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镉诱导HL-7702细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3的表达
镉是一种有毒的重金属元素,易在体内蓄积,镉对机体毒性效应十分复杂.肝脏是镉损伤的主要靶器官之一,目前对镉致肝细胞损伤机制尚不十分清楚.镉可诱导多种细胞发生凋亡,如大鼠肝细胞、人肝癌细胞株和原代培养的鼠肺上皮细胞等[1-6].
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解毒护肝饮药物血清对异烟肼致HepG2坏死和凋亡的干预
目的 观察解毒护肝饮药物血清对异烟肼致人肝癌细胞株(human hepatocellular carcinoma cell lines,HepG2)病变的干预,并分析其机制.方法 制备解毒护肝饮和甘草酸二铵的药物血清,建立异烟肼致HepG2细胞损伤模型,以解毒护肝饮和甘草酸二铵药物血清加入HepG2培养液,观察对HepG2坏死和凋亡的干预,以及对HepG2 Fas/FasL表达的影响,以评价解毒护肝饮的疗效机制.结果 解毒护肝饮药物血清对异烟肼致HepG2损伤有明显抑制作用,可以减少HepG2细胞凋亡和坏死,并减少其Fas/FasL表达,效果优于甘草酸二铵胶囊组.结论 以清热利湿解毒兼养阴化瘀为治法的解毒护肝饮有确切的减少异烟肼致HepG2坏死和凋亡的作用,其抗细胞凋亡作用与减少HepG2的Fas/FasL的表达有关.
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姜黄素对HepG2细胞固醇调控元件结合蛋白-2表达的影响
目的 研究姜黄素对人肝癌细胞株(Human hepatocellular liver carcinoma cell line,HepG2)固醇调控元件结合蛋白-2(sterol regulatory element-binding protein-2,SREBP-2) 基因表达的影响,从信号调控通路水平进一步探讨姜黄素的降胆固醇作用机理.方法 分别利用蛋白免疫印迹和实时荧光定量聚合酶链反应(Polymerase Chain Reactionm,PCR)技术研究姜黄素对HepG2细胞SREBP-2 核片段碱性螺旋-环-螺旋蛋白(basic helix-loop-helix protein,bHLH)表达及SREBP-2 mRNA的影响.结果 20 mol/L姜黄素可以促进HepG2细胞SREBP-2核片段bHLH增多,而对SREBP-2 mRNA 表达无影响.结论 姜黄素可以通过促进HepG2细胞SREBP-2核片段bHLH的增多,上调低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDL-R)的表达,起到降低血清胆固醇的作用.
关键词: 姜黄素 人肝癌细胞株 固醇调控元件结合蛋白-2 碱性螺旋-环-螺旋蛋白 -
乙型脑炎病毒持续感染对模型中变异株部分性状及病毒抑制实验
我们利用人肝癌细胞株KN73建立乙型脑炎(乙脑)病毒体外持续性感染模型,并探讨乙脑病毒变异株部分性状变异机理,通过病毒抑制实验和观察,提示该模型体系可为今后抗病毒药物的开发提供帮助.
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氧氟沙星、叠氮胸苷单独及与干扰素合用对黄病毒增殖的影响
选用氧氟沙星(OFLX)和叠氮胸苷(AZT)单独投入及与IFN并用,观察其抗病毒活性结果如下: 1 材料和方法 1.1 病毒和细胞所用黄病毒为乙型脑炎病毒JEV的JaGAr-01株。细胞是人肝癌细胞株HepG2。细胞培养所用培养液为DMEM加10%胎牛血清(FCS)。 1.2 感染病毒病毒感染剂量为l0 m.o.i(multiplicityinfection),37℃吸附60min,在5%CO2孵箱中培养。将各种浓度的药物添加至含病毒的细胞培养液中,24h后采取培养上清液,测定病毒的含量。 1.3 病毒滴定用空斑形成方法。将含有病毒的培养上清液按比例稀释,在24孔培养板内单层培养的仓鼠肾细胞株BHK上,添加0.6%的甲基纤维素液和含有1%FCS的MEM培养液,3d后用甲醇固定,l%结晶紫染色,计算空斑数。
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人肝癌细胞株的特性及其实验应用
当前,原发性肝癌是我国高发的恶性肿瘤,死亡率高,治疗困难,对其研究一直是热点.然而,考虑到人道主义精神,肝癌相关研究无法直接在人体上进行.人肝癌细胞株模型的建立打破了这一瓶颈,其来源于人肝癌患者组织,具有一套完整的人体遗传基因,传代较稳定,是合适的实验对象.本文介绍了目前实验中常用的人肝癌细胞株SMMC7721、Bel-7402、MHCC97、HepG2、Hep3B、Huh-7、PLC/PRF/5的来源、特性,与肝癌细胞株的优势、作用、实验应用,希望能有助于该领域的研究.
