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应用实时荧光定量PCR检测鼠类生境样本鼠疫耶尔森氏菌的研究
目的:评价应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法检测鼠类生境样本中鼠疫耶尔森氏菌的可行性和有效性.方法:优选、评价鼠类生境样本DNA提取方法,提取疫区鼠类洞穴土壤、粪便等生境样本中DNA,应用RT-PCR试剂盒检测鼠疫耶尔森氏菌特异性pla基因.结果:柱式土壤DNAout法提取DNA效果好,回收率是24.54%.联合应用柱式土壤DNAout法和RT-PCR法检测鼠类生境样本,鼠疫耶尔森氏菌pla基因的阳性率为3.44%(10/291).结论:应用柱式土壤DNAout法提取鼠类生境样本DNA,RT-PCR法可以检测到鼠类生境中鼠疫耶尔森氏菌pla基因.
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鼠疫耶尔森氏菌三色荧光定量PCR检测方法的建立
目的 建立一种三色荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法.方法 根据鼠疫耶尔森氏菌pPCP1质粒上的pk基因、编码F1抗原在pMT1质粒上的caf1基因以及菌体染色体上的3a基因序列,设计特异性的引物和不同荧光标记的Taqman荧光探针,优化反应体系和扩增条件,考察该方法检测的敏感度、特异性、重复性和稳定性,终建立三色荧光定量PCR检测方法.结果 本研究所建立的方法对鼠疫耶尔森氏菌DNA的扩增效率高,低检出限为1×102 copies/ml,特异性高,重复性的变异系数在合理范围内,稳定性好.结论 建立了一种同时检测鼠疫耶尔森氏菌pla、caf1和3a基因的三色荧光定量PCR方法,该方法敏感度和特异性高,能够实现快速检测的目的.
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复合探针荧光定量PCR法检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究
目的 建立用复合探针荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌的方法.方法 研究根据鼠疫耶尔森氏菌pla基因的核苷酸序列设计特异引物,通过PCR法的特异性、灵敏度和重复性研究,建立了复合探针荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法,用于鼠疫的筛选和诊断.结果 该检测方法的特异性为100％,低可检出10个拷贝的质粒DNA分子,可对1×101～1×106拷贝范围内的模板进行定量,低可检测至1×102 cfu/ml细菌.该方法的精密度好,阳性质控品和阴性质控品不同时间测定3次及同一时间5次重复实验结果Cv值均＜5％.结论 本研究建立的复合探针实时荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法,可对鼠疫耶尔森氏菌进行快速检测、准确辨别和早期诊断,对鼠疫的早期快速诊断具有重要意义.
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布氏田鼠鼠疫菌102 kb pgm基因座结构研究
目的研究布氏田鼠鼠疫菌株102 kb pgm基因座结构与其他类型鼠疫菌是否有区别,及其与布氏田鼠鼠疫菌株的独特特征的关系.方法采用聚合酶链反应(PCR)的方法,共设计25对嵌套的引物,以喜玛拉雅旱獭鼠疫菌株和布氏田鼠鼠疫菌株的染色体DNA为模板,分段扩增该区域内的DNA,选择差异较大的扩增片段进行克隆和测序,与已发表的序列比较.结果布氏田鼠鼠疫菌株的102 kb pgm基因座一端缺失了1 952个碱基,即插入序列IS100.另外,在测序的这段基因中,一类似于可变数量串联重复序列(VNTR)的区域,布氏田鼠鼠疫菌比已发表的序列多出几个拷贝.结论布氏田鼠鼠疫菌株的102 kb pgm基因座序列改变了,一端缺失了插入序列IS100,这就使得它的毒力岛不容易丢失,保持了pgm+表现型的稳定;与其毒力的关系,有待于进一步研究.
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随机扩增多态性DNA技术用于鼠疫耶尔森氏菌基因分型的研究
目的 对来自全国不同疫源地、不同生态型的103株鼠疫耶尔森氏菌进行基因分型研究.方法 用随机扩增多态性DNA技术(RAPD).结果 将鼠疫耶尔森氏菌分成两种基因型别:全国大部分菌株为RAPD-1型,青海省境内的大部分菌株为RAPD-2型.结论 不同生态型的鼠疫耶尔森氏菌基因结构存在差异,为鼠疫耶尔森氏菌的基础研究和防治提供依据.
