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风湿病中关节炎与支原体感染的关系研究
目的应用套式聚合酶链反应(nPCR)检测技术探讨风湿病中关节炎与支原体感染的关系.方法对26例类风湿关节炎(RA),24例反应性关节炎(ReA)、3例系统性红斑狼疮(SLE)、1例干燥综合症(SS)、1例骨关节炎(OA)、1例未分化结缔组织病(UCTD)、3例强直性脊柱炎(AS)病人关节液用nPCR方法联合检测支原体:解脲脲原体(Uu)、人型支原体(Mh)、发酵支原体(Mf)、关节炎支原体(Mar).结果26例RA患者中,2例Uu阳性、1例Mh阳性、1例Mar阳性.24例ReA患者中,2例Uu阳性、2例Mh阳性.3例SLE患者中,1例Uu阳性.2例Mh阳性,1例SS患者Mh阳性.结论风湿病中关节炎与支原体感染有密切关系,支原体感染可能是风湿病发病的一个重要因素之一.
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小秦艽rRNA基因内转录间隔区测序鉴定的初步研究
目的:对小秦艽种籽中提取的DNA中rRNA基因内转录间隔区进行碱基序列测定,以期从分子水平建立对秦艽种籽的鉴定标准.方法:常规提取小秦艽种籽DNA,利用合成的特异性引物对其DNA中rRNA基因内转录间隔区进行套式PCR扩增,将扩增产物以四色荧光标记的双脱氧末端终止循环法进行碱基序列测定.结果:经琼脂糖凝胶电泳证实 rRNA基因内转录间隔区 PCR 扩增产物存在,测序后得到了小秦艽种籽 rRNA基因内转录间隔区的碱基序列.结论:rRNA 基因内转录间隔区的碱基序列可作为分子水平鉴定植物性中药材的又一途径.
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绵羊肺腺瘤病特异性PCR及套式PCR诊断方法的建立
绵羊肺腺瘤是由外源性反转录病毒JSRV引起的接触性传染的肺肿瘤性疾病.感染羊没有针对JSRV的循环抗体,但在感染羊的肺肿瘤组织、淋巴网状系统及外周血单核细胞中可检测到外源性前病毒exJSRV及JSRV转录产物.健康羊基因组中存在15～20拷贝的内源性前病毒enJSRV,内外源性前病毒的结构基因高度相似,而在U3区存在差别,因而,设计了针对exJSRVU3区的特异性引物并在国内首次建立了一步法特异性PCR检测法及套式PCR检测法.以700ng健康羊基因组DNA为背景,梯度稀释阳性质粒pJSRV-LTR作为模板,比较两种方法的敏感性,结果表明套式法的敏感性是一步法的10倍以上,套式法也是目前可用于检测感染羊血液样品的唯一方法,可望在绵羊肺腺瘤病的流行病学调查及防控方面起重要作用.
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利用套式PCR技术鉴别屋尘螨和粉尘螨主要变应原基因及其在尘螨疫苗研制中的应用
通过提取屋尘螨和粉尘螨疫苗研制用的原始种子和生产种子基因组DNA作模板,分别设计Der p1和Der f1各2套内外扩增引物并进行一步法套式PCR,根据扩增出目的片段来检测尘螨变应原Der p1和Der f1基因片段,并以培养基提取物为阴性对照和已通过形态学鉴别为纯屋尘螨、纯粉尘螨的基因组DNA为阳性对照.PCR产物经电泳后切胶回收并克隆到T载体上,进行DNA序列分析并在GenBank中进行同源性比较.结果显示,从屋尘螨和粉尘螨疫苗研制用的原始种子和生产种子分别扩增出含有屋尘螨和粉尘螨主要变应原Der p1和Der f1基因片段,扩增部分的序列与GenBank数据库里相应序列同源性为100%.从阴性对照提取物中未扩增得到目的基因片段,从阳性对照DNA提取物中能扩增得到目的变应原Der p1和Der f1基因片段.本研究首次应用套式PCR技术鉴别了屋尘螨和粉尘螨原始种子和生产种子,为尘螨疫苗研制以及工业化生产提供了一种有效的质量控制手段.
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套式PCR检测滤纸干血滴中间日疟原虫
从滤纸干血滴上用Chelex处理洗脱下的疟原虫DNA,经套式PCR扩增间日疟原虫SSUrRNA基因特异性121 bp片段,分析该方法的敏感性和特异性.37例血样检测结果全部阳性,当原虫密度低至25个原虫/uL血时仍可成功检测到该特异条带,且其它三种人疟原虫(恶性疟原虫,三日疟原虫和卵形疟原虫)血样均为阴性.提示滤纸干血滴与PCR扩增技术相结合,是疟疾诊断或流行病学调查的实用工具.