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IRES特异性IRNA对HCV IRES启动蛋白翻译细胞内抑制作用
目的:研究核糖体内部进入位点(internal ribosome entry site,IRES)特异性抑制性RNA(inhibitor RNA,IRNA)细胞内对丙型肝炎病毒(HCV)IRES介导蛋白翻译的抑制作用.方法:体外应用脂质体细胞转染法,将IRNA及其突变体mIRNA真核表达载体pcRz-IRNA/pcRz-mIRNA转染人肝癌细胞株(HHCC),经G418筛选4 wk后建立IRNA及mRRNA表达株;以相同的方法构建pcHCVcluc转染株;以脂质体介导细胞转染法将pCMVNCRLuc转染IRNA及mIRNA细胞株,于转染后48 h检测荧光素酶表达量;将IRNA及mIRNA真核表达体转染pcHCVcLuc表达株,于转染后不同时间检测荧光素酶表达量.结果:HCVIRES介导蛋白翻译在IRNA表达株明显受到抑制,同样IRNA对HCV翻译复制子的蛋白翻译作用有明显抑制性;突变体mIRNA表达株和空载体对照株中未见相似的抑制性.结论:pcHCVcluc在HHCC细胞中获得有效表达;IRES特异性IRNA能有效的抑制HCVIRES介导细胞内蛋白翻译作用.
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GnRH类似物诱导肝癌细胞凋亡的体外研究
目的:研究GnRH类似物阿拉瑞林诱导体外培养的人肝癌细胞株SMMC-7721发生凋亡的作用,为GnRH类似物用于肝癌的内分泌治疗提供实验资料.方法:采用MTT法、形态学透射电镜观察和末端脱氧核苷酸标记法观察被阿拉瑞林处理后的SMMC-7721细胞的形态学和生化等指标的变化.结果:MTT法研究结果表明阿拉瑞林在10-9 mol/L浓度时即可诱导7721细胞凋亡,并呈量-效效应.透射电镜下可观察到早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞以及核染色质浓缩并见凋亡小体.末端脱氧核苷酸转移标记法进一步证实阿拉瑞林可以诱导肝癌细胞凋亡并可见凋亡小体;与对照组相比,阿拉瑞林处理后TUNEL凋亡指数显著增加(0.29±0.06vs0.11±0.03,P<0.05).结论:GnRH类似物可诱导体外培养的肝癌细胞株SMMC-7721发生凋亡,从而提示GnRH类似物对人肝细胞性肝癌具有潜在的治疗作用.
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腺病毒增强转铁蛋白受体介导的针对突变型P53的大酶转染可促进肝癌细胞凋亡
目的:通过腺病毒增强的转铁蛋白受体介导法(AVET)将针对突变型p53(mtp53)的大酶(Maxizyme)基因转入肝癌细胞后篌对肝癌细胞凋亡的影响,探索AVET用于肝癌基因治疗的可行性,为肝癌的基因治疗探索一条新途径.方法:以带有mtp53基因的人肝癌细胞株MHCC97细胞为模型,用腺病毒增强转铁蛋白受体介导法将针对mtp53的pEGFP-Maxizyme基因和空载体pEGFP分别导入MHCC97细胞,荧光显微镜观察细胞转染情况,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测mtp53 mRNA表达水平的变化,DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测转染后对细胞凋亡的影响.结果:转染后48h荧光显微镜下可见呈细胞形态的绿色荧光.收集细胞检测,实验组mtp53 mRNA表达水平与空载体组和空白对照组相比,基因扩增条带亮度明显减弱,mRNA表达水平下降(P<0.05);DNA琼脂糖凝胶电泳出现典型的凋亡梯带(DNA Ladder);流式细胞仪分析显示细胞凋亡水平增高,凋亡指数22.95%,显著高于对照组的2.37%(P<0.05).结论:腺病毒增强转铁蛋白受体介导的基因转移系统可将pEGFP-Maxizyme有效的转染到肝癌细胞株MHCC97中,Maxizyme在细胞内成功的切割了mtp53 mRNA,促进了肝癌细胞的凋亡,这为腺病毒增强转铁蛋白受体介导法在肝癌基因治疗中的应用提供了实验依据,也为肝癌的基因治疗提供了一条新途径.
