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DAB废物处理程序
3,3′-二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)为免疫组织化学标记常用的显色剂,其反应产物是一种可以致癌的诱变剂.有些实验室曾经将DAB先加入漂白粉过夜再做废物处理.尽管这种程序完全破坏了DAB,但终反应混合物仍具有诱变作用,且加入了漂白剂后其中含有氯,后DAB废物以每加仑500元人民币的价格被焚化.若DAB完全被破坏而又不留下诱变副产物的话,DAB废物就可以没有成本/代价的通过排水处理[1,2].Duke大学环境安全部颁布了两种处理程序可以完全破坏DAB,而不会留下终反应混合物.现介绍如下:
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P27蛋白在非小细胞肺癌中表达的预后意义
P27蛋白具有限制性调节细胞周期进程的作用,这一作用主要通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKS)复合物的功能来实现。P27蛋白表达与预后的关系在乳癌、淋巴瘤、前列腺癌以及消化道肿瘤已有报道[1],而在肺癌中的研究甚少。我们运用免疫组化法检测P27在非小细胞性肺癌组织中的表达水平,从而探讨其在非小细胞性肺癌中的意义。 对象和方法 1.对象:56例非小细胞肺癌(NSCLC)病例均在本院接受治疗及随访。其中男42例,女14例,年龄39~77岁,平均60岁。中位随访时间2年(1~5年),56例NSCLC中,腺癌36例,鳞癌18例,腺鳞癌2例。高分化12例,中分化20例,低分化24例。第1、2年每3个月随访一次,以后每半年一次。2.方法:(1)试剂:鼠抗人P27单克隆抗体(G173-524)购自美国Pharmingen公司。羊抗鼠IgG、链菌素亲生物蛋白和过氧化物酶、3,3-二氨基联苯胺盐酸盐(DAB)均购自丹麦DAKO公司。(2)染色流程:5 μm石蜡切片脱蜡水化→过氧化氢室温处理20 min→甩干后微波抗原修复2次,每次10 min→鼠抗人P27单抗(1∶10)湿盒孵育过夜→生物素标记羊抗鼠IgG(1∶200),37 ℃湿盒温育40 min→DBA显色、复染、封片。用已知P27表达阳性的胰腺癌作阳性对照。用缓冲液(PBS)取代一抗作阴性对照。(3)染色结果判断:观察染色切片中10个具有代表性的高倍视野,其肿瘤细胞阳性数在50%以上为(+),低于50%为(-)。3.统计学方法:采用第二军医大学统计教研室统计软件SPSS软件包,运用Logistic逐步回归对P27表达与临床及病理指标的相关性进行分析;应用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析,时序检验(log rank test),根据寿命表各随访年份生存率作生存曲线。
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妊娠高血压综合征孕妇血清对培养的内皮细胞的影响
近年来,内皮细胞损伤是妊娠高血压综合征(妊高征)发病中心环节的学说[1]已被公认,但造成内皮细胞损伤的原因目前仍不清楚。本研究通过观察妊高征患者血清对培养的脐静脉内皮细胞增殖、细胞凋亡和细胞间粘附分子1(ICAM-1)表达的影响,探讨妊高征发病的机理。 一、资料与方法 1.孕妇血清来源:选取正常晚孕妇女4例及妊高征患者13例,其中轻、中、重度妊高征患者各6、2、5例,按全国统编教材《妇产科学》(第4版)[2]中的标准进行诊断和分类。平均孕周为38周,正常晚孕妇女及妊高征患者的年龄、孕龄均无统计学差异。所有孕妇均无心、肝、肾及内分泌病史。未临产时采静脉血,无菌条件下分离血清,-20℃保存待用。 2.细胞培养及分组:脐血管内皮细胞株购自武汉大学典型培养物保藏中心。将细胞加入含10%新生小牛血清的依格尔培养液进行传代培养。实验共分5组,1组加入等量依格尔培养液;2组培养液加入正常晚孕妇女血清;3、4、5组培养液分别加入轻、中、重度妊高征患者血清。2~5组所加孕妇血清体积分数为30%,其他成分与1组相同。 