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鼠疫耶尔森菌rRNA基因识别特征研究
目的 分析鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)的rRNA基因识别特征.方法 通过比较基因组学方法,利用Clustal W软件,对目前已完成全基因组测序的9株鼠疫菌的rRNA基因序列进行分析,分别比对rRNA基因簇两侧的2000bp序列、基因簇内16S、23S、5S rRNA及16S～23S基因间隔区序列,以确定鼠疫菌rRNA基因的识别特征.结果 菌株D182038、D106004、Z176003和CO92分别有6个rRNA基因簇拷贝(6拷贝菌株),菌株91001、KIM、Nepa1516、Antiqua和Pestoides F分别有7个rRNA基因簇拷贝(7拷贝菌株).按照两侧2000bp序列不同,可将鼠疫菌rRNA基因簇分成13种类型,并可将6拷贝与7拷贝菌株进行区分;16S～23S rRNA基因间隔区含有4种不同种类和数量的tRNA基因,可将6拷贝菌株和7拷贝菌株分别进行区分;23S rRNA基因在不同菌株间及不同rRNA拷贝间的碱基突变数方差分析显示,各菌株间F=0.548,P=0.815>0.05;各拷贝间F=5.228,P<0.01.结论 鼠疫菌rRNA基因簇两侧序列、间隔区tRNA基因和23S rRNA基因可作为识别不同菌株和不同rRNA基因簇拷贝的指标,将鼠疫菌不同菌株进行分类.
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小秦艽rRNA基因内转录间隔区测序鉴定的初步研究
目的:对小秦艽种籽中提取的DNA中rRNA基因内转录间隔区进行碱基序列测定,以期从分子水平建立对秦艽种籽的鉴定标准.方法:常规提取小秦艽种籽DNA,利用合成的特异性引物对其DNA中rRNA基因内转录间隔区进行套式PCR扩增,将扩增产物以四色荧光标记的双脱氧末端终止循环法进行碱基序列测定.结果:经琼脂糖凝胶电泳证实 rRNA基因内转录间隔区 PCR 扩增产物存在,测序后得到了小秦艽种籽 rRNA基因内转录间隔区的碱基序列.结论:rRNA 基因内转录间隔区的碱基序列可作为分子水平鉴定植物性中药材的又一途径.
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冷血和温血动物血吸虫28S rRNA基因的扩增和酶切片段分析
用特异性引物扩增日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、龙江血居吸虫(Sangunicola lungensis)的成虫和尾蚴和士耳其斯坦东毕吸虫尾蚴28S rRNA基因片段,并且用Taq I和Hae III两种限制性内切酶对前两者进行酶切,凝胶成像分析结果表明日本血吸虫和东毕血吸虫在该基因片段扩增产物大小表现高度一致,日本血吸虫和龙江血居吸虫在该基因片段的酶切产物存在明显差异,在基因水平证实血吸虫类群中,寄生温血动物同属裂体科的日本血吸虫、东毕血吸虫与寄生冷血动物的血居科吸虫相比,前两者有着非常相近的亲缘关系.龙江血居吸虫成虫在PCR扩增过程中,除了出现1条1 227 bp的主带外,还呈现1条962bp的弱带,在尾蚴则并未出现,单链构象多态性分析(SSCP),日本血吸虫成虫和尾蚴带型一致,龙江血居吸虫成虫呈现出至少3条条带,而其尾蚴表现出清晰的2条条带,进一步证实在发育过程中,龙江血居吸虫虫体间存在有该重复序列的变异.
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龙江血居吸虫和日本血吸虫的RAPD分析
龙江血居吸虫(Sangunicola lungensis)和日本血吸虫(Schi st osoma japonicum)依次为冷血动物和温血动物血吸虫的重要代表种类.分别对日本血吸虫与龙江血居吸虫成虫和尾蚴全基因组进行RAPD标记研究,筛选出14种随机引物对4种材料扩增得到150条多态片段,其中日本血吸虫成虫和尾蚴之间的同源性为0.609;龙江血居吸虫成虫和尾蚴之间的同源性为0.617,两种血吸虫成虫之间的同源性为0.148,尾蚴之间为0.1 45.说明了冷血和温血动物血吸虫,它们具有相近的遗传背景,同时揭示了同一种血吸虫, 其成虫和尾蚴阶段存在一定的多态性,反映出在虫体发育过程中,基因组的结构可能发生变化.根据28S rRNA特定基因片段的RAPD分析,筛选出对两种血吸虫不同发育阶段具有特异性的扩增引物,进一步说明同一种血吸虫在不同发育阶段28S rRNA基因片段存在的差异.