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三氧化二砷抑制肝癌细胞端粒酶表达及诱导细胞凋亡作用
目的:观察三氧化二砷对体外培养的人肝癌细胞株细胞端粒酶表达和细胞生长抑制的影响及诱导细胞凋亡的作用,探讨三氧化二砷的抗肿瘤作用及机制.方法:采用噻唑蓝比色分析法(MTT法),流式细胞分析,原位杂交方法以及TUNEL原位末端标记法观察和检测了不同浓度的三氧化二砷对人肝癌细胞株(SMMC-7721)细胞的增生,细胞DNA含量的分布,细胞端粒酶表达的影响及细胞凋亡的诱导作用.结果:20,5,5 μmol/L三氧化二砷在24,48,72 h时抑制率分别为22.0%,25.7%,32.0%,均能明显抑制人肝癌细胞株细胞的增生(单侧置信区间为10.1,23.7,18.0,P<0.05).流式细胞分析显示加药组G0/G1期细胞比例减少,S期细胞所占比例增高.随着药物浓度的增加细胞端粒酶的表达下降,而凋亡细胞数增加.结论:三氧化二砷能抑制人肝癌细胞增生,其抑制作用具有时间-计量效应关系,并能抑制肝癌细胞端粒酶的表达及诱导肝癌细胞凋亡.
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CD95配体分子诱导人肝癌细胞凋亡的作用
目的:探讨CD95 L在肝癌细胞凋亡过程中的作用.方法:ELISA法对慢性乙型肝炎、肝炎肝硬化与肝癌患者血清可溶性CD95 L(sCD95L)水平进行了初步检测,构建了人CD95 L的重组真核表达体pcDNA3.1hisB-CD95 L,将pcDNA3.1hisB-CD95 L转染至人肝癌细胞株HepG2细胞,采用Annexin V/PI双染后双变量流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:sCD95L在肝癌患者明显低于肝炎及肝硬患者,构建的表达重组体pcDNA3.1hisB-CD95 L经菌落PCR和限制性酶切消化有预期的目的片段出现,DNA序列分析证实CD95 L完整、正确插入,转染后的HepG2细胞细胞凋亡率为36.30%;未转染CD95L的对照组细胞凋亡率11.53%.结论:CD95L可使肝癌细胞凋亡.
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survivin反义寡核苷酸对肝癌细胞生长抑制作用的研究
目的:采用反义寡核苷酸封闭肝癌细胞中survivin基因的表达,研究其对肝癌细胞生长的抑制作用.方法:针对survivin mRNA翻译起始位点设计并合成反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASODN);采用脂质体介导survivin ASODN转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,western-blot及原位杂交方法检测survivin蛋白及mRNA表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化,检测转染前后细胞贴壁率及细胞生长抑制率变化,绘制细胞生长曲线.结果:脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染肝癌细胞后survivin蛋白及mRNA表达分别从69.59及75.61降低至10.71及22.94,细胞贴壁率从90.68%降低至33.16%,细胞凋亡率从0.7%增加至31.35%,均有显著差异.转染后对细胞生长的抑制作用可以维持大约1 wk,在转染后第3 d抑制率高可达71.8%.结论:脂质体介导转染survivin反义寡核苷酸可以有效降低细胞内survivin基因的表达,诱导细胞发生凋亡,抑制肝癌细胞生长.