3.观察指标:(1)生长曲线:连续观察7 d,以天数为横轴,以每天所得细胞数为纵轴绘制成图。(2)ICAM-1免疫组织化学染色:免疫组化鼠抗人ICAM-1单克隆抗体购于武汉博士德公司,二氨基联苯胺染色试剂盒购于北京中山生物技术公司。细胞取材后以丙酮固定,依次加入一抗、生物素标记的二抗及辣根酶标记的链霉卵白素,二氨基联苯胺显色封片后镜检。结果按细胞膜或细胞浆染色的深浅来判断:淡棕色为阳性(+)、棕色为中度阳性(+ +)、深棕色为强阳性(+ + +)、无着色的为阴性(-)。(3)内皮细胞凋亡:2、3、4、5组各取培养瓶8个,细胞融合后,换无血清的改良依格尔/F12混合培养基,分别加入各组孕妇血清培养后取材,用碘化丙啶(50 μg/ml,为美国Sigma公司产品)作细胞DNA染色,用流式细胞仪(Facsort,为美国B.D公司产品)检测。分析细胞凋亡:低于G1期DNA含量主峰的记数峰为凋亡峰,以百分比(%)代表细胞凋亡率。 4.统计学方法:采用两样本均数的t检验。
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铁与新生儿缺氧缺血性脑损伤的关系
铁介导的氧自由基在新生儿缺氧缺血性脑损伤(HIBD)发生机制中作用的研究少见报道,本研究旨在探讨窒息新生儿血浆非蛋白结合铁(NPBI)的改变和新生儿HIBD尸检脑组织铁分布的变化,为新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)发病机制的研究提供理论依据。 对象和方法 出生后48 h内的足月儿,共45例,分为3组,每组15例。对照组(A组):健康新生儿;单纯窒息组(B组):不伴神经系统表现窒息新生儿;HIE组(C组):其中8例由头颅CT证实,HIE临床分度:轻度6例,中度9例,重度HIE不纳入本研究。尸检6例,均为足月儿,分为对照组和HIE组。对照组2例,临床和病理诊断均无神经系统异常;HIE组4例,均符合HIBD临床和病理诊断标准。检测3组新生儿血浆NPBI浓度、血清脂质过氧化物(LPO)、血清铁(SI)、总铁结合力(TIBC)、转铁蛋白饱和度(TS)。用3′,3-二氨基联苯胺(DAB)加强的普鲁士兰染色方法对6例尸检新生儿的脑皮层及皮层下白质组织进行铁的组织化学染色,光学显微镜下观察。采用单因素方差分析、q检验进行统计学处理。
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胸腔镜下切除肺炎性肌纤维母细胞瘤一例
患者男,40岁。2013年8月20日体检CT示左肺上叶肿块:左上肺见团块状高密度影,密度均匀,边界清楚,大小约3.8 cm×3.3 cm。左侧胸膜局限性增厚,胸膜腔未见明显异常。患者无咳嗽、咳痰,无胸闷、胸痛,无呼吸困难。查体:锁骨上未触及肿大淋巴结。门诊以“左肺占位”收入我科。查血清癌胚抗原0.66 ng/mL,糖类抗原12514.60 U/mL,糖类抗原19-9为4.00 U/mL。行CT引导下经皮肤肺穿刺活检,术后病理示:倾向于肺炎性肌纤维母细胞瘤。完善相关术前准备后,于2013年8月28日全身麻醉下行胸腔镜下左肺上叶切除术。术中探查见:肿块位于左肺上叶,大小约3.5 cm×3 cm×3 cm,质地韧,与胸主动脉无明显粘连,未侵犯胸膜及胸壁,未累及肺下叶、肺门、心包、膈肌及膈神经。完整切除左肺下叶。术后标本送病理检查。手术标本常规10%中性甲醛固定,石蜡包埋,3μm厚切片,采用通用型两步法免疫组织化学染色,所有抗体均为工作液,购自北京中杉金桥公司,染色过程按说明书进行,用二氨基联苯胺(DAB)显色。术后9个月以电话方式随访患者及家属。
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褪黑素受体亚型蛋白的免疫组化检测方法