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套式PCR应用于恙虫病东方体媒介、鼠类血块及脾脏标本的实验检测研究
目的:检测恙螨幼虫体内及鼠类标本中恙虫病东方体携带情况,预测流行趋势,评价套式PCR反应的敏感性和特异性,以进一步开展分子流行病学研究.方法:参照文献中恙虫病东方体Karp株Sta 58群特异性抗原基因序列,合成两对DNA引物;应用套式PCR检测现场鼠体表恙螨幼虫体内及鼠类标本的恙虫病东方体DNA;PCR扩增产物通2%琼脂糖凝胶电泳分析和12% PAGE电泳分析,并用PGEM-3Zf(+)/HaeⅢ DNA作为核酸分子量参照物,证实扩增产物是恙虫病东方体Sta 58kDa群特异性抗原基因88bp片段.结果:从送检的29份鼠血块和112份脾组织中均检出阳性1份;从39份恙螨幼虫体内检出阳性8份.实验感染小鼠后3d,其血块及脾组织均未检出恙虫病东方体;而在感染后6和9d,能从血块及脾组织中检出恙虫病东方体.结论:套式PCR具有很高的敏感性和特异性,是疫源地及现场流行病学调查的有效手段.
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应用套式PCR提高肺炎支原体P1-RFLP基因分型检测敏感性
目的 探索一种适用于临床标本检测的肺炎支原体套式PCR-P1-RFLP基因分型方法并对其应用进行评价.方法 参考肺炎支原体标准株P1基因RepMp4及RepMp2/3序列,分别在两个序列内部设计4条内套引物,采用文献报道的外套引物及新设计内套引物进行套式PCR扩增,扩增产物混合后用HaeⅢ酶切,根据不同的酶切图谱结果判断其型别,同时采用测序验证;对标准株DNA及临床标本DNA倍比稀释后进行检测,验证新改良方法敏感性;收集2012年肺炎支原体感染阳性标本,采用研究新改良的方法进行分型检测并与现有方法进行比较.结果 经测序验证,以套式PCR为基础的P1-RFLP基因分型方法能够对临床标本进行很好的扩增;与现有的分型方法相比,新改良方法敏感性提高103倍,差异有统计学意义;北京地区2012年儿科肺炎支原体流行基因型为Ⅰ型.结论 套式PCR-P1-RFLP基因分型方法敏感性高,能够对临床标本进行很好的扩增.
关键词： 肺炎支原体 基因分型 套式PCR P1-限制性片段酶切长度分析 -
3种重要虫媒病毒的RT-PCR检测
目的:建立快速、敏感、特异的虫媒病毒RT-PCR检测方法.方法:采用改进的核酸制备方法,分别从感染的乳鼠脑和细胞培养上清液中提取病毒RNA,再用RT-PCR和套式PCR方法进行检测.结果:通过对RT-PCR反应条件的优化,用3种虫媒病毒的特异引物均可从不同稀释度的感染小鼠脑和细胞上清中提取的病毒RNA扩增出特异的目的基因片段.甲病毒属的东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒之间,及与黄病毒属的黄热病毒均无交叉反应,表明建立的RT-PCR检测方法特异性强.套式PCR与RT-PCR比较可提高检测敏感性10～10 000倍.结论:建立的RT-PCR和套式PCR法可用于3种虫媒病毒的快速检测.
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应用一步和套式PCR法检测SARS患者标本中的SARS病毒核酸序列
目的:建立敏感、特异和快速的针对SARS病毒的RT-PCR方法,为SARS的早期诊断及防治提供依据.方法:采用一步和套式PCR法对SARS患者不同标本中的SARS病毒RNA进行扩增及序列测定.结果与结论:应用外引物和内引物可分别扩增出约380bp和150bp的单一条带,其大小与预期的相一致.应用套式PCR可使检测敏感性从10-6提高到10-15.采用这种方法从SARS患者粪便、痰、鼻咽拭子和血液标本中均可扩增出与预期大小一致的条带,且测序结果显示该扩增片段为SARS病毒的特异序列,表明本研究建立的RT-PCR方法敏感、特异,可用于SARS的快速检测.
