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冷血和温血动物血吸虫28S rRNA基因的扩增和酶切片段分析
用特异性引物扩增日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、龙江血居吸虫(Sangunicola lungensis)的成虫和尾蚴和士耳其斯坦东毕吸虫尾蚴28S rRNA基因片段,并且用Taq I和Hae III两种限制性内切酶对前两者进行酶切,凝胶成像分析结果表明日本血吸虫和东毕血吸虫在该基因片段扩增产物大小表现高度一致,日本血吸虫和龙江血居吸虫在该基因片段的酶切产物存在明显差异,在基因水平证实血吸虫类群中,寄生温血动物同属裂体科的日本血吸虫、东毕血吸虫与寄生冷血动物的血居科吸虫相比,前两者有着非常相近的亲缘关系.龙江血居吸虫成虫在PCR扩增过程中,除了出现1条1 227 bp的主带外,还呈现1条962bp的弱带,在尾蚴则并未出现,单链构象多态性分析(SSCP),日本血吸虫成虫和尾蚴带型一致,龙江血居吸虫成虫呈现出至少3条条带,而其尾蚴表现出清晰的2条条带,进一步证实在发育过程中,龙江血居吸虫虫体间存在有该重复序列的变异.
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微小按蚊复合体Rdna-ITS2序列差异及遗传多态性研究
本研究对我国微小按蚊广西、云南、海南6个地理株和越南Caonguen株rDNA-ITS2 PCR扩增片段和序列差异作分析,获得基因片段总长为561bp~563bp,发现地理株间ITS2序列差异程度不同,分析表明元江株为微小按蚊C型;其余6个地理株为A型.应用限制性内切酶Sau96Ⅰ对微小按蚊复合体rDNA-ITS2 PCR扩增片段作酶切分型,结果同样显示两型差异,从而简化微小按蚊复合体分类方法.
关键词: 微小按蚊复合体 rDNA-ITS2 PCR 遗传多态性 限制性酶切 -
微卫星DNA标记技术及其在蚊虫生物学研究中的应用
遗传标记是指用来区分不同的个体或群体,能够稳定遗传的物质或性状,是研究生物遗传学、发育生物学及分类学的重要工具.遗传标记经历了不同的发展阶段,20世纪70年代以来,随着限制性内切酶的发现和DNA重组技术的创立,遗传标记的研究重点转向遗传信息的载体--DNA分子,出现了多种分子遗传标记.常用的DNA分子标记技术有:DNA限制性酶切长度多态性(RFLP);数量可变的串联重复序列(VNTR)(主要包括微卫星和小卫星)分析;DNA序列分析以及基于PCR的随机扩增DNA多态性(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)和单链构象多态性(SSCP)等分析技术.DNA分子遗传标记,特别是微卫星DNA与其他遗传标记相比,具有稳定性高、信息含量高、种群中分布广泛等优点,正日益受到人们的重视.
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输血后HCV感染血清病毒含量及基因型与临床转归的关系
目的:了解我国输血后HCV感染病毒含量及基因型与疾病转归的关系.方法:对河北省某农村314例单采浆献血员HCV感染后的现状调查,包括临床表现、血清肝酶、病毒学标志检测以及B型超声检查,其中,HCV RNA的测定采用荧光定量PCR方法,HCV基因分型采用5'端非编码区限制性酶切长度多态性分析.结果:本调查组HCV感染的慢性化率为57.6%,自然阴转率为42.4%.314例感染者目前几乎均无症状,总的ALT的异常率为40.2%.HCV RNA含量变化与ALT水平高低呈正相关性(r=0.346,P<0.001).HCV基因Ⅱ型感染者HCV RNA含量和血清ALT均显著高于HCV基因Ⅲ型感染者(P<0.001).男性感染者的慢性化率高于女性感染者(66.7%vs50.4%).结论:本组输血后HCV感染自然阴转率较高,慢性HCV感染表现隐匿,肝酶学检查指标大多轻度到中度异常.HCV基因Ⅱ型感染者HCV RNA含量和血清ALT均显著高于HCV基因Ⅲ型感染者.男性感染者的慢性化率高于女性感染者.
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CD95配体分子诱导人肝癌细胞凋亡的作用
目的:探讨CD95 L在肝癌细胞凋亡过程中的作用.方法:ELISA法对慢性乙型肝炎、肝炎肝硬化与肝癌患者血清可溶性CD95 L(sCD95L)水平进行了初步检测,构建了人CD95 L的重组真核表达体pcDNA3.1hisB-CD95 L,将pcDNA3.1hisB-CD95 L转染至人肝癌细胞株HepG2细胞,采用Annexin V/PI双染后双变量流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:sCD95L在肝癌患者明显低于肝炎及肝硬患者,构建的表达重组体pcDNA3.1hisB-CD95 L经菌落PCR和限制性酶切消化有预期的目的片段出现,DNA序列分析证实CD95 L完整、正确插入,转染后的HepG2细胞细胞凋亡率为36.30%;未转染CD95L的对照组细胞凋亡率11.53%.结论:CD95L可使肝癌细胞凋亡.