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我国北方蜱中人粒细胞埃立克体16S rRNA基因的检测
本文应用人粒细胞埃立克体病(HGE)的病原体的16S rRNA基因序列的特异引物对采自我国北方地区的一些蜱标本进行扩增,首次从内蒙古大兴安岭采集的全沟硬蜱、森林革蜱和嗜群血蜱,以及从新疆精河采集的全沟硬蜱和草原革蜱中扩增出该病原体的16S rRNA基因片段.所测出的967 bp序列与美国HGE株(GenBank U02521)的同源性为100%.
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鼠疫耶尔森氏菌16S-23S rRNA基因间区的酶切位点分析
目的:了解鼠疫耶尔森氏菌16S-23S rRNA基因间区的酶切位点分布情况.方法:PCR扩增及限制性内切酶分析.结果:对EV菌及不同来源的103株鼠疫耶尔森氏菌16S-23S rRNA基因间区进行了扩增,选用限制性内切酶Taq Ⅰ及Msp Ⅰ对扩增产物进行酶切分析,结果发现所用鼠疫耶尔森氏菌该间区扩增产物及酶切图谱一致;选用Taq Ⅰ+Msp Ⅰ,Hinf Ⅰ+Msp Ⅰ对EV菌16S-23S rRNA基因间区扩增产物进行了双酶切分析,作出了Taq Ⅰ,Msp Ⅰ,Hinf Ⅰ在EV菌该间区的酶切位点图.结论:鼠疫耶尔森氏菌16S-23S rRNA基因间区相当保守;酶切位点分析为对该区进行进一步研究打下了基础.
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七日热型、澳洲型钩端螺旋体野生株rRNA基因MRSP分析
目的:用两对特异引物扩增12株七日热型、澳洲型钩端螺旋体野生株及相应的2株参考株的16S、23S rRNA基因,用Hinf内切酶对扩增产物作MRSP分析.方法:应用rRNA基因MRSP分析技术.结果:不同宿主来源(钩端螺旋体病人、耕牛)的同一血清型钩端螺旋体野生株之间具有相同的MRSP型,同一血清型钩端螺旋体野生株与相应的参考株的MRSP型也相同,故七日热型、澳洲型钩端螺旋体属同一MRSP型.结论:用此法对钩端螺旋体进行快速鉴定,初步分类,不失为分子流行病学调查的一种有效手段.
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蓝氏贾第鞭毛虫C2株rRNA基因ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列测定与分析
内转录间隔区(internal transcribed spacer ITS)为真核生物rRNA基因(rDNA)中串联重复存在的大小亚基间的内转录间隔序列.研究表明,贾第虫rDNA包含18S、5.8S和23SrDNA,3者的内转录间隔区为ITS-1和ITS-2,前者位于18S和5.8SrDNA之间,后者位于5.8SrDNA和23SrDNA间.18S、5.8S和23SrDNA序列较保守,进化速率较慢,不同种生物间同源性较大;而ITS序列并不保守,进化速率较快,种间同源性较小,是鉴定生物种株的一个十分有效的分子标志.研究表明,不同宿主和不同地域来源的蓝氏贾第虫虫株存在遗传学差异.
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rRNA基因间隔区碱基测序对当归进行鉴定的研究
目的通过rRNA基因内转录间隔区的碱基序列测定,对当归进行分子水平鉴定.方法常规提取当归种籽DNA,利用合成的特异性引物对其rRNA基因内转录间隔区进行套式PCR扩增,将扩增产物进行碱基序列测定.结果琼脂糖凝胶电泳证实当归种籽中rRNA基因内转录间隔区PCR扩增产物存在;经测序后得到了当归种籽rRNA基因内转录间隔区的碱基序列.结论 rRNA基因内转录间隔区的碱基序列测定可做为分子水平鉴定植物性中药材的又一有效途径.
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顺铂与亚硒酸钠对淋巴细胞转化的影响
目的探讨亚硒酸钠对顺铂抑制人体T淋巴细胞转化作用的影响,顺铂与亚硒酸钠对正常人体T细胞rRNA基因转录活性的影响及T细胞转化与rRNA基因表达活性之间的关系.方法在细胞培养24h时加入顺铂0.05,0.20,0.50mg/L,在细胞培养开始或在加入顺铂的同时加入亚硒酸钠0.05mg/L;细胞培养72h后,检测T细胞转化率及银染核仁组织区(Ag-NOR)数量的变化.结果亚硒酸钠与不同剂量的顺铂共同处理淋巴细胞,细胞转化率显著高于相应剂量顺铂单独处理者(P＜0.01～0.001),并达到或超过阴性对照的水平.亚硒酸钠预先加入或与顺铂同时加入者无显著性差异.各组间Ag-NOR的表达频率以及各类随体联合均无显著性差异.结论亚硒酸钠可消除顺铂对T细胞转化的抑制作用,且亚硒酸钠对T细胞转化及对顺铂作用的影响无时间效应.顺铂与亚硒酸钠对人体正常T细胞rRNA基因表达的影响以及T细胞转化与rRNA基因转录活性之间的关系仍不清楚.
