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大鼠肝脏常规Feulgen反应佳反应条件的定量探讨
Feuglen反应是科学研究和临床病理等工作中常用的组织化学反应，对DNA的显示具有特异性，可用于核酸的定量化测定，然而目前对该反应的认识仍是比较模糊，对结果的判断多带有主观随意性，为了对Feulgen反应过程有更全面的、定量化的认识，使反应条件更加客观，结合科研和教学工作的需要，我们利用图分析仪对这一反应的某些不同实验条件进行了初步测定，试图确定比较适用的、客观的反应条件。1 材料和方法 取正常Wistar大鼠肝脏，Camoy液固定2小时，常规石蜡包埋，切片厚6 μm，另取大鼠肝脏，冷冻切片，Canoy液固定15分钟，吹干待用。盐酸水解条件分为三种情况：(1)石蜡切片1N盐酸60℃，8分钟；(2)石蜡切片5N盐酸，室温。
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NOS阳性细胞在大鼠和小鼠睾丸内分布的比较
1 材料和方法选用雄性Waster大鼠8只,体重210±10 g,雄性昆明小鼠8只,体重22.1±2 g.4%水合氯醛(60 mg/kg)腹膜腔麻醉,经左心室灌注0.9%NaCl冲洗血液,4%多聚甲醛(2500 ml/kg)固定,取睾丸,后固定8 h,30%蔗糖过夜(4℃).液氮速冻后进行冰冻冠状切片,片厚30μm,裱于铬钒明胶片上.应用改进NADPH-d黄递酶组织化学方法进行NOS组织化学反应,常规脱水、透明、封片,光镜观察,每只动物随机选取10个高倍视野,将10个高倍视野的细胞数之和除以10,做为该只动物的NOS阳性细胞数,进行t检验.
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前列腺素合成酶的酶组织化学反应和定量化探讨
在组织切片上显示前列腺素合成酶的原理是该酶可催化底物花生四烯酸而氧化成前列腺素,反应中所形成的活泼氧原子又使3,3′-二氨基联苯胺形成棕色沉淀,以间接证实前列腺素合成酶的存在.正常Wistar大鼠和昆明小鼠,体重分别为200g和20g左右.取其肾和胃行6μ m厚冰冻切片.用Janszen显示法:花生四烯酸0.4mg,DAB 2mg,KC N 0.65mg和0.2M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)10ml,35℃孵育3h.孵育后标本用蒸馏水洗,分别以甘油明胶和中性树胶封固.经Leica Q5 00MC图像分析仪进行平均灰度值(Mean Grey,MG)的测定,用于进行酶组织化学反应强度的分析.结果:前列腺素合成酶阳性反应产物为棕色颗粒,在大、小鼠内的反应部位基本相同.在小鼠肾脏,可见在肾皮质近髓质有阳性反应产物,主要以近曲小管为主;在小鼠胃,可见在近胃粘膜粘膜下层有阳性反应产物.在大鼠的肾和胃中也获相同结果.经图像分析仪测量每种组织五张切片,共测50个视野,包括甘油明胶和树胶两种封固条件共计100个视野.每种组织在不同封固条件下各测定一张盖玻片下无切片,但有封固剂的区域为空白对照.按肾、胃的顺序,而且以明胶在前树胶在后的排序测量,所获平均灰度值如下:小鼠222.9 1±9.66,236.33±18.14,209.42±7.50,227.96±1 3.36;大鼠217.24±6.06,227.01±11.56,231.11±1 2.87,225.83±10.15.经过对大、小鼠肾前列腺素合成酶组织化学反应的观察发现,阳性反应的部位基本相同,均位于皮质深层三分之二区域,而肾皮质浅层三分之一处基本无反应.说明在大、小鼠,该酶在作用于花生四烯酸,合成前列腺素上并无本质差异.动物实验证实,肾正常血流量的维持及调节均有赖于前列腺素的产生,而肾本身具有较强的合成前列腺素的功能也从侧面加以印证.在胃近粘膜下层的较大区域中,前列腺素合成酶的组织化学反应较强,说明这一部位合成前列腺素的功能也较强.这与抑制胃粘膜壁细胞分泌过多胃酸而维持胃整体平衡有密切关系.从分布部位来看,前列腺素合成酶的酶组织化学反应强度的差异并不十分明显,平均灰度值差异很小.另外,从前列腺素的分布来看,酶组织化学的反应结果及生物化学理论不一致. 例如,前列腺素合成酶的阳性反应分布于肾皮质深层的区域,而生物化学理论所描述的是其活性较强的部位在肾髓质.因此可以推测,前列腺素合成酶活性较强的部位不一定就是前列腺素发挥作用较强的区域,该酶可能是在肾皮质合成之后被输送到骨髓质而发挥其生物学活性.
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发育中和成年哺乳动物中枢神经系统束路追踪的新技术
一、前 言 远在Golgi和Cajal时代，追踪神经元之间的联系即已是神经解剖学研究中的重大目标，它对研究神经的功能、神经系统的发育和成熟都具有重要的价值。这种方法学的建立始于19世纪末的逆行和顺行溃变的研究。逆行溃变主要是指毁损轴突后神经元胞体(即去除其靶区之后的神经元胞体)的溃变[17,170]；而顺行溃变技术是以Marchi法显示的Waller变性(胞体或轴突损伤后的轴突终末的溃变)[120]。在神经解剖学形成的早期，在Golgi及其支持者倡导的“网状说”和Cajal提倡的：“神经元说”论战的推动下，Cajal利用Galgi镀银法，详细研究了神经元和轴突[21]，创建了Cajal法，奠定了用溃变镀银法追踪神经通路的方法学基础。 20世纪从40年代开始，Glees[65]、Nauta[11,130,131]、Fink和Heimer[53]等的改进的溃变镀银法使从一个核团到另一处中枢投射的顺行追踪研究可以更有效地进行，特别是对那些用Golgi法无法看到的长距离联系尤为适用。 追踪法的更进一步的技术革命发生在20世纪70年代，出现了利用辣根过氧化物酶(HRP)标记技术，它是可在生活状态下通过标记物被轴浆运输的的方法[102,109]，运用简单可靠的组织化学反应即可追踪出神经元的联系。它较以前所有溃变法都简便、确切和更为敏感。HRP示踪法直到现在仍在应用，它的问世标志着神经解剖学向前迈了一大步，因为它既可以对神经元进行逆行、顺行追踪也可以跨越神经元胞体追踪出神经元的全程。也有人试用WGA－HRP [60]以及一些毒素为载体进行跨越突触的追踪。与HRP技术问世的同时，Cowan等[37]创建了放射自显影技术，通过放射性标记的氨基酸顺行传送来研究轴突的联系。