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半巢式MSP在急性白血病患者p15基因甲基化检测中的应用
传统的观点认为,基因的缺失和突变是基因失活的主要方式,近研究显示,基因异常甲基化所导致的基因沉默亦是基因失活的方式之一.在多种恶性血液病中,p15基因发生异常的主要途径是基因异常甲基化和缺失.目前国内文献上p15基因甲基化的检测方法主要集中在甲基化敏感限制性酶切和Herman等[1]总结的甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)方法.我们通过优化MSP方法,设计了p15基因的半巢式-MSP(Hn-MSP)引物对85例急性白血病(AL)患者进行了p15甲基化状态的检测.
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人钠/碘转运体354位点基因突变与先天性甲状腺功能减退症的相关性研究
我们于2001年12月~2003年1月,采用聚合酶联反应-限制性酶切技术,对青岛地区先天性甲状腺功能减退症(CH)患者中是否存在人钠/碘转运体(hNIS) 基因354位点突变及其基因型频率进行研究.
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RT-nested PCR和限制性酶切分析用于HV的检测和基因分型
为建立检测肾综合征出血热(HFRS)患者血清中汉坦病毒(HV)基因的RT-nested PCR方法,并进一步进行限制性酶切分型,设计并合成互补于HV S基因片段的引物,对78例HFRS患者血清进行RT-nested PCR检测,并对PCR产物进行酶切分析。结果显示,阳性率分别为76%(≤7天)、 67% (8~14天)、43%(15~21天)和29%(>21天)。48例检测阳性患者PCR产物酶切分型,47例为Ⅰ型,1例为Ⅱ型。提示RT-nested PCR用于早期HFRS患者的HV基因检测,具有直接、敏感、特异等优点,其产物的限制性酶切分型能快速准确地区分国内当前流行的主要HV毒株型别。
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菌落PCR快速分析抗体库重组率时的假阳性现象
目的评价菌落PCR法鉴定噬菌体抗体库阳性重组率的可靠性. 方法鼠抗体基因Lc片段、Fd片段经酶切、纯化后,依次克隆入pComb3载体上相应的酶切位点,电转化XL1-blue菌后建立鼠源性Fab噬菌体抗体库.比较菌落PCR法、质粒PCR法及质粒酶切法鉴定转化菌阳性重组率的一致性.同时用空菌、空载体、空载体菌等作模板为对照PCR,以排除相关组分的干扰. 结果建立的Lc库的库容为1.175×106CFU, Fab库的库容为1.02×106CFU.3种方法鉴定的阳性重组率不同(Lc的重组率依次为100%、78%、78%,Fd的重组率依次为90%、66%、66%,Lc与Fd同时插入的重组率依次为90%、50%、50%).菌落PCR法鉴定的重组率偏高,存在假阳性现象.对照PCR提示,XL1-blue菌本身可能是导致假阳性扩增的原因. 结论用菌落PCR法不能准确鉴定噬菌体抗体库的重组率,用质粒PCR法或质粒酶切法鉴定更为可靠.
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肺癌组织中EB病毒致癌相关基因BNLF1检测意义初探
许多研究表明Epstein-barr病毒(EBV)感染与鼻咽癌、非洲Buikitt淋巴瘤、霍奇金病等恶性肿瘤的发生密切相关.近年来,国内外对EBV与肺癌相关性研究渐多,但仍无定论. 笔者采用独立设计引物的PCR方法、限制性酶切分析法等检测肺癌中EBV-BNLF1基因,从基因水平上对EBV与肺癌关系进行初步探讨.
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3种常用单核苷酸多态性检测方法的应用比较
目的:通过比较变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、单链构像多态性(single-stranded conformational polymorphisn,SSCP)、限制性酶切检测单核苷酸多态性(single nucleotide po1ymorphism,SNP)的优缺点,为不同条件下选择适合的SNP检测方法提供借鉴.方法:DGGE、限制性酶切检测150例大肠癌APEX基因第3外显子,SSCP检测第5外显子,后结果经直接测序验证.结果:DGGE检测出17例异常泳动条带;测序结果证实该17例均存在1247A→G的SNP;SSCP检测到57例异常条带;经直接测序证实38例有2197T→G的SNP;PCR-限制性酶切结果与DGGE所测结果完全吻合.结论:DGGE检测结果无假阳性,重复性好,准确率高,而且可判断基因型;SSCP简便易行,但存在假阳性与假阴性,而且不能判断基因型;限制性酶切对SNP位点检测及基因分型均能进行较准确的判断.