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rRNA基因内转录间隔区测序分析在中草药鉴定中的应用
目的:研究rRNA基因内转录间隔区(internaltranscribded spacer,ITS)PCR扩增及碱基测序分析对中草药进行鉴定的方法,并探讨该方法的科学性及其应用价值.方法:应用PCR-碱基测序法对所提取的植物性中药材DNA中的rRNA基因内转录间隔区进行PCR扩增和序列测定,以获得不同植物性中药材rRNA基因内转录间隔区扩增产物电泳图谱和碱基序列,以此作为中药材的分子鉴定标记.结果:不同中草药rRNA基因内转录间隔区电泳条带,碱基序列组成,长度各不相同.结论:不同植物性中药材rRNA基因内转录间隔区可作为分子生物学水平鉴定中草药的靶基因之一.
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氟中毒患者核仁组织区研究
目的研究氟中毒患者rRNA基因的活性.方法以高氟区24例氟中毒患者作为研究对象,以低氟区27例正常人作为对照,采用Ag-NOR技术,对NOR和近端着丝粒染色体联合进行了对比分析.结果实验组的Ag-NOR频率高于对照组,差异有显著性(P＜0.05);实验组的Ag-AA频率略低于对照组,差异没有显著性(P＞0.05).结论氟中毒患者的rRNA基因的活性明显增高.
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鼠疫耶尔森氏菌16S-23SrRNA基因间区分析
目的发展一种快速准确的鉴定鼠疫菌的方法.方法 PCR反应加限制性内切酶消化的方法.结果对来自不同疫源地的103株鼠疫菌16S-23S rRNA基因间区进行扩增,均可扩出两条长为1 146bp及1 090bp的片段,扩增产物用限制性内切酶Taq I,Msp I消化后的酶切图谱相同.而对照菌株小肠结肠炎耶尔森氏菌,鼠伤寒沙门氏菌,大肠杆菌,痢疾杆菌,霍乱弧菌的扩增产物及酶切图谱与鼠疫菌均不相同.结论鼠疫菌16S-23S rRNA基因间区高度同源,基本为两种类型,长度分别为1 146bp及1 090bp,其他菌株与其明显不同;该方法将有助于快速准确的鉴定鼠疫菌.
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前列腺组织中细菌16S rRNA基因、IL-1β、TNF-α和NGF的表达
目的:探讨慢性前列腺炎(CP)的细菌学病因.方法:前列腺标本取自162例猝死于非前列腺疾病的器官捐献者,年龄20～38岁.取前列腺周围带组织,一式两份,一份做常规病理检查和白细胞介素-1β(IL1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、神经生长因子(NGF)的免疫组化分析,另一份用PCR方法检测细菌16S rRNA基因(16S rDNA). 结果:31.5%(51/162)的组织病理呈CP改变,其中轻度灶性间质炎44例,轻度灶性间质伴腺体周围炎5例,轻度灶性腺体周围炎2例.16S rDNA阳性率为19.1%(31/162),其中CP标本阳性率为51.0%(26/51),非CP标本阳性率为4.5%(5/111),CP标本阳性率高于非CP标本(χ~2=29.783,P＜0.01).在CP标本中,16S rDNA阳性组IL-1β、TNF-α和NGF表达高于16S rDNA阴性组(P＜0.01). 结论:细菌感染可能是引起CP的重要原因.
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肺癌病理类型与外周淋巴细胞rRNA基因活性的关系
目的研究肺癌病理类型与外周血淋巴细胞rRNA基因活性的关系.方法应用染色体银染技术,对肺腺癌、肺鳞癌和小细胞肺癌共50例患者和40例正常人外周血淋巴细胞染色体银染核仁形成区(Ag-NORs)进行检测.结果肺癌组Ag-NORs数/细胞显著高于对照组;各型肺癌组之间,腺癌组的Ag-NORs数/细胞显著高于小细胞肺癌组和鳞癌组.结论肺腺癌、小细胞肺癌和肺鳞癌患者有转录活性的rRNA基因活性呈递减趋势,与染色体不稳定性呈线性关系.据此,可在不经手术取材的情况下判断肺癌的病理类型,从而指导临床治疗.
