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一种新的PrP无细胞构象转化系统的建立
PrP细胞外构象转化系统已经被一些实验室用于朊病毒的研究,但在反应体系中往往需要使用放射性同位素.为了建立一种安全方便的PrP无细胞构象转化系统用于TSE发病机制的研究,通过PCR方法获得仓鼠PrP(HaPrP)全长基因,克隆至原核表达载体pQE30,在大肠杆菌中表达并纯化出分子量为27kD HaPrP蛋白,Westernblot证实可与PrP特异性单克隆抗体反应.将纯化蛋白在体外标记生物素(Biotin-7-NHS),与纯化的scrapie 263K毒株仓鼠感染脑组织prpsc蛋白共同孵育4天后,经蛋白酶K消化,Western blot检测,证明存在一条抵抗蛋白酶K消化的、被亲和素特异性识别的条带,其分子量约为20kD.这表明HaPrpsen可以被转化为HaPrPres.实验表明,可以利用原核系统取代真核系统表达PrP,并用生物素标记取代35S标记纯化蛋白,建立一个更加安全方便的无细胞构象转化系统,用于朊病毒的研究.
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应用PCR-反向斑点杂交法快速检测和鉴定常见医学真菌
近年来,机会性真菌感染呈不断上升趋势,这主要归因于器官移植、骨髓移植的广泛开展;艾滋病患者的大量增多及皮质类固醇激素、免疫抑制剂和广谱抗生素的应用等;另外不同真菌菌种对抗真菌药物具有不同的天然耐药性,这就不仅要求实验室快速检出感染的病原菌,而且还应准确鉴定到种,才能使临床采取有效措施控制感染.目前,真菌的分离培养鉴定仍是主要诊断方法,但存在耗时长且不敏感等问题.为建立快速、敏感、特异的检测与鉴定方法,我们用真菌通用引物扩增广范围医学真菌的细胞色素P450羊毛固醇-14α-去甲基化酶(L1A1)基因的1个片段(约350bp).通用引物以生物素标记,结合种特异性探针进行反向斑点杂交,可鉴定临床常见的8种真菌,其中包括近年来新发现的都柏林念珠菌.
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聚合酶链反应反向点杂交法鉴定人乳头瘤病毒型别
为了探讨人乳头瘤病毒(HPV)的分型方法,我们将聚合酶链反应(PCR)技术和Saiki等[1]提出的反向点杂交(RDB)技术结合起来,对HPV进行型别鉴定,现报告如下。 一、 材料及方法 1. 标本来源:30份宫颈癌组织标本,选自贵阳医学院附属医院病理科,为1995年1月~1997年12月部分存档活检及手术切除的蜡块标本。 2. 菌种及试剂:内含HPV全基因组的4种PUC19质粒:HPV6B、11、16和18 及特异性寡核苷酸探针(SSO),通用引物序列为:GP5 5′-TTTGTTACTGGTAGATAC-3′,GP6 5′-GAAAAATAA-ACTGTAAATCA-3′(GP5的5′端由生物素标记),可同时扩增HPV 6B,11,16和18,扩增片段长度为150 bp,由国家计划生育委员会科研所提供(表1)。
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细胞周期蛋白D1 RT-PCR ELISA的建立及其初步应用
目的:建立一种灵敏、特异和简便实用的细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)mRNA表达水平的检测手段.方法:生物素标记Cyclin D1 5'端引物,PCR DIG Labeling Mix取代dNTP,RT-PCR终产物置于链霉亲和素包被的ELISA板中孵育,洗涤、显色后,自动酶联检测仪测A45onm值.常规RT-PCR方法作对照.检测对象包括Cyclin D1表达细胞系SGC7901,转染反义Cyclin D1基因的SGC7901D1AS细胞及转染空载体的SGC7901neo细胞,原发性胃癌组织30例、胃癌旁和正常胃黏膜组织20例,胃良性病变组织22例.结果:RT-PCR ELISA与RT-PCR琼脂糖电泳检测结果吻合,所测得的A450nm值与Cyclin D1特异性基因片段的丰度和检测细胞数量有一很好的对应关系.SGC7901胃癌细胞转染Cyclin D1反义基因后,Cyclin D1mRNA表达显著降低(P<0.05).Cyclin D1 mRNA在胃良性疾病起即开始明显升高(P<0.05).在胃癌各组中,进展期胃癌伴转移组的Cyclin D1 mRNA表达水平显著高于其他两组(P<0.05).结论:本文建立的Cyclin D1 RT-PCR ELISA可作为一种侯选的、较为简便和半定量的cyclin D1 mRNA检测方法.致谢:第三军医大学数学教研室罗明奎主任在本课题结果统计分析的工作中给予了无私的指导和帮助.