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临床诊断中的实时PCR技术(文献综述)
目前,DNA分析技术已被广泛应用于临床,包括分子遗传学、肿瘤学、微生物学、血液学及免疫学,其中许多技术依赖于靶分子的PCR扩增及扩增后分析,如限制性酶切与凝胶电泳以检测特异性扩增片段.这种定性检测重复性差,可靠性低,易给临床诊断带来混乱,而实时PCR的出现实现了DNA的定量分析,明显提高了诊断的特异性、灵敏度,快速、简单、自动、有效.有多种反应平台可以完成实时PCR分析,如Roche Light Cycler、ABI Prism7700、PE5700和超速热循环仪等.
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江苏省肠出血性大肠埃希菌O157的基因PCR-RFLP分型研究
目的 对历年从江苏省不同地区分离的肠出血性大肠埃希菌O157(以下简称:O157)进行分型分析.方法 采用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)方法对108株O157分子分型,比较不同地区、不同年份菌型差异.结果 根据EcoRV限制性酶切图谱可将菌株分成JS01-JS10十个不同的型别.主要菌型JS01占64.9%,JS02型与JS01型菌株酶切图谱相似度很高,JS03和JS04型菌株数目较少(12株),但近一半属于人源菌株.从时间方面看,1999年分离的菌型多;从地区方面看,铜山县分离到的菌株型别为多样化.结论 不同菌型之间的致病性存在差异,菌株与地理来源的关系密切.PCR-RFLP方法操作简便、重复性好,为O157的流行病学研究提供了一条全新途径.
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美国首次报道腺病毒(基因型7d2)的暴发感染
近,美国Gerber等在Clin Infect Dis上发表文章,首次报道腺病毒Ad7d2的暴发感染.该次暴发感染发生于三年前美国的一所儿科慢性病医院和一所三级医院(A医院),分离到腺病毒血清型为7型(Ad7),基因型为d2,证实暴发感染的病原是Ad7d2(Clin Infect Dis,20 01,32∶694).人类腺病毒感染的临床严重程度差异很大.腺病毒至少有49种血清型,致病力各不相同.Ad7致病力较强,可导致急性呼吸道感染、咽结膜热、肺炎和中枢神经系统感染.感染通常发生于儿童,急性感染可产生呼吸系统后遗症.免疫功能低下者和有心、肺疾病者可发生Ad 7播散性感染和危及生命的感染.暴发感染常发生于居住拥挤的地区.儿科慢性病医院共有93例神经系统严重受损的患儿,年幼和重症者住在二楼.该中心基线死亡率为0-2/月.腺病毒感染的诊断依据是:发热大于或等于37.2℃,有呼吸道感染表现和( 或)结膜炎.患儿发病后送A医院治疗.该院医护人员腺病毒感染的诊断依据是:结膜炎或≥2种呼吸道症状.收集腺病毒感染患儿的鼻咽分泌物和医护人员感染者的鼻咽、口咽和(或)眼分泌物 ,接种至MRC-5和A549细胞系,培养分离病毒,用型特异性标准抗血清确定病毒血清型,用限制性酶切分析法确定病毒基因型.结果表明,93例患儿中31例诊断为腺病毒感染,其中11例分离到腺病毒,死亡8例.42名医护人员中36例诊断为腺病毒感染,5例分离到腺病毒.另有1例5月龄的支气管软化和呼吸道合胞病毒感染患儿在住院期间发生了腺病毒感染.患儿腺病毒感染的危险因素是年龄小于47 岁、行气管切开和居住在二楼.研究者认为,腺病毒可以通过呼吸道分泌物迅速地在人群中传播.儿童缺乏保护性抗体,较成人易感.接触预防、呼吸道隔离和勤洗手有助于感染的控制.Ad7感染有望通过疫苗预防.摘自<中国医学论坛报>2001年8月9日12版
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三种全血提取基因组DNA方法的比较及Genomix方法的改良
目的:选择一种高效、简便快速、价格合适的从全血中提取基因组DNA的方法.方法:分别采用3种不同的方法从全血中提取基因组DNA,比较了3种方法提取的DNA的质量,以及各种方法所需时间及其费用.对其中的一种方法进行了改良.结果:3种方法提取的DNA的质量都能达到相关分子生物学实验的要求,但在操作程序、价格等方面存在差别.结论:Genomix法操作简单、快速、灵活性好、价格便宜,适合于大样本的DNA提取.
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青岛地区献血者人疱疹病毒7型感染的调查
我们应用巢式PCR技术,结合限制性酶切检测138名健康无偿献血者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)和唾液标本中的人疱疹病毒7型(HHV-7)DNA,并分析检测结果,以调查献血者HHV-7的感染状况,探讨HHV-7感染与献血者性别、年龄和血型的相关性,并与献血者HHV-6的感染状况做了比较[1],现报告如下.
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青岛地区献血者人疱疹病毒6型感染的调查
笔者应用巢式PCR(nested-PCR)技术,结合限制性酶切分析检测138名健康无偿献血者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)和唾液标本中人疱疹病毒6型(HHV-6)DNA,并对检测结果综合分析,以调查献血者HHV-6的感染状况,探讨HHV-6感染与献血者性别、年龄和血型的相关性,现报告如下.