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反义核酸逆转人肝癌细胞株多药耐药性的效应
化疗是原发性肝癌晚期病人和术后肝癌复发的主要治疗手段之一,但是肝癌病人对多数化疗药物易产生多药耐药性(multidrug resistance,MDR),导致化疗失败.本研究利用反义RNA技术采用重组腺病毒AdEasy系统,构建了携带反义多药耐药基因片段的重组腺病毒,观察反义核酸对MDR的逆转效应,报告如下.
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10-HCPT对人肝癌细胞HepG2体外生长及凋亡的影响
我们观察了10-羟基喜树碱(10-HCPT)对人肝癌细胞株HepG2体外生长及其凋亡率的影响,为10-HCPT在肝癌辅助治疗中的应用提供了实验依据.
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RNA干扰封闭AKT2增加人肝癌细胞对吉西他滨敏感性的研究
细胞凋亡的抑制可参与恶性肿瘤的进展和化疗药物耐药性的产生.因而诱导肿瘤细胞凋亡已成为目前治疗恶性肿瘤的一项重要生物学策略.AKT2在体外培养的细胞中及体内均有阻止细胞凋亡的作用.为了探讨靶向封闭AKT2蛋白在肝细胞癌治疗中的意义和价值,我们建立AKT2表达减少的稳定细胞株SMMC7721-AKT2-shRNA,观察其对药物敏感性的变化.材料与方法1.主要试剂:兔抗人AKT2多克隆抗体购自CST公司、兔抗人bax多克隆抗体、兔抗人bcl-2多克隆抗体均购自SantaCruz公司;吉西他滨(Gem)购自Lilly公司;Supersilencing质粒购自上海吉玛制药有限公司;人肝癌细胞株SMMC7721苏州大学附属第一医院血研所提供.
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血管内皮生长因子反义寡核苷酸及抗KDR抗体对人肝癌细胞系HHCC的生长抑制作用
本研究采用VEGF反义寡核苷酸(oligodeoxynucleotide, ODN)抑制VEGF分泌及抗KDR抗体封闭KDR的方法,观察它们对体外培养的肝癌细胞系HHCC细胞生长情况的影响,以探讨VEGF及其受体在肝细胞癌中的作用.材料与方法1.细胞株:人肝癌细胞株HHCC由第四军医大学病理学教研室863课题组保存并提供,培养于含100*!ml/L胎牛血清的RPMI-1640培养液中.
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生长抑素对人肝癌细胞株BEL-7402血管内皮生长因子表达与合成的影响
研究表明生长抑素可以抑制肿瘤细胞血管内皮生长因子(VEGF)的释放[1-3],其机制涉及多种受体后信号传导途径[4,5],本实验以体外培养的人肝癌BEL-7402细胞株为研究对象,观察生长抑素类似物奥曲肽对肝癌细胞VEGF表达与合成的影响,并初步探讨其作用机制.
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乙型肝炎病毒X蛋白对人肝癌细胞hsp90α基因表达调控机制研究
目的:探讨乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)参与人肝癌细胞hsp90α基因表达的调控机制.方法:采用半定量RT-PCR、蛋白质印迹法及荧光素酶活性检测技术,检测不同剂量HBx表达载体转染的HepG2细胞中hsp90α基因mRNA和蛋白表达及启动子活性的变化,并观察转录因子c-Myc阻断剂10058-F4对上述效应的影响.采用启动子实验分析c-Myc对hsp90α基因启动子的激活作用.RT-PCR和蛋白质印迹法检测表达HBx的HepG2细胞中c-Myc mRNA和蛋白表达情况;蛋白质印迹法及ELISA分析细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)表达水平及内源性ERK的活性.结果:HBx基因转染HepG2细胞中hsp90α基因的mRNA和蛋白表达水平以及启动子活性呈剂量依赖性增强,P=0.006 1;c-Myc阻断剂抑制了HBx对hsp90α基因表达的上调效应.c-Myc通过与c-Myc位点(-1094/-1088)结合转录激活hsp90α基因启动子活性.HBx使HepG2细胞中c-Myc mR-NA和蛋白表达增强,并伴有ERK1/2蛋白磷酸化水平增加,ERK活性明显提高,P=0.032.结论:HBx通过ERK信号通路反式激活肝癌细胞c-Myc介导的hsp90α基因启动子活性,从而上调hsp90α基因表达.