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P27蛋白在非小细胞肺癌中表达的预后意义
P27蛋白具有限制性调节细胞周期进程的作用,这一作用主要通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKS)复合物的功能来实现。P27蛋白表达与预后的关系在乳癌、淋巴瘤、前列腺癌以及消化道肿瘤已有报道[1],而在肺癌中的研究甚少。我们运用免疫组化法检测P27在非小细胞性肺癌组织中的表达水平,从而探讨其在非小细胞性肺癌中的意义。 对象和方法 1.对象:56例非小细胞肺癌(NSCLC)病例均在本院接受治疗及随访。其中男42例,女14例,年龄39~77岁,平均60岁。中位随访时间2年(1~5年),56例NSCLC中,腺癌36例,鳞癌18例,腺鳞癌2例。高分化12例,中分化20例,低分化24例。第1、2年每3个月随访一次,以后每半年一次。2.方法:(1)试剂:鼠抗人P27单克隆抗体(G173-524)购自美国Pharmingen公司。羊抗鼠IgG、链菌素亲生物蛋白和过氧化物酶、3,3-二氨基联苯胺盐酸盐(DAB)均购自丹麦DAKO公司。(2)染色流程:5 μm石蜡切片脱蜡水化→过氧化氢室温处理20 min→甩干后微波抗原修复2次,每次10 min→鼠抗人P27单抗(1∶10)湿盒孵育过夜→生物素标记羊抗鼠IgG(1∶200),37 ℃湿盒温育40 min→DBA显色、复染、封片。用已知P27表达阳性的胰腺癌作阳性对照。用缓冲液(PBS)取代一抗作阴性对照。(3)染色结果判断:观察染色切片中10个具有代表性的高倍视野,其肿瘤细胞阳性数在50%以上为(+),低于50%为(-)。3.统计学方法:采用第二军医大学统计教研室统计软件SPSS软件包,运用Logistic逐步回归对P27表达与临床及病理指标的相关性进行分析;应用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析,时序检验(log rank test),根据寿命表各随访年份生存率作生存曲线。
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双单抗夹心ELISA方法检测血浆及组织中金葡菌肠毒素B
目的:细菌学研究表明,可溶性外毒素的产生是革兰阳性菌(G+菌)感染的重要标志之一,在G+菌感染性疾病的发生、发展中具有重要意义.其中金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)肠毒素和中毒性休克毒素-1(TSST-1)因其"超抗原"特性,以及它们在脓毒症和中毒性休克综合征中的特殊意义而倍受关注.本文建立了一种敏感、快速的酶免疫测定方法,用于定量检测动物体液及组织中金葡菌肠毒素B(SEB).方法:采用生物素-链亲素系统放大的双抗体夹心酶联免疫吸附方法,以SEB单抗1D2为包被抗体、生物素标记的另一种SEB单抗2D1为标记抗体进行测定.结果:在0.039~10.000μg/L浓度范围内将SEB标准品进行倍比稀释,平行测定4次.当SEB标准品浓度为0.039μg/L时,测得的平均A值仍明显高于阴性对照(分别为0.193和0.108).若以样品A值/阴性对照A值大于2(P/N>2)作为阳性判断标准,则低检出限为0.078μg/L(A=0.220).在0.078~10.000μg/L的浓度范围内,SEB标准品浓度与吸光度值线性关系良好,相关系数为r=0.9906,平均变异系数为5.32%.为了考察方法的精确度,在标准曲线适用的范围内选择3个SEB浓度(10.000μg/L、5.000μg/L和2.500μg/L),每个浓度重复测定4次,变异系数分别为6.82%、5.25%、和3.90%,平均变异系数为5.32%.回收实验显示,正常大鼠、家兔和人血浆中的平均回收率分别为96.43%、97.34%和19.99%,正常人尿液中平均回收率为91.53%.上述结果表明该方法准确性较高,可用于定性及定量检测动物血浆及人尿液中的SEB.结论:本法灵敏度高、准确性好、稳定性强,而且简便、快速,适用于动物血浆及组织中微量SEB的定量测定,并有一定的临床应用前景.
