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人骨肉瘤细胞系OS-732与血管生成的相关作用
一、材料与方法 1.细胞株和细胞培养：人骨肉瘤细胞株OS-732， 购自北京积水潭医院骨科实验室，常规培养于含10%新生小牛血清的RPMI-1640培养液中。 2.鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）制备及瘤细胞接种：选取孵育至9 d的胚蛋，参考付生法［1］的方法制备CAM，选择近胚头1 cm处的两条前卵黄静脉间的相对无血管区接种对数生长期OS-732细胞，每只5×106/100 μl,共接种10只。另10只设为空白对照组。于接种第2天至接种第9天在解剖显微镜下逐日观察接种区5 mm范围内血管数目及形态学变化。
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木瓜蛋白酶致大鼠肺气肿中碱性成纤维细胞生长因子mRNA的表达
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是一种具有促进细胞生长增殖作用的多肽类生长因子，在维持机体的生长发育及促进多种组织的损伤修复中起着十分重要的作用。我们通过对木瓜蛋白酶（Papain）致大鼠肺气肿模型肺组织和肺泡巨噬细胞bFGF mRNA表达的研究，来探讨其在肺气肿形成过程中与肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原增长的关系。 材料与方法（1）肺气肿动物模型的制备与分组：健康Wistar大鼠42只，体重200～250 g，雌雄不拘（由同济医科大学实验动物中心提供），随机分为肺气肿模型1，3，5，7，15，30天组和正常对照组，每组6只。以2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉动物后，实验组气管内注射8%木瓜蛋白酶(美国Sigma公司)0.05 ml/100 g，对照组以同样方法注入相应量的生理盐水。（2）组织细胞标本制作：以2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，行气管插管，向肺内灌注生理盐水，每次5～10 ml，共8次，回收支气管肺泡灌洗液，离心，弃上清，同法用RPMI1640（美国Gibco产品）培养液洗涤细胞1次，用含10%新生小牛血清（Gibco产品）的RPMI1640调细胞浓度至1×106/ml，加入铺有盖玻片的6孔培养板中，置37℃，5% CO2培养箱（Hera Cell德国产）培养24 h后，肺泡巨噬细胞贴壁，取出长有细胞的盖玻片，用4%多聚甲醛固定20～30 min，再用酒精梯度脱水后，置-70℃冰箱保存备用。灌洗肺后取下双肺，向肺内注入4%多聚甲醛，直至肺膨胀边缘变锐、胸膜展平，结扎气管，浸泡于4%多聚甲醛中固定10 h。取左下肺叶常规石蜡包埋、切片、HE染色。（3）免疫组织化学染色：用即用型链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(Strept Avidin-Biotin-enzyme Complex，SABC)免疫组织化学染色试剂盒和兔抗鼠collagen Ⅰ及collagen Ⅲ多克隆抗体及DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）进行免疫组织化学染色。（4）bFGFmRNA原位杂交：用bFGF寡核苷酸探针和敏感加强型原位杂交检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）对组织细胞标本原位杂交。
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妊娠高血压综合征孕妇血清对培养的内皮细胞的影响
近年来，内皮细胞损伤是妊娠高血压综合征(妊高征)发病中心环节的学说［1］已被公认，但造成内皮细胞损伤的原因目前仍不清楚。本研究通过观察妊高征患者血清对培养的脐静脉内皮细胞增殖、细胞凋亡和细胞间粘附分子1(ICAM-1)表达的影响，探讨妊高征发病的机理。 一、资料与方法 1.孕妇血清来源：选取正常晚孕妇女4例及妊高征患者13例，其中轻、中、重度妊高征患者各6、2、5例，按全国统编教材《妇产科学》(第4版)［2］中的标准进行诊断和分类。平均孕周为38周，正常晚孕妇女及妊高征患者的年龄、孕龄均无统计学差异。所有孕妇均无心、肝、肾及内分泌病史。未临产时采静脉血，无菌条件下分离血清，-20℃保存待用。 2.细胞培养及分组：脐血管内皮细胞株购自武汉大学典型培养物保藏中心。将细胞加入含10%新生小牛血清的依格尔培养液进行传代培养。实验共分5组，1组加入等量依格尔培养液；2组培养液加入正常晚孕妇女血清；3、4、5组培养液分别加入轻、中、重度妊高征患者血清。2～5组所加孕妇血清体积分数为30%，其他成分与1组相同。 3.观察指标：(1)生长曲线：连续观察7 d，以天数为横轴，以每天所得细胞数为纵轴绘制成图。