1 方法介绍1.1 组织标本制备新鲜待检组织立即用4%多聚甲醇固定,常规脱水、透明、浸蜡,石蜡包埋组织,4℃冰箱贮存待检测.1.2 主要步骤将石蜡包埋组织作4 μm的连续切片,在37℃烘箱过夜.石蜡切片用二甲苯脱腊10 min×3,梯度乙醇洗2 min×3,3%过氧化氢溶液处理10 min,以阻断内源性过氧化物酶活性.蒸馏水洗2 min×3,0.01 mol/L,pH 6.0柠檬酸缓冲液微波修复抗原10 min,冷却后蒸馏水洗2 min×3,PBS洗2 min×3.每张切片加50 ml非免疫性动物血清温室孵育10 min,每张切片加50 ml 鼠抗人mt1和MT2受体亚型单克隆抗体(1∶75)置湿盒内4℃过夜,PBS洗2 min×3,每张切片加50 μl生物素标记的第二抗体温室孵育20 min,PBS洗2 min×3,切片加50 μl链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶溶液,温室孵育20 min ,PBS洗2 min×3,每张切片加新配制的液体二氨基联苯胺(DAB)显色5~10 min,流水冲洗,苏木精复染,中性树胶封片,以PBS代替第一抗体作为空白对照.
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采用TUNEL检测人精子凋亡及其初步应用
在不育、职业性毒物接触和吸烟男性均发现精子凋亡增多[1,2].目前,国外报道的精子凋亡检测方法主要有精子染色体结构检查(SCSA)、TdT介导缺口末端原位标记法(TUNEL)、吖啶橙染色(AOT)、彗星实验等[3].我们应用二氨基联苯胺(DAB)显色TUNEL方法检测精子凋亡,探讨其在精子凋亡临床和基础研究中的应用.
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氢化物发生-原子荧光法同时测定饮用水中微量砷和硒
砷、硒是生活饮用水中的毒理学指标.测定常用的方法有二乙氨基二硫代甲酸银分光光度法、砷斑法和氢化物原子荧光法;测硒有二氨基萘荧光法、氢化物原子吸收分光光度法、二氨基联苯胺分光光度法和氢化物原子荧光法.
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慢性鼻窦炎嗅粘膜P物质的观察
慢性鼻窦炎是鼻科常见疾病,其发病往往与感染、变态反应相关,这类患者常伴有嗅觉障碍。为进一步研究慢性鼻窦炎、嗅觉障碍与变态反应的相关性,我们对慢性鼻窦炎患者嗅粘膜进行了P物质(substance P)的观察。材料和方法1 标本来源患者组:选自1997年4~8月北京同仁医院耳鼻咽喉科因慢性鼻窦炎入院行鼻窦内窥镜手术患者55例,男性31例,女性24例,年龄范围1 6~65岁,平均年龄42.6岁。术前经鼻窦CT检查,并根据1996年郑州耳鼻咽喉科学会研究的慢性鼻窦炎分型、分期标准进行诊断。术中取患者嗅粘膜。对照组:选用单纯鼻中隔偏曲行鼻中隔矫正术的病人11例,取其嗅粘膜作对照。2 嗅粘膜P物质免疫组化检测标本用10%的中性福尔马林液固定,固定时间约24小时。标本按石蜡切片常规脱水、浸蜡、包埋,用轮转式石蜡切片机切片,采用SLAB免疫组织化学染色方法试剂:一抗采用兔抗多克隆SP抗体,二抗为生物素性山羊抗兔IgG,辣根酶标记链霉素亲和。显色剂:底物二氨基联苯胺(DAB)。同时设有阳性对照和阴性对照。P物质阳性标准:同阳性对照比较,胞核或胞浆着棕色,胞核颜色较深,胞浆内有棕色、粗大颗粒的细胞为P物质阳性细胞,并由阴性对照排除非特异性染色,根据阳性细胞的计数分为阴性,全片未见P物质阳性细胞;P物质阳性1分,全片少量散在P物质阳性细胞;P物质阳性2分,较多呈阳性细胞(一个视野内>5个阳性细胞)。
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一种简便、可靠的免疫组化双重标记新方法
目的:探索一种简便可靠、清晰的免疫组化双重标记方法,可用普通光学显微镜观察,并能长期保存染色结果。方法免疫组化双标中,均使用辣根过氧化物酶( HRP)连接的二抗,底物分别选用二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine, DAB)和镍增强DAB。第一标DAB染色完成后切片煮沸4~5 min以灭活HRP,完全阻断交叉反应,然后进行第二标镍增强DAB染色。结果①切片煮沸5 min,可完全灭活残余的HRP酶活性,防止染色反应交叉;5%的H2 O2灭活HRP酶不完全,易产生交叉反应;短暂高温灭活HRP不损坏之前的特异性DAB染色或造成组织损伤。②第一标DAB的棕黄色与第二标镍增强DAB的紫蓝色反差大、背景低;颠倒底物使用次序将损害双标质量。此外,双标切片可采用传统的中性树胶封片,染色结果能恒久保存。结论采用同一种酶标记系统建立了简便、可靠的免疫组化双标新方法。该方法标记结果清晰、操作简便、试剂易得,有较大应用价值。