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慢性肝病和肝癌组织中CyclinD1、cdk4、Rb和P16表达及意义
作者应用免疫组化法研究慢性肝病(CLDs)和肝癌(PHC)组织中CyclinD1、cdk4、Rb和P16表达及其意义.1.资料与方法:(1)标本及临床病理资料:收集近10年我院及娄底中心医院手术切除或穿刺活检的CLDs 和PHC 病例标本,石蜡包埋切片,厚4 μm.(1)CLDs:56例,血清学检查HBsAg(+).男性35例,女性21例,平均年龄(38.5±12.4)岁;病理类型包括CPH 24例、CAH 19例和肝炎后肝硬化(LC) 13例.(2) PHC:68例,男性49例,平均年龄(42.7±10.3)岁;女性19例,平均年龄(44.6±8.5)岁;病理类型包括肝细胞肝癌(HCC)57例和胆管细胞肝癌(CHC)11例,分化程度包括高分化19例、中分化16例和低分化33例;血清学检查HBsAg(+)48例和AFP(+)41例;肿块大径≤5 cm 15例,>5 cm 53例;共有28例发生肝外转移.(2)主要试剂和方法:鼠抗人CyclinD1单抗,兔抗人cdk4、Rb和P16多抗均购自Sigma公司;生物素标记羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG及ABC试剂购自Dako公司.染色方法均为常规ABC免疫组化法,胞浆和(或)胞核含棕黄色颗粒者为阳性细胞,切片中阳性细胞率≥10%为阳性病例,<10%为阴性病例;以0.01 mol/L PBS液(pH7.4)替代一抗作为每次染色阴性对照.统计学处理包括χ2检验或直接概率法.
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基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9在壶腹癌中的基因表达及意义
肿瘤从原位增殖到侵袭转移的过程中,肿瘤细胞必须具备降解细胞外基质的能力,必须借助某些酶,使基底膜成分降解,并在有关因子的协同作用下穿透基底膜完成侵袭转移过程。其中基质金属蛋白酶是重要的一类,MMP-2和MMP-9是降解基底膜主要的基质金属蛋白酶。本组用免疫组化方法观察壶腹癌中MMP-2、MMP-9的表达,探讨其在肿瘤侵袭转移中的作用。 资料与方法 1.材料:本组壶腹癌42例,男26例,女16例,年龄30~68岁。正常壶腹8例(标本取自胰腺癌行胰十二指肠根治术)。所有标本均经手术证实或在本院病理科复查HE切片后确诊,经10%甲醛固定、石蜡包埋、4μm连续切片。根据癌细胞分裂相、核异型程度及癌细胞的排列分为高、中、低分化3组,并按美国癌症联合会(AJCC)标准进行TNM分期。 2.试剂:鼠抗人MMP-2、MMP-9单克隆抗体,胃蛋白酶、S-P试剂盒及DAB显色试剂盒为Maxin公司(美国)产品。 3.方法:采用S-P免疫组化法,切片常规脱腊水化,3% 过氧化氢洗10min,PBS洗10min。按不同抗原进行预处理,MMP-2组切片不作预处理,MMP-9组切片以胃蛋白酶消化20min。10%正常羊血清室温孵育10min;一抗(1∶75)4℃孵育过夜,PBS洗10min;生物素标记的二抗室温孵育15min,PBS洗10min;链亲和素-过氧化物酶室温孵育10min,PBS洗10min;DAB显色3~5min,流水冲洗,苏木素复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,干燥,中性树脂封片,光镜下观察结果。以已知胰腺癌阳性片为阳性对照,以PBS代替一抗为阴性对照。