(2)ICAM-1免疫组织化学染色：免疫组化鼠抗人ICAM-1单克隆抗体购于武汉博士德公司，二氨基联苯胺染色试剂盒购于北京中山生物技术公司。细胞取材后以丙酮固定，依次加入一抗、生物素标记的二抗及辣根酶标记的链霉卵白素，二氨基联苯胺显色封片后镜检。结果按细胞膜或细胞浆染色的深浅来判断：淡棕色为阳性(+)、棕色为中度阳性(+ +)、深棕色为强阳性(+ + +)、无着色的为阴性(-)。(3)内皮细胞凋亡：2、3、4、5组各取培养瓶8个，细胞融合后，换无血清的改良依格尔/F12混合培养基，分别加入各组孕妇血清培养后取材，用碘化丙啶(50 μg/ml，为美国Sigma公司产品)作细胞DNA染色，用流式细胞仪(Facsort，为美国B.D公司产品)检测。分析细胞凋亡：低于G1期DNA含量主峰的记数峰为凋亡峰，以百分比(%)代表细胞凋亡率。 4.统计学方法：采用两样本均数的t检验。
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智能气功外气对免疫低下小鼠细胞免疫状态的影响
1材料与方法1.1实验动物昆明种系小白鼠,雌雄各半,体重(23士2)g,购于山东医科大学实验动物中心,实验动物质量合格证号:鲁动质9301021.2主要试剂①基础培养液:RPMI1640(GIBCO,USA)干粉,按说明用双蒸水完全溶解后,加入碳酸氢钠2g/L,然后通入CO2调pH至7.0,0.22μm微孔滤膜过滤除菌,经无菌试验合格后置-4C保存备用;②完全培养液:在基础培养液中加入新生小牛血清(达15%)、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、庆大霉素50U/ml、Hepes10mM、谷氨酰胺2mM、丙酮酸钠1mM,调pH至7.0～7.4;③肿瘤细胞株:YAC-1细胞株(引自山东省医学科学院基础所免疫室),本室传代培养.
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新生小牛血清污染大肠埃希菌噬菌体的检测
新生小牛血清是生物制品生产中细胞培养所必需的原材料.小牛血清质量的好坏直接影响细胞生长和生物制品的质量,国家近年来对国内新生小牛血清提出了严格的质量标准,其中检测小牛血清中污染大肠埃希菌噬菌体是一项重要的指标.为了减少小牛血清污染的漏检,我们用2种宿主菌检测小牛血清噬菌体.结果报告如下.
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中西医结合对SLE的T淋巴细胞亚群的影响
T淋巴细胞亚群(TL-CFU)可反映细胞免疫系统中有T增殖和分化能力的祖细胞或受体细胞的活体水平，是评价细胞免疫缺陷的一个敏感指标。国内外文献均报道过SLE病人TL-CFU水平低下[1,2]。采用以青风藤、青蒿、红藤、鸡血藤为主的中药加用少量激素治疗并观察TL-CFU水平变化尚罕见报道。本研究从TL-CFU数目变化角度进行探讨，旨在探讨中药对SLE的免疫功能调节作用。1 材料与方法1.1 资料 1994年5月～1996年7月湖南医科大学附二院狼疮门诊及住院病人45例，男性6例、女性39例。年龄16～35岁，平均30．38岁，病程3～8年，平均5．28年。ARA标准：1982年ABA诊断标准、活动期诊断标准：chbick法[3]。患者分组：活动期20例，非活动期25例。患者均未服用免疫抑制剂，为避免药物影响，采血前至少停服强的松16 h以上，这样对指标影响甚微[4]。正常对照组22人，男性11人，女性11人；年龄19～45岁，平均为28．45岁，身体健康，均为本院工作人员及自愿献血员。1.2 实验试剂与方法1.2.1 实验试剂 淋巴细胞分离液，上海试剂二厂；新生小牛血清，杭州四季青生物材料研究所，PHA为广州医药工业研究所产品。1.2.2 实验方法 采用单克隆抗体法，见文献[1]。1.3 治疗方法 中药+强的松组依病情给予5～60mg/日强的松，另服用青风藤、青蒿、红藤、鸡血藤等中药汤剂，1剂/日，疗程3个月。强的松组依病情给予5～60mg/日强的松服用，疗程3个月。
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新生牛血清中微生物的电镜检测及结果分析
目的探索利用电镜快速、有效的进行新生牛血清外源因子检测.方法利用膜表面富积法制备新生牛血清样品,在电镜下观察样品,并与其它检测方法比较.结果利用电镜检查,实验组的外源因子检测阳性率远高于对照组;所检市售国内外品牌新生牛血清均有不同程度的外源因子存在.结论电镜法检测新生小牛血清是一种快速、广谱的外源因子检测方法,并具有检测精度高的优点;它为新生牛血清的质量监测提供了一种新的参比方法.
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增殖法检测新生小牛血清中大肠杆菌噬菌体污染
新生小牛血清是生物制品生产中的一种重要原材料,其质量的好坏直接影响到制品的质量,尤其是活疫苗的生产.为提高疫苗的质量,我们用3种大肠杆菌宿主菌,采用增殖法对新生小牛血清进行了大肠杆菌噬菌体检测.现将结果报道如下.