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炎症状态下阿托伐他汀对HepG2细胞氧化应激和脂质积聚的影响
目的 研究阿托伐他汀在炎症状态下对人肝癌细胞株HepG2细胞氧化应激和脂质积聚的影响.方法 将普通HepG2细胞分为为3组:正常组、模型组[用100 ng·mL-1肿瘤坏死因子(TNF-α)处理]及实验组(用100 ng·mL+1TNF-α +10 μmol·L-1阿托伐他汀处理),3组同时负荷100 μg·mL-1低密度脂蛋白(LDL),处理时间24h-用油红O染色测定细胞内脂质含量;以荧光定量聚合酶链式反应和免疫印迹法分别检测HepG2细胞脂肪酸合酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)的基因和SREBP1蛋白表达;以二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针染色检测HepG2细胞内活性氧化产物(ROS)的含量;以比色法检测HepG2细胞过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)的含量.结果 正常组与模型组SREBP1蛋白灰度值分别为1.01±0.001,1.61±0.34,这2组的SREBP1 mRNA水平分别为1.01±0.16,3.61 ±0.39,这2组的FAS的mRNA水平分别是1.03 ±0.32,1.99±0.36,这2组的ACC的mRNA水平分别是0.95±0.29,2.37±0.52.与正常组相比,模型组的细胞FAS、ACC、SREBP1的基因和SREBP1的蛋白表达明显增加,差异均有统计学意义(均P <0.05).与模型组相比,实验组的HepG2FAS、ACC、SREBP1的基因和SREBP1的蛋白灰度值分别是2.95±0.92,3.99 ±1.16,2.85 ±0.91,2.94 ±0.65,实验组的HepG2 FAS、ACC、SREBP1的基因和SREBP1的蛋白表达明显增加,差异均有统计学意义(均P<0.05).表明在炎症状态下,阿托伐他汀进一步加重了HepG2细胞内脂质的沉积.正常组、模型组与实验组的细胞ROS含量(以荧光强度代表)分别为1.00 ±0.20,1.77±0.25,3.20±0.53;正常组、模型组与实验组的H2 O2含量分别为(2.30±0.31),(4.32±0.77),(5.31±0.75) nmol·mg-1;这2组的MDA含量分别为(0.78±0.22),(1.86±0.23),(3.43±1.15)nmol·mg-1,与正常组比较,模型组差异均有统计学意义(均P <0.05);与模型组比较,实验组差异均有统计学意义(均P <0.05).结论 在炎症状态下,阿托伐他汀诱导HepG2细胞氧化应激,激活SREBP1/FAS/ACC通路,加重细胞内脂质积聚.
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复尔康注射液对人肝癌细胞株及裸鼠移植瘤的抑制作用
目的:研究复尔康注射液对人肝癌细胞株增殖及裸鼠移植瘤生长的影响.方法:采用CCK8试剂盒检测复尔康注射液对人肝癌细胞株SMMC-7721和BeL-7402增殖的抑制作用;建立SMMC-7721细胞裸鼠移植瘤模型,通过比较肿瘤体积(tumor volume,TV)、相对肿瘤体积(relative tumor volume,RTV)和相对肿瘤增殖率(T/C)考察复尔康注射液对肿瘤生长的影响.结果:复尔康注射液对SMMC-7721和BeL-7402的IC50分别为(61.51±1.58),(68.39±7.16)mg·L-1;不同剂量复尔康注射液能够不同程度地抑制裸鼠移植瘤的生长,与阴性对照组比较,P<0.05.低、中、高剂量复尔康注射液组(0.065,0.130,0.260 g·kg-1)T/C分别为57.75%,39.9%和44.08%.结论:复尔康注射液体外能抑制人肝癌细胞株的增殖,体内能明显抑制SMMC-7721细胞裸鼠移植瘤的生长.