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灯盏乙素生物素标记探针的合成及其抗肿瘤活性研究
目的:设计合成灯盏乙素生物素标记探针4和10,并考查其抗肿瘤活性.方法:以灯盏乙素苷元与生物素为原料,经过酯化反应、酰胺反应、水解反应、取代反应等,在灯盏乙素苷元的4'位引入生物素标记,得到灯盏乙素生物素标记探针4和10,并对其进行细胞水平的抗肿瘤活性研究.结果:合成的探针化合物及中间体均经过1 H-NMR,13C-NMR,ESI-MS进行了结构表征,确证结构与目标产物一致.细胞实验结果表明灯盏乙素生物素标记探针4和10均具有较好的抗肿瘤活性.结论:灯盏乙素生物素标记探针4和10均表现出与灯盏乙素相当的抗肿瘤活性,将为进一步的灯盏乙素抗肿瘤靶标的发现奠定基础.
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应用催化信号放大法检测Bcl-2、Bcl-XL蛋白在非霍奇金淋巴瘤中的表达及其意义
在石蜡切片的免疫组化染色中,常因被检测的抗原遭到甲醛等常用固定剂的破坏而影响到免疫组化染色效果,为此,人们一方面通过对石蜡切片进行酶消化或热处理使免疫组化检测敏感性提高,另一方面通过提高检测系统的敏感性来克服这一限制.催化信号放大(catalyzed signal amplification, CSA)法是一种新颖的,此传统的ABC、LSAB、SP法更敏感的检测系统,在我们早期的研究中称其为生物素标记酪氨法(biotinatilyted tyramine, BT法)[1].该方法的特点是利用生物素化酪氨分子结合到HRP(辣根过氧化酶)的催化位点上来达到增强信号的目的.近来,我们利用该方法的高敏感性检测了一系列凋亡相关蛋白在各类非霍奇金淋巴瘤(NHL)中的表达和分布.Bcl-2和Bcl-XL均为Bcl-2家族成员,是目前比较公认的抗凋亡蛋白,在细胞凋亡过程中起着重要的调控作用.我们应用CSA法检测Bcl-2和Bcl-XL蛋白在NHL中的表达,以探讨其在NHL发生和发展机制中的作用.
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神经病理性痛大鼠脊髓背角神经元凋亡及Bax和Bcl-2的表达
早期的组织学研究表明外周神经损伤后脊髓背角抑制性中间神经元可发生跨突触变性死亡[1],近年的研究采用末端生脱氧核糖核苷酸转移酶介导生物素标记(TUNEL)技术证实凋亡是外周神经损伤后脊髓神经元死亡的重要方式[2].
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单克隆抗CK10及CD31抗体免疫组织化学染色在羊水栓塞法医病理学诊断中的应用
羊水栓塞(amniotic fluid embolism,AFE)是分娩过程中一种罕见而严重的并发症,其发生率为1/500000,但病死率>80%[1].诊断羊水栓塞的常规方法主要进行尸体解剖,通过苏木素-伊红(HE,染色来检验肺小动脉、毛细血管中是否存在羊水中的有形成分,如角化鳞状上皮、毳毛、黏液和胎粪等.其中角化鳞状上皮检出率较高,而其他物质的检出率低[2].由于尸体解剖不及时及切片制作等原因,可导致组织自溶或血管内皮脱落于血管管腔内,给诊断带来一定的困难.因此,我们应用抗CK10、CD31单克隆抗体,对15例死亡时间在3~7 d的羊水栓塞病例的肺组织切片进行Ultrasensitive SP免疫组织化学染色,采用生物素标记的第二抗体与链霉素抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来进行检验.