关键词： 鼠疫耶尔森氏菌 随机扩增多态性DNA技术 -
鼠疫耶尔森氏菌噬菌体耐受株的选育及稳定性评价
目的 选育能够耐受鼠疫噬菌体Yep-phi的鼠疫耶尔森氏菌0614F突变株,并观察其稳定性,为鼠疫菌对噬菌体的耐受机制研究提供实验基础. 方法 用不同浓度的噬菌体Yep-phi逐代对鼠疫菌0614F进行侵染诱变.分别选取鼠疫菌0614F野生株和由鼠疫噬菌体侵染诱变后的中问代第13代、第25代和第43代突变株进行培养,通过菌落特征描述,噬菌体耐受能力测定和噬菌体裂解试验评价噬菌体耐受株的稳定性. 结果 获得的鼠疫菌0614F第43代突变株能够耐受效价为10-9的Yep-phi噬菌体原液.噬菌体耐受能力测定和噬菌体裂解试验显示突变株遗传表型稳定性良好,无返祖现象. 结论 利用鼠疫噬菌体Yep phi可诱导产生鼠疫菌抗Yep-phi突变株.其抗性的产生可能是由于鼠疫菌细胞外受体或菌株基因组结构发生改变引起的.
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鼠疫耶尔森氏菌16S-23S rRNA基因间区的酶切位点分析
目的:了解鼠疫耶尔森氏菌16S-23S rRNA基因间区的酶切位点分布情况.方法:PCR扩增及限制性内切酶分析.结果:对EV菌及不同来源的103株鼠疫耶尔森氏菌16S-23S rRNA基因间区进行了扩增,选用限制性内切酶Taq Ⅰ及Msp Ⅰ对扩增产物进行酶切分析,结果发现所用鼠疫耶尔森氏菌该间区扩增产物及酶切图谱一致;选用Taq Ⅰ+Msp Ⅰ,Hinf Ⅰ+Msp Ⅰ对EV菌16S-23S rRNA基因间区扩增产物进行了双酶切分析,作出了Taq Ⅰ,Msp Ⅰ,Hinf Ⅰ在EV菌该间区的酶切位点图.结论:鼠疫耶尔森氏菌16S-23S rRNA基因间区相当保守;酶切位点分析为对该区进行进一步研究打下了基础.
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鼠疫耶尔森氏菌F1抗原在鼠伤寒沙门氏菌中的表达及其保护力
目的:对鼠疫耶尔森氏菌F1抗原在鼠伤寒沙门氏菌中的表达及其保护力进行研究. 方法:PCR、化学转化及电穿孔法.结果: 采用PCR方法,特异地扩增了鼠疫菌F1抗原caf 操纵子的5Kb基因片段.将PCR产物与质粒载体连接后,经化学方法转化大肠杆菌LE392, 获得 caf基因克隆子,所得克隆子能较好地表达F1抗原基因.应用电穿孔法将克隆子的重组质粒转入鼠伤寒沙门氏菌G30内获得转化子,其F1抗原表达水平与在大肠杆菌LE392中的表达水平相同,反向血凝滴度可达1∶80以上,与EV株相近.用该株免疫小鼠,20d后用141株攻击,可延长平均死亡时间.结论:caf基因的克隆子在鼠伤寒沙门氏菌G30中能够有效表达,且对小鼠显示出保护效果.该研究为构建新型鼠疫菌苗提供了线索.
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鼠疫耶尔森氏菌IS 1541的研究
目的:研究鼠疫耶尔森氏菌的插入序列IS 1541的插入位点的特性.方法:用一条锚定的IS 1541内部锚定引物和一条随机引物进行PCR扩增;核酸分子杂交技术;克隆;测序.结果:14株鼠疫菌的扩增图谱基本相同,杂交图谱差异,可分成3种类型.克隆、测序其中一个片段,其序列仅在两端的引物区与IS 1541同源,而与E.coli K-12 MG 1655的prlc基因同源性较高.结论:IS 1541在鼠疫菌中的分布有差异,可以作为该菌的基因标志,用于分型.