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四重PCR检测致病性嗜水气单胞菌
目的 建立一种能够快速准确地检测致病性嗜水气单胞菌的四重PCR方法.方法 根据致病性嗜水气单胞菌的丝氨酸蛋白酶(ahpA)基因、气溶素(aerA)基因和溶血素(hlyA)基因的保守序列以及嗜水气单胞菌的16S rRNA基因种属特异性序列分别设计4对特异性引物,通过优化各引物浓度、退火温度和Mg2+浓度,确定了四重PCR的佳反应条件;然后进行特异性和敏感性试验,并比较其与常规微生物学方法对不同菌株和临床样本的检出率.结果 该方法特异性好,能特异性检测并鉴别出嗜水气单胞菌致病性菌株;检测灵敏度高,低可检测到约100 fg的嗜水气单胞菌基因组DNA;对9株嗜水气单胞菌的检测结果与常规微生物学方法一致,对56份送检的水产动物样品的检出率为21.4%,高于常规微生物学方法的16.1%,两者检测结果符合率为94.6%.结论 成功建立了能同时检测嗜水气单胞菌16S rRNA、aerA、ahpA和hlyA基因的四重PCR方法,能快速、准确地对嗜水气单胞菌进行检测并区分致病性与非致病性菌株.
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rRNA基因内转录间隔区作为遗传标记的应用现状及前景
随着分子生物学技术的不断发展,rRNA基因内转录间隔区(ITS)作为一种遗传标记,已经被广泛应用于微生物菌种分类与鉴定、中药材鉴定和品质评价、植物种质资源鉴定、动物种系发生、遗传多样性与亲缘关系、病原诊断、系统发育研究等不同方面的研究.文章就近年来rRNA基因内转录间隔区的应用现状及前景进行综述.
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广州管圆线虫特异性rRNA基因的PCR扩增
目的探讨核酸诊断方法用于广州管圆线虫诊断的可能性.方法根据广州管圆线虫成虫rRNA大亚基基因部分序列设计引物,对广州管圆线虫成虫DNA进行PCR扩增,并对该方法的敏感性和特异性进行评价.结果经琼脂糖凝胶电泳和DNA序列测定证实:PCR产物的大小和序列结构与待扩增的广州管圆线虫目的基因完全一致.结论本方法有较好的敏感性和特异性,为将其用于人体广州管圆线虫病的诊断奠定了基础.
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家种及野生秦艽、麻花秦艽的rRNA基因间隔区PCR产物电泳图谱的初步研究
目的:分析甘肃不同地区家种及野生中药材秦艽Gentiana macrophylla、麻花秦艽G. straminea中提取的DNA中rRNA基因内转录间隔区PCR扩增产物的电泳图谱,为秦艽、麻花秦艽等不同品种鉴别和品质评价从分子水平提供依据.方法:提取中药材家种及野生秦艽、麻花秦艽的核基因组DNA,利用合成的特异性PCR引物对所提取的DNA中rRNA基因内转录间隔序列进行nPCR扩增,扩增产物行琼脂糖凝胶电泳以得到电泳图谱并进行分析.结果:琼脂糖凝胶电泳图谱显示不同秦艽DNA中rRNA基因内转录间隔区长度均在360bp左右,已具备足够的遗传信息量进行碱基序列分析.结论:不同秦艽DNA中rRNA基因内转录间隔区PCR扩增产物可作为从分子水平进行鉴别的标记之一.
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特异引物PCR鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌方法的建立和优化
目的 以16S rRNA编码序列为靶基因,建立特异引物PCR鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌方法 并优化.方法 以类鼻疽伯克霍尔德菌标准菌株K96243的16S rRNA编码序列为靶序列,通过Primer Premier 5软件搜索特异的引物,以该菌为模板,优化特异引物PCR的退火温度、退火时间和反应循环数等条件.得到优PCR反应条件后,将该方法 用于检测临床分离的类鼻疽伯克霍尔德菌菌株和常见细菌感染病原体(大肠杆菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌、幽门螺旋杆菌、金黄色葡萄球菌、甲型链球菌和乙型链球菌),评价该方法 的有效性和特异性.结果 共设计3对引物,分别扩增16S rRNA编码序列283～672、760～1 061、771～1 193片段,优化后PCR反应条件为:94 ℃预变性4 min,94 ℃变性40 s,54.5 ℃退火20 s,72 ℃延伸40 s,24个循环,后延伸1 min;特异性分析发现此方法 能将类鼻疽伯克霍尔德菌与其他常见感染病原菌进行有效地鉴别诊断.结论 成功建立并优化一种快速鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的方法,通过此方法 能有效的从单个菌落中和基因组水平鉴定临床分离的8株类鼻疽伯克霍尔德菌.