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DNA探针杂交检测结核分支杆菌的研究
我们选用生物素标记了一段188bp的常链DNA探针,以碱性磷酸酶催化的显色反应检测,研究其检测结核分支杆菌基因组DNA及其PCR产物的敏感性与特异性.
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肾衰胶囊对慢性肾衰大鼠肾组织α-SMA表达的影响
1 实验材料 动物:选用雄性Wistar大鼠,体重200~240 g.购自黑龙江中医药大学实验动物中心.药物及试剂:肾衰胶囊,0.5g/粒,由黑龙江省中医研究院制剂室生产并提供(批号:黑药制字[2004]Z第0010号).尿毒清颗粒,5g/袋,广州康臣药业有限公司生产(批号:z10970122).腺嘌呤,50g/瓶,美国AMRESCO公司生产(批号:0272B31).小鼠抗大鼠α-SMA单克隆抗体,由武汉博士德生物工程公司提供.生物素标记羊抗小鼠IgA,辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRD)由北京中山生物技术有限公司提供.
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应用生物素标记与蛋白质组学方法分离鉴定弓形虫表面蛋白和分泌蛋白
目的 分离和鉴定刚地弓形虫RH株速殖子表面蛋白和分泌蛋白.方法 在绿猴肾Veto细胞株中体外培养弓形虫RH株速殖子,利用滤膜和Percoll细胞分离液分离纯化速殖子.将纯化的速殖子用生物素标记后,裂解虫体,采用亲和素凝胶珠分离生物素标记的弓形虫表面蛋白和分泌蛋白.对分离得到的蛋白进行浓缩和密度梯度凝胶电泳.将电泳条带分段切胶,回收蛋白后,酶切,应用液相色谱和两级质谱联用技术(LC-MS/MS)进行蛋白鉴定. 结果 共鉴定出785种弓形虫蛋白,其中81种为基因组注释的表面或分泌蛋白,占10.3%.785种蛋白中,检测到同一种蛋白多肽的次数(PSM值)>10的蛋白有65种,其中43种为基因组注释的表面蛋白或分泌蛋白,占66%,余22种为预测的未知蛋白. 结论 应用生物素标记和亲和素层析分离了弓形虫表面蛋白和分泌蛋白,并初步鉴定了一批潜在的弓形虫新表面蛋白和分泌蛋白.
关键词: 刚地弓形虫 表面蛋白 分泌蛋白 生物素标记 液相色谱和两级质谱联用技术 -
褪黑素受体亚型蛋白的免疫组化检测方法
1 方法介绍1.1 组织标本制备新鲜待检组织立即用4%多聚甲醇固定,常规脱水、透明、浸蜡,石蜡包埋组织,4℃冰箱贮存待检测.1.2 主要步骤将石蜡包埋组织作4 μm的连续切片,在37℃烘箱过夜.石蜡切片用二甲苯脱腊10 min×3,梯度乙醇洗2 min×3,3%过氧化氢溶液处理10 min,以阻断内源性过氧化物酶活性.蒸馏水洗2 min×3,0.01 mol/L,pH 6.0柠檬酸缓冲液微波修复抗原10 min,冷却后蒸馏水洗2 min×3,PBS洗2 min×3.每张切片加50 ml非免疫性动物血清温室孵育10 min,每张切片加50 ml 鼠抗人mt1和MT2受体亚型单克隆抗体(1∶75)置湿盒内4℃过夜,PBS洗2 min×3,每张切片加50 μl生物素标记的第二抗体温室孵育20 min,PBS洗2 min×3,切片加50 μl链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶溶液,温室孵育20 min ,PBS洗2 min×3,每张切片加新配制的液体二氨基联苯胺(DAB)显色5~10 min,流水冲洗,苏木精复染,中性树胶封片,以PBS代替第一抗体作为空白对照.
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吉兰-巴雷综合征患者血清IFN-γ及IL-4水平的研究
多数学者认为吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome,GBS)是细胞免疫和体液免疫共同介导的周围神经脱髓鞘的自身免疫性疾病.本课题采用生物素标记双抗夹心ELISA法测定GBS患者血清中γ-干扰素(IFN-γ)及白细胞介素-4(IL-4)的水平,探讨细胞因子在GBS免疫发病机制中的作用,为GBS的免疫治疗提供进一步的依据.