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套式PCR与血清学方法用于检测肺炎支原体感染的对比研究
目的 比较基于16SrRNA的套式PCR与血清学方法 对肺炎支原体(Mp)的检出情况.方法 获取医院呼吸内科96例呼吸道标本,设计针16SrRNA特异性引物,用套式PCR法扩增.同时获取双份血清标本检测Mp抗体,比较两种方法 的阳性率.结果 套式PCR对Mp的检出率为22.9%,双份血清检出率为18.75%,差异无统计学意义.单份血清检出率为10.4%,套式PCR法对Mp的检出率明显高于单份血清试验.84例发病早期患儿,套式PCR检测出阳性69例,阳性率为82.14%,血清抗体阳性10例,阳性率为12.04%.经统计学分析,P<0.05.结论 套式PCR和血清学方法 均能敏感快速检测Mp感染,但对早期感染而言,套式PCR更有优势.
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套式PCR检测非淋球菌性尿道炎中生殖支原体和解脲支原体
目的:采用nPCR技术,对在本院确诊的非淋球菌性尿道炎(NGU)患者的泌尿生殖道分泌物标本进行检测,以探讨套式PCR(nPCR)技术在生殖支原体(Mg)和曲和解脲支原体(Uu)检测中的作用和地位.方法:深圳市福田区NGU患者98例,宫颈或尿道口内拭子分泌物标本用nPCR进行DNA扩增,并与对照组43例进行比较.结果:98例标本中Mg阳性15例,阳性率为15.3%,正常对照组无一例阳性.Uu阳性21例,阳性率为21.4%,对照组仅1例阳性.结论:深圳福田区Mg、Uu在NGU中具有较高的感染率,nPCR具有敏感、快速、特异性强等特点,可用于临床辅助诊断和流行病学调查.
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淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)PCR检测方法的建立与初步应用
目的 建立检测淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的PCR方法.方法 根据LCMV CDNA S片段的GPC和NP基因设计合成4对引物,对标准毒株进行套式PCR扩增并克隆测序,并对15份已知阳性或阴性小鼠鼠脑进行检测.结果 目的片断与LCMV cDNA序列99%同源,对鼠脑的检测结果为10只阳性,5只阴性.结论 检测小鼠鼠脑LCMV的结果准确,证明套式PCR能够应用于LCMV的实验室检测.
关键词： 淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒 套式PCR 小鼠鼠脑 -
空肠弯曲菌套式PCR快速检测方法的建立与初步应用
目的 建立套式PCR快速检测实验动物空肠弯曲菌的方法.方法 根据GenBank数据库的空肠弯曲菌flaA基因设计2对引物,对空肠弯曲菌抽提DNA作PCR扩增及克隆测序.同时,对其他病原菌抽提核酸扩增,并对120份临床样品进行检测.结果 空肠弯曲菌经2对引物分别扩增出1 719 bp和640 bp片段,与预期大小一致.套式PCR检测的低限度为10 CFU.整个检测过程可在8 h内完成.而其他病原菌未出现特异性扩增条带.采用套式PCR对121份临床样品进行检测,检出31份阳性,与传统的细菌分离方法完全一致.结论 本研究建立的套式PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于实验动物空肠弯曲菌的快速检测.
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rRNA基因间隔区碱基测序对当归进行鉴定的研究
目的通过rRNA基因内转录间隔区的碱基序列测定,对当归进行分子水平鉴定.方法常规提取当归种籽DNA,利用合成的特异性引物对其rRNA基因内转录间隔区进行套式PCR扩增,将扩增产物进行碱基序列测定.结果琼脂糖凝胶电泳证实当归种籽中rRNA基因内转录间隔区PCR扩增产物存在;经测序后得到了当归种籽rRNA基因内转录间隔区的碱基序列.结论 rRNA基因内转录间隔区的碱基序列测定可做为分子水平鉴定植物性中药材的又一有效途径.
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深圳地区HBsAg阳性人群TTV核酸序列分析
目的分析HBsAg阳性和阴性人群输血传播肝炎病毒(TTV)感染率的差异及TTV病毒核酸序列.方法应用套式PCR扩增TTV病毒核酸序列,将扩增的TTV核酸片段进行核酸测序,构建进化树分析FTV核酸序列的同源性.结果HBsAg阳性和阴性人群TTV感染率比较,差异无统计学意义,深圳TTV病毒株与日本TTV病毒株的核酸序列同源性较大.结论人群中TTV病毒株携带率与HBsAg的携带率无相关性.
关键词： 输血传播肝炎病毒(TTV) 套式PCR 进化树 -
单增李斯特菌不同PCR快速检测方法比较
目的 比较3种PCR快速检测方法在检测单核细胞增生李斯特菌时的特异性和灵敏度方面的差异.方法 针对单核细胞增生李斯特菌的毒力基因iap和prfA基因,分别设计引物,进行单个PCR、多重PCR、套式PCR等3种方法检测.结果 3种PCR方法均具有较强的特异性;套式PCR的灵敏度为102 cfu/ml,高于单个PCR(103cfu/ml)和多重PCR(104cfu/ml).结论 多重PCR在特异性检测方面具有优势,而在灵敏度方面,套式PCR要明显优于单个及多重PCR方法.