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二氨基联苯胺分光光度法测定水中硒的探讨与改进
硒是生物体所必需的微量元素之一,过量硒又会引起硒中毒.水中硒主要是以无机的六价硒、四价硒、负二价硒和某些有机硒的形式存在,也可能有微量硒附着在固体颗粒物上[1].
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模糊正交设计法探讨石墨炉原子吸收测定水中硒的佳条件
现行的国家标准方法测定饮水中硒用二氨基萘荧光法,二氨基联苯胺分光光度法[1].该两法存在操作繁杂,使用联苯胺,甲苯,氨基萘,环己烷等试剂,影响工作人员的健康及不利环保等缺点.
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解整合素金属蛋白酶9在胆管癌细胞中的表达及临床意义
解整合素金属蛋白酶(ADAM)是依赖锌离子的基质金属蛋白酶(MMP)超家族的一员[1],是一类含有解整合素和金属蛋白酶结构域的Ⅰ型跨膜蛋白.近年来有研究证实ADAM9蛋白在肝癌、乳腺癌、结肠癌、甲状腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤中均有表达[2].本研究旨在探讨ADAM9在胆管癌细胞中的表达及临床意义.一、材料和方法1.材料:一抗为兔抗人ADAM9多克隆抗体(购自北京博奥森生物技术有限公司),免疫组织化学二抗试剂盒以及二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购白武汉博士德生物工程公司.
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细胞周期调控因子在前列腺增生组织中的表达及其与生长因子、细胞增殖之间的关系
本研究旨在探讨前列腺增生(BPH)组织中细胞周期蛋白依赖性激酶 cdk2和 cdk4及细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E的表达及其与多肽生长因子、细胞增殖之间的关系,现报道如下。 一、材料与方法 1. 一般资料:BPH 62例,年龄51~80岁;18例正常前列腺(NP)作为对照。均为石蜡包埋标本,切片厚4 μm。 2. 方法:免疫组织化学方法采用链霉卵白素过氧化物酶 (SP)方法。 cdk2(1∶50)、 cdk4(1∶50)、cyclin E(1∶40,抗原修复)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,1∶50)和神经生长因子(NGF,1∶80)均为多克隆抗体,cyclin D1(1∶20,抗原修复)和PCNA(1∶50)为单克隆抗体,二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染。以上试剂由北京中山生物公司提供。结果判定:未见阳性细胞为阴性(-)、阳性细胞数1%~25%为(+)、26%~50%为()、>50%为()。PCNA指数的计算则在高倍镜下(400倍)随机检测5~10视野,分别测定上皮和间质的阳性细胞百分比。 3. 统计学方法:采用χ2检验、Spearman秩相关分析和t检验。
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两种DAB配制方法的应用和体会
二氨基联苯胺是过氧化物酶重要的显色试剂之一,在免疫组织化学技术中广泛应用.如何正确地使用DAB(3,3 diaminbezidine)对免疫组织的结果分析及判断至关重要.现将我们在日常工作中两种DAB配制方法的应用和体会介绍如下.