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白血病细胞增殖动力学两项指标的对比研究
采用\+3H-TdR掺入法研究细胞增殖动力学历史悠久，实验结果可靠。用核仁组成区银染法（AgNOR银染法）研究细胞增殖情况也已开展，两种方法是否有可比性的研究报告不多，现将我科研究的初步结果报告如下。1 材料和方法1.1 \+3H-TdR掺入法取骨髓1ml或外周血2ml，置肝素抗凝小瓶内，室温自然沉淀30min～1h，取富含白细胞的上层液体，用含10%新生小牛血清的RPMI1640培养液稀释至细胞数1 ×10\+6 /ml ，每例测3孔，取平均值。在5%CO\-2 简易培养箱内37℃培养2h，然后每孔加\+3H-TdR1uci，继续培养4h 。终止培养，立即用冷生理盐水冲洗，离心，后置闪烁杯中用双道液闪仪测cpm值。
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应用MTT比色法评价新生小牛血清对培养细胞生长的影响
体外培养细胞成功与否常取决于所选用血清质量,不同批号的血清往往有个体差异,质量不尽一样,细胞长势差别很大,所以在培养细胞之前必须对使用的血清进行质量鉴定.血清质量鉴定方法有定性法[1]、定量法[2,3]、放射性核苷酸掺入法[4]和MTT比色法[5],而细胞计数法、克隆形成率测定法和[3]H-TdR掺入法存在操作复杂和放射性污染等缺点.自1983年Mosmann[6]建立MTT比色法以来,经不断改良完善,已成为细胞生物学及相关研究领域一种分析细胞活性、生长增殖等常用方法[7,8].基于MTT比色法能定量检测细胞的增殖与生长,本室在细胞培养中应用MTT比色法检测300头新生小牛血清(未饮过初乳)支持细胞生长能力.
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新生小牛血清对人胎脑海马组织神经干细胞分化的影响
目的探讨新生小牛血清对人胎脑海马组织神经干细胞分化的影响.方法采用细胞培养和免疫细胞组化技术,观察不同浓度新生小牛血清对人胎脑海马组织神经干细胞分化的影响.结果新生小牛血清能诱导人神经干细胞分化为神经细胞及神经胶质细胞,在无血清培养基与含不同浓度新生小牛血清培养基中培养的神经干细胞分化为神经细胞和神经胶质细胞的数目在发生变化,并且随着新生小牛血清浓度的增加,神经干细胞分化为神经细胞的数量在减少,分化为神经胶质细胞的数量增加.结论新生小牛血清影响人神经干细胞分化为神经细胞和神经胶质细胞的比例,并与新生小牛血清的浓度有一定的关系.
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XTT-PMS法检测肝癌细胞的生长与药物敏感性
一、材料与方法1.主要试剂:MTT、XTT、PMS、DMSO(Sigma公司产品),RPMI 1640(Gibco公司),氟尿嘧啶(上海旭东海普药业有限公司),注射用盐酸阿霉素(深圳万乐药业有限公司),注射用丝裂霉素C(协和发酵工业株式会社),新生小牛血清(杭州四季青公司提供).
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血活素注射液治疗病毒性肝炎的临床观察
治疗病毒性肝炎目前临床上保肝、降酶、利胆等药物繁多，且多存在效果不确切、价格昂贵等缺点。我们应用由去纤维蛋白新生小牛血清，经酶降解产物BAPI，治疗病毒性肝炎亦取得了较对照组更为确切的治疗效果。1 材料与方法1.1 病例选择：我院传染科1999年至2000年收治的各型病毒性肝炎126例。全部病例符合1995年北京全国传染病与寄生虫病学术会议修订的“病毒性肝炎防治方案(试行)”标准［1］。其中男88例、女38例；病程5天—13年，乙型肝炎76例(急性27例、慢性49例)、慢性丙型肝炎3例、急性甲型肝炎30例、急性戊型肝炎14例、2例急性庚型肝炎、1例未检出相应病原，所有慢性肝炎均属轻—中度。全部病例随机分为治疗组76例与对照组50例。分组后，在性别、年龄、病程及病情程度方面两组有均衡可比性(t检验，P均＞0.05)。1.2 观察与治疗方法：全部病例均以齐墩果酸60mg/次、甘利欣50mg/次(部分为10%GS100ml+甘利欣200mg，静滴，每日一次)，均每日3次。静注10%GS+胸腺肽40mg、NS100ml+肝复肽40—80mg、10%GS100ml+复方丹参注射液40ml或灯盏花素40mg，均每日一次，在此基础上；治疗组以10%GS100ml+BAPI5ml，静注，每日1次；对照组10%GS500ml+ATP40mg+coA100u+氯化钾1.0，静注，每日一次。均连用3周。全部病例均每日观察乏力、纳差、恶心症状、并每4—5天检测肝功能一次。1.3 统计学处理：采用u检验、X2检验。
