同等数量的单纯BMSC制成Pellet;对照组4:同等数量的单纯经多聚甲醛固定的软骨细胞制成Pellet.每3天换液一次,每组3例.培养4周后,以大体观察、组织学、免疫组织化学、RT-PCR等方法对Pellet进行全面评价.结果 培养4周后,实验组形成的Pellet,明显缩小,形状略不规则,颜色灰暗,柔软且没有弹性,组织学检测提示主要为纤维性成分及死细胞样结构,Safranin O染色及Ⅱ型胶原免疫组化均为阴性,RT-PCR检测未表达Ⅱ型胶原.对照组1和对照组2均形成圆盘状组织块,表面光滑,触之有一定弹性,组织学检测软骨陷窝形态规则,Safranin O染色及Ⅱ型胶原免疫组化均有阳性表达,RT-PCR检测Ⅱ型胶原高表达.对照组3的组织块明显收缩,呈褐色,无弹性.对照组4,细胞松散,不能形成Pellet.对照组3和4的各种软骨特异性相关检测均为阴性.结论 细胞间直接接触不能够单独诱导BMSC向软骨分化,不是软骨细胞与BMSC混合共培养中发挥诱导作用的主要因素.
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托品酸的制备
托品酸(tropic acid,3-羟基-2-苯丙酸,1)是山莨菪碱(anisodamine)和托吡卡胺(tropicamide)的重要中间体.可由苯乙酸甲酯(2)和甲酸乙酯在醇钠作用下缩合得到的α-甲酰基苯乙酸甲酯经KBH4还原得托品酸甲酯(3),然后碱性水解得到,收率56%(全国原料药工艺汇编,1980.1141).本文用2和多聚甲醛在碳酸氢钠作用下缩合直接得到3[J],再经水解得到1(图1),操作简便,收率67.8%.
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水杨醇的合成工艺改进
水杨醇(salicylalcohol,1)及钠盐(2),是合成抗炎和防治肝炎等药物的重要中间体[1,2].作者在实验中发现文献报道[3,4]的合成方法存在产率低、工艺复杂和成本高等问题,为此进行了如下工作:(1) 甲醛气体法[4]改为多聚甲醛解聚法;(2) 缩合溶剂甲苯改为乙酸丁酯;(3) 乙醚萃取工艺改为甲基异丁基酮萃取-反萃取工艺制备2[5].改进后1的收率由65%[4]提高到86.3%,并简化了工艺,降低了生产成本,使该法更适用于工业化生产.
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三种不同固定液对小鼠组织过碘酸雪夫染色效果比较
目的 比较小鼠肝脏、肾脏、小肠三种组织在质量分数4%多聚甲醛液、Carnoy's液、Bouin,s液三种固定液不同固定时间下的制片质量和过碘酸雪夫染色(PAS)效果,筛选出一种为适用的固定方法.方法 取成年雄性C57BL/6小鼠肝脏、肾脏、小肠,分别固定于三种固定液,固定时间分别是质量分数4%多聚甲醛液:24h、48 h、72 h;Camoy's液:4h、8h、12 h;Bouin's液:12 h、24 h、48 h,充分固定后,常规制作石蜡切片,然后进行PAS染色,对比观察染色效果.结果 三种固定液对不同组织、不同固定时间下PAS染色结果存在差异.肝脏、肾脏、小肠经Camoy's液处理12h后PAS效果佳,质量分数4%多聚甲醛液固定24 h基本满足观察检测效果,而经Bouin's液固定组织染色效果相对较差.结论 PAS反应对固定液和固定时间具有选择性,Camoy's液是组织进行PAS染色的理想固定液,但从固定效果、重复性、安全性、成本等多因素综合考虑,在PAS反应中,质量分数4%多聚甲醛液可以替代Camoy's液.