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应用抑制消减杂交技术研究鼠疫菌与假结核菌基因组之间的差异
目的:研究古典型鼠疫菌与假结核菌ATCC29833基因组间的差异,为进一步认识鼠疫菌的起源与进化奠定基础.方法:通过抑制消减杂交技术比较两种细菌基因组间的差异.结果:与已测序的3株鼠疫菌基因组进行同源性比较,发现了259个假结核菌基因组中存在的特异序列,与基因库进行同源性比较发现了10个假结核菌ATCC29833基因组中存在的新序列.结论:抑制消减杂交技术是一个简单而有效的比较近源微生物基因组之间差异的方法,鼠疫菌在进化过程中失去了大量的基因,假结核菌基因组之间也存在着一定的差别.
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2015年北京市鼠疫监测结果分析
目的：描述北京市鼠疫人间病例早期预警监测结果和本地可染疫动物种群及鼠疫耶尔森氏菌感染状况。方法在全市各级各类医疗机构开展鼠疫人间病例筛查，在门头沟区、延庆区、怀柔区、密云区和顺义区5个区设立监测点，使用夹夜法捕捉小型兽类，使用间接血凝试验测定鼠疫耶尔森氏菌F1抗体。结果2015年全年未发现鼠疫急热待查和疑似病例，鼠间疫情监测共捕获99只啮齿类动物，鼠密度为2.83%，共包含了4种类型：大林姬鼠、北社鼠、岩松鼠和褐家鼠。77份鼠血清中未检出鼠疫F1抗体。结论北京市存在已确定的鼠疫可染疫动物社鼠和大林姬鼠，且为优势种群，但目前血清学监测结果未发现鼠疫菌感染。
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温度对鼠疫耶尔森氏菌CRP蛋白转录表达的影响研究
目的 探究CRP蛋白对鼠疫菌刚果红染色表型的影响及温度对CRP蛋白转录表达水平的调控.方法 观察鼠疫菌野生株(WT)、CRP缺失株(ΔCRP)及CRP回补株(C-CRP)在刚果红平板上的菌落表面形态.分别提取26 ℃下与37 ℃下培养的WT总RNA,采用实时荧光定量PCR法研究不同温度下crp的转录表达水平.构建含有CRP启动子区上游的LacZ重组质粒并电转化入WT中,通过分别测定26 ℃下与37 ℃下培养的LacZ菌株的β-半乳糖苷酶活性来比较CRP启动子活性,进一步判断不同温度下CRP的转录表达水平.结果 表型实验显示CRP缺失后鼠疫菌刚果红染色能力显著降低,基因调控实验表明CRP的转录表达水平不受温度转换的影响.结论 温度不是刺激鼠疫菌CRP蛋白活化并发挥基因调控作用的主要因素,碳代谢水平、pH及离子浓度可能为CRP蛋白发挥功能的诱因,研究结果为进一步研究鼠疫菌生物被膜形成中CRP蛋白的转录调控机制奠定基础.
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哈萨克斯坦鼠疫爆发的预测阈值
在哈萨克斯坦和中亚其他地方,自然界大沙鼠间流行的鼠疫耶尔森氏菌是黑死病的来源.现分析1955-1996年间搜集的野外监测数据,显示出鼠疫的侵袭、消退和再侵袭与宿主动物-大沙鼠数量的消长有关.我们得到一个宝贵的经验范例,是关于在一个单独的野生群体中,导致鼠疫侵袭、持续的两类数量阈值.
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鼠疫抗原及其免疫作用的研究进展
目的:鼠疫耶尔森氏菌作为鼠疫的病原菌,致病机制十分复杂,到目前为止,对于鼠疫的免疫机制并不十分清楚,而且尚无有效的疫苗预防鼠疫.随着人们对鼠疫抗原研究的不断深入,对其发挥的免疫作用的功能有了新的认识.本文就鼠疫抗原及其免疫作用研究进展作一综述.