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顺铂对人肝癌细胞凋亡及相关基因野生型p53、p21WAF1/CIP1和c-myc表达的影响
1.材料与方法:主要试剂:人肝癌细胞株SMMC-7721引自第二军医大学,顺铂购自美国Sigma公司,生物素标记人野生型p53(wtp53)、p21WAF1/CIP1和c-myc探针为北京中山公司产品,原位杂交试剂盒购自北京医科大学病理系,细胞总RNA提取试剂盒购自华美生物工程公司.方法:(1)细胞凋亡模型的构建:用MTT比色法观察抗癌药顺铂对肝癌细胞生长的抑制作用并计算抑制率.收集不同药物浓度作用下的培养细胞,进行HE染色,倒置光显微镜下观察细胞凋亡及坏死的形态变化并计算凋亡率.不同作用点的细胞培养至预定时间,收集后离心沉淀常规提取RNA、琼脂糖凝胶电泳、紫外灯下观察并照像.
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用免疫组化ABC法的漂片法做好脑片实验的体会
ABC法是将亲和素作为桥,把生物素化的抗体与生物素结合的酶连接起来.首先,以Ⅰ抗与组织切片共孵育,使特异性Ⅰ抗与组织中的相应抗原结合,之后加上生物素标记的Ⅱ抗,Ⅱ抗与Ⅰ抗通过抗原-抗体反应结合,后加入ABC复合物,Ⅱ抗上的生物素则与ABC复合物中的亲和素上空下的位点结合.用ABC法中的漂片法做脊髓冰冻切片的染色比较容易做出结果,但如果是用此法做大鼠脑的冰冻切片染色则较难做出结果,特别是做出漂亮的脑片更难.作者在用ABC漂片法做脑组织冰冻切片的免疫组织化学实验的过程中,通过改变常规的操作步骤环节,使做出的脑片质量大为提高.以下实验技术介绍的是将免疫组化ABC法的漂片法用于脑组织冰冻切片中的几点体会.
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胰岛B细胞、A细胞的快速双染
组织学特殊染色技术及免疫组织化学技术已广泛应用于基础医学和临床医学的科研工作中.本快速染色法即用组织学醛品红染色法和免疫组织化学SP法在同一张切片上对胰岛B细胞和A细胞进行了双重染色,取得较好的效果,现作简单介绍.取大鼠胰腺,Bouin液固定,石蜡包埋,切5μm厚切片.双染步骤如下:第一步,胰岛B细胞的醛品红染色:切片脱蜡到水;入0.25%浓硫酸和0.25%高锰酸钾等量混和液中3min;蒸馏水洗后入5%草酸2min;蒸馏水洗;再经70%酒精后入醛品红染液15min;70%酒精分色后,蒸馏水洗.第二步,胰岛A细胞的免疫组化染色:将经醛品红染色后的切片,入3%甲醇双氧水室温孵育15min;蒸馏水洗后枸橼酸缓冲液(0.01M,pH6.0)(电炉加热煮沸92 ℃~98℃)进行抗原修复10min;PBS浸泡5min后,用正常羊血清室温封闭3 0min;弃去多余羊血清,滴加一抗(抗胰高血糖素抗体,1∶1500),37℃,孵育2hr;PBS室温洗10min后,滴加生物素标记的二抗,37℃,孵育40min ;PBS室温洗10min后,滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液,37℃,孵育40m in;PBS室温洗10min,DAB显色.结果及讨论:此染色方法在同一张切片上所观察到的胰岛B细胞呈蓝紫色,而胰岛A细胞呈棕黄色,两者颜色对比清晰.细胞核不着色.本方法可在一个工作日内完成,即提高了工作效率,又减少了免疫组织化学多重染色中步骤多、时间长,易受外界因素影响的限制,进而降低了非特异性染色.因此,该方法在科研工作中具有一定的应用价值.