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二氨基联苯分光光度法测定水中硒的改进
生活饮用水卫生规范[1]中对于硒的测定方法有多种,其中二氨基联苯胺分光光度法,仪器设备简单、操作方便,多被基层单位在实际工作中采用.但作者在实验中发现;该法的测定精密度较差,主要为甲酚红指示剂在pH6.5~7.0时变色不明显,需凭经验和熟练程度而较难把握;进而影响甲苯的萃取效果.本研究在萃取时改用溴甲酚紫一甲酚红混合指示剂,使PH值的变化终点非常明显,克服了上述缺点,现报告如下:
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细胞色素氧化酶的DAB法与Nadi反应的比较
过去常用经典的Nad i反应显示细胞色素氧化酶以定位线立体的存在部位,现在广泛使用DAB法.我们对这两种方法进行了比较.方法如下:取Wistar大鼠的心、肝、肾组织,用液氮骤冷,恒冷箱切片(厚7μm),进行以下实验:Nadi反应:切片入孵育液(N-苯基-对-苯二胺3mg、1-羟基-2-萘酸3mg 溶于二甲基亚砜0.1ml,0.05M的磷酸缓冲液pH7.2 10ml,混匀后过滤 )室温30min.入Lugol碘液2min,入5%硫代硫酸钠4min,入1%醋酸钴60min,蒸馏水洗,甘油明胶封固.DAB法:切片入孵育液(0.05M磷酸缓冲液pH7.2 10ml,3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)9mg,细胞色素C 15mg,混匀后过滤)室温5min .切片用缓冲液清洗,入蒸馏水,甘油明胶封固.HE染色:切片先用10%Formalin固定10min,再做常规HE染色.对照:Nadi反应和DAB法都用迭氮钠预孵育5min(10ml缓冲液中含6mM迭氮钠),再入含6mM迭氮钠的孵育液中孵育,以下的步骤与上述步骤相同.DAB法还用不含细胞色素C的孵育液做对照.实验结果:HE染色的切片显示组织结构正常.Nadi反应的阳性产物为黑绿色的颗粒, 可见弥散的现象.DAB染色的阳性产物为棕色颗粒,很少见有弥散现象.对照切片的结果:用迭氮钠制酶活性的Nadi反应有弱阳性产物,而用迭氮钠的DAB法细胞色素C的切片均呈阴性反应.我们认为显示细胞色素氧化酶的经典方法Nadi反应存在反应产物弥散的现象,用迭氮钠抑制酶的活性后仍有阳性产物出现,因而该法只能表明线粒体的存在,而其定位不够准确.DAB法的方法简便,反应产物不易扩散,可较准确地定位线粒体的存在部位.另外,DA B的沉淀物能与四氧化锇反应形成锇黑,可用于电镜观察.经以上的实验观察和比较,我们认为无论从反应的特异性、定位的准确性,还是电镜应用性等方面看,显示细胞色素氧化酶的DAB法都优于Nadi反应.
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不连续密度离心分离及二氨基联苯胺染色法鉴定脐血中胎儿有核红细胞
胎儿细胞包括[1]:有核红细胞、滋养层细胞和白细胞,它们可穿过胎盘在母体血中循环.利用母体外周血中存在的稀少的胎儿细胞进行遗传学诊断,是一个很有前途的方法,这些非创伤性技术不会产生感染和流产的危险.