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中国2005年人间鼠疫疫情分析
鼠疫(Plague)是一种人畜共患的自然疫源性疾病,原发于啮齿动物并能引起人间流行.传染源主要是啮齿动物,传播媒介主要是蚤类,由鼠疫耶尔森氏菌(Yersina pestis)引起.鼠疫传染性强,传播速度快,病死率高,曾在世界广大地区流行过,给人类造成深重的灾难.
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鼠疫的防治措施及护理对策
鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌引起的自然疫源性传染病,是危害人类严重的烈性传染病之一,属国际检疫传染病,在我国规定为甲类传染病.原发于啮齿动物,可引起人间流行,其传染性强,传播速度快,病死率高.通过对护理人员进行业务培训,掌握鼠疫的有关知识,以提高护理质量,加强公共卫生人群卫生宣教,提高整体的卫生意识,对防止鼠疫的发生和流行具有重大意义.
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鼠疫耶尔森氏菌外膜蛋白研究进展
耶尔森氏菌属包括11个菌种,其中只有鼠疫耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌对人致病,而其余8个菌种只对动物致病.致病性耶尔森氏菌的外膜蛋白(yersinia outer-membrance proteins,Yops)一直是研究的热点.现将其研究进展综述如下.
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北京市小型兽类鼠疫监测结果
目的 了解北京市自然环境中小型兽类种群组成和种群密度,并检测是否存在鼠疫耶尔森氏菌感染.方法 根据动植物历史分布资料在门头沟区、延庆县、怀柔区、密云县设立监测点,在2009、2010年用夹夜法捕捉小型兽类并鉴定物种、计算密度.笼捕法捕捉活鼠,心脏取血后进行鼠疫F1抗体检测.结果 北京市2009、2010年小型兽类(主要为啮齿类)密度分别为7.01只/100夹次和3.27只/100夹次.捕获小型兽类10种,其中啮齿类动物8种,食虫目1种,食肉目1种.社鼠、大林姬鼠和黑线姬鼠种群密度和构成高,2009、2010年3种鼠合计占夹夜法全部捕鼠量的93.81％和85.33％.鼠疫血清学检测标本624件,鼠疫耶尔森氏菌F1抗体均为阴性.结论 北京市存在已确定的鼠疫可染疫动物社鼠、大林姬鼠和黑线姬鼠,且为优势种群,目前血清学监测结果暂未发现鼠疫菌感染.
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云南鼠疫耶尔森氏菌脂肪酸成分分析
目的利用脂肪酸成分分析方法获得云南鼠疫耶尔森氏菌菌株脂肪酸组成的本底资料,并建立云南鼠疫耶尔森氏菌菌株的数据库.方法选择历年来从云南不同疫源地分离到的146株鼠疫耶尔森氏菌进行了菌体脂肪酸成分分析.结果云南鼠疫耶尔森氏菌菌株的主要脂肪酸成分为16:0酸,环式17:0酸,3羟基14:0酸和ω7c16:1酸以及十八碳单烯酸,与宋亚军等的分析结果一致,与MIDI公司Sherlock系统的菌库中的数据存在一些差异.结论建立云南鼠疫耶尔森氏菌菌株的脂肪酸组成数据库.
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鼠疫耶尔森氏菌Pla蛋白的分离纯化与质谱分析
目的 建立一种从鼠疫耶尔森氏菌疫苗株EV76中分离纯化纤维蛋白酶原激活因子(Pla)的方法.方法 采用超声破碎与硫酸铵盐析结合的方法初步提取Pla,经CHT陶瓷羟基磷灰石层析分离纯化,所获取的Pla进行质谱分析及Western blot实验.结果 菌悬液超声破碎后上清以0～10％饱和硫酸铵沉淀,获得含有相对分子质量(Mr)约为31 000、35 000、37 000的3条Pla蛋白带,约占蛋白总量33％；CHT柱层析后,3条带约占蛋白总量80％.经质谱分析,在Mr约为31 000、35 000的条带中含有Pla,Pla单克隆抗体能特异性地识别该蛋白.结论 采用超声破碎结合硫酸铵盐析的方法可从鼠疫菌中提取Pla,CHT柱层析可达到基本纯化,获得的样品经质谱分析和Western blot实验证实为Pla蛋白.