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套式PCR检测抗-HBs阳性者血清HBVDNA及序列分析
研究套式PCR在检测抗-HBs阳性不同模式者血清HBVDNA中的意义,从基因角度分析产生的原因.对64例标本采用套式PCR检测HBVDNA并作序列分析,荧光定量法检测HBVDNA含量.抗-HBs阳性不同模式者常规PCR法检测HBVDNA阳性率29.7%,套式PCR检测阳性率84.4%;套式PCR阳性组肝功能损害严重、HBVD-NA与HBsAg值显著高于套式PCR阴性组;套式PCR性阴/常规PCR阴性组48.6%的病例由于S基因变异导致HB-sAg肽氨基酸置换产生的,抗-HBs不能中和病毒而与HBVDNA共存.因此对那些抗-HBs阳性、肝功能反复异常者有必要进行套式PCR检测,以提高HBV感染的诊断率.
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75名妓女和42名妇科门诊患者生殖道7种致病性支原体的套式PCR检测分析
[目的]探讨妓女中Uu、Mf、Mh、Mg、Mpn、Mpe、Mpi 7种支原体感染状况,进一步丰富支原体感染的流行病学资料.[方法]收集75名妓女和42名产科就诊者生殖道拭子标本,采用套式PCR方法检测,电泳后紫外光下观察结果.[结果]75名妓女中Uu、Mf、Mh、Mg、Mpn、Mpe、Mpi检出率分别为78.67%、10.67%、36.00%、17.33%、12.00%、13.33%、4.00%;42名妇科门诊患者的Uu、Mf、Mh、Mg、Mpn、Mpe、Mpi检出率分别为40.48%、4.76%、11.90%、21.43%、2.38%、4.76%、14.29%.经统计学检验,其中Uu、Mh、Mpi在两组差别有显著性(P小于0.01或0.05).75名妓女中,年龄、婚姻状况、安全套使用等因素与7种支原体的检出率相关性无统计学差异;在近一个月安全套每次用、有时用、从未用三组中7种支原体平均检出率分别为19.05%、24.54%、25.71%.[结论]在妓女的STD高危人群中,Uu、Mf、Mh、Mg、Mpn、Mpe、Mpi等7种支原体检出率较高;提示每次使用安全套具有一定保护作用.今后应加强性病高危人群支原体感染的监测和防治.
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丙型肝炎病毒1b型NS3基因扩增方案的改进
目的 优化扩增武汉地区HCV 1b型患者HCV非结构蛋白3(NS3)的cDNA,并进行测序.方法 从患者血清中提取HCV RNA,采用型特异性引物扩增分型法检测HCV患者基因分型.设计3对外侧引物和3对内侧引物,采用套式PCR技术(方案一)分别扩增HCV1b型患者的HCV NS3 3个区段,然后用3对内侧引物进行测序.为了优化NS3扩增和测序效果和减少操作繁琐,对引物进行改进,设计1对外侧引物和1对内侧引物,采用改进的套式PCR技术(方案二)直接扩增HCV 1b型患者的HCV NS3区,然后用3个正向引物和1个逆向引物进行测序.结果 改进的套式PCR技术(方案二)与套式PCR技术(方案一)相比,操作较为简单,而且扩增效率增高,扩增效果较好.结论 采用改进的套式PCR技术(方案二)扩增和测序HCV NS3区更迅速、有效、实用.
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弓形虫PCR检测方法的建立及初步应用
根据弓形虫P30基因序列设计二对引物分别进行了PCR一次扩增和套式扩增,结果这两对引物在一次扩增和套式扩增中分别出现预期的扩增片段914bp、522bp和522bp;套式扩增出现的条带比一次扩增出现的条带亮度明显增强.提示套式扩增比一次扩增具有更高的敏感性.用外引物进行扩增后,低可以检测到1pg的弓形虫DNA.说明所建立的反应体系具有高度的敏感性.用内引物对人工感染弓形虫的ICR小鼠血液、组织进行弓形虫DNA的检测,结果均扩增出522bp的扩增带.根据B1基因序列设计的引物进行PCR一次扩增和半套式扩增.结果均出现预期的扩增片段619bp、362bp和362bp;用半套式扩增检测感染弓形虫的ICR小鼠血液、组织时可扩增出522bp的扩增带,半套式扩增比一次扩增更敏感.
