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2005年中国EI Tor霍乱弧菌流行优势菌株分子特征分析
目的 研究2005年中国霍乱弧菌流行优势菌株的分子特征.方法 使用脉冲场凝胶电泳对菌株进行聚类分析,使用PCR和序列测定的方法对特异片段进行扩增和序列分析的研究.结果 2005年中国霍乱弧菌流行优势菌株的脉冲场凝胶电泳图谱高度一致并且不同于以往分离的菌株;这些菌株的VSP Ⅱ(Vibrio seventh pandemic island-Ⅱ)区域有相同的由插入序列的插入导致的基因缺失.结论 2005年霍乱弧菌流行优势菌株是一种首次报道的、由VSP-Ⅱ突变菌株引起流行的菌型,其扩散能力较强,应该在今后霍乱的监测中引起注意.
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鲍曼不动杆菌OXA型碳青霉烯酶基因型检测分析
目的 了解鲍曼不动杆菌OXA型碳青霉烯酶基因型的存在状况.方法 应用聚合酶链反应(PCR)检测OXA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-58基因,对PCR产物进行DNA直接测序,同时采用PCR对ISAba1和ISAba3插入序列进行检测,对PCR产物进行直接测序.除分别对OXA-23和ISAba1进行检测外,在两个基因之间再设计一对引物进行扩增,获得ISAba1与OXA-23之间的全长DNA序列.结果 收集温州医科大学附属第一医院住院患者临床分离的200株鲍曼不动杆菌,用PCR方法共检到OXA-23基因阳性菌株155株,阳性率为77.5%,其中与插入序列ISAba1同时阳性143株,阳性率为71.5%,本次试验未检到OXA-24基因阳性菌株;200株鲍曼不动杆菌均携带OXA-51基因,阳性率为100%,其中和OXA-23基因同时阳性155株,阳性率为77.5%;OXA-58基因阳性菌株共检出8株,阳性率为4.0%,插入序列ISAba3阳性共检出12株,阳性率为6.0%,其中有8株ISAba3和OXA-58同时阳性,阳性率为4.0%.结论 产OXA-23型碳青霉烯酶是该院鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗生素的主要原因.
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肺炎克雷伯菌泛耐药株的质粒耐药元件研究
目的 通过对泛耐药肺炎克雷伯菌JM45的质粒1(pJM45-1)耐药元件分析,从基因组水平研究其泛耐药的遗传学基础.方法 采用第二代高通量测序技术平台进行全基因组测序,生物信息学方法分析pJM45-1质粒的耐药元件,并与已在NCBI登录的质粒序列作聚类分析(Fast Minimum Evolutin法).结果 pJM45-1质粒大小为317 156 bp,功能注释分析发现该质粒为可接合转移质粒,携带了抗菌药物耐药编码基因、重金属离子耐受编码基因、毒素编码基因和转座子以及插入序列等83个耐药相关编码基因.pJM45-1质粒与耐药质粒R100(登录号:AP000342.1)的全长94 281个序列中的45 995个序列有99%相同;与接合性质粒F质粒(登录号:AP001918.1)的全长99 159个序列中的8322个序列有87%相同.pJM45-1质粒与源自肺炎克雷伯菌的质粒在同一簇(cluster),与源自其他肠杆菌的质粒不在一个簇.结论 肺炎克雷伯菌JM45 pJM45-1质粒携带大量耐药元件,是该菌株进化为泛耐药的主要原因.pJM45-1是可接合转移质粒,可将耐药基因在细菌间进行水平转移,造成耐药菌的播散.
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结核分枝杆菌IS6110探针的克隆化
目的制备克隆化结核分枝杆菌IS6110探针。方法将IS6110的PCR扩增245bp片段克隆至质粒载体pCR2.1中。结果得到了含有IS6110克隆化245bp的质粒菌株。结论克隆化的探针易操作且一致性较好。
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以PCR为基础的结核分支杆菌DNA分型技术及其应用
1998年结核分枝杆菌标准菌株H37Rv基因组测序工作宣告完成,这就为建立分子生物学方法鉴定结核分枝杆菌并对其分型提供了更有力的依据.H37Rv整个基因组由4,411,529对碱基组成,含有约4000个基因,整个基因组内有56个区与插入序列(ISs)同源[1].
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结核分枝杆菌DNA指纹分析研究
目的:采用结核分枝杆菌IS6110-RFLP DNA分型的方法分析上海近年分离的部分结核分枝杆菌临床分离株,并进行分子流行病学分析.方法:提取结核分枝杆菌基因组DNA,纯化后经限制性内切酶Pvu Ⅱ切割、琼脂糖凝胶电泳和Southern转印后,用荧光标记的IS6110 DNA序列中245bp探针杂交,以核酸化学发光试剂盒探测荧光信号,比较各菌株指纹的IS6110拷贝数和带型,分析各菌株指纹的IS6110拷贝数和带型.结果:经245bp探针杂交后的指纹图谱显示大部分菌株含9-21个IS6110拷贝,但有1菌株不含IS6110拷贝,另一株含1个IS6110拷贝.结论:结核分枝杆菌上海分离株指纹图谱呈高度多态性.零拷贝菌株和单拷贝菌株不能用IS6110-RFLP DNA指纹分析方法分析.
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结核分枝杆菌DNA指纹分析研究
目的:采用结核分枝杆菌IS6110-RFLP DNA分型的方法分析上海近年分离的部分结核分枝杆菌临床分离株,并进行分子流行病学分析.方法:提取结核分枝杆菌基因组DNA,纯化后经限制性内切酶Pvu Ⅱ切割、琼脂糖凝胶电泳和Southern转印后,用荧光标记的IS6110 DNA序列中245bp探针杂交,以核酸化学发光试剂盒探测荧光信号,比较各菌株指纹的IS6110拷贝数和带型,分析各菌株指纹的IS6110拷贝数和带型.结果:经245bp探针杂交后的指纹图谱显示大部分菌株含9-21个IS6110拷贝,但有1菌株不含IS6110拷贝,另一株含1个IS6110拷贝.结论:结核分枝杆菌上海分离株指纹图谱呈高度多态性.零拷贝菌株和单拷贝菌株不能用IS6110-RFLP DNA指纹分析方法分析.
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104株幽门螺杆菌插入序列IS605、IS606的分布
目的筛查中国5地区幽门螺杆菌(Hp)插入序列IS605、IS606的分布.方法选取来自北京、福建、云南、沈阳、香港等地共104株Hp,用PCR及染色体打点杂交的方法筛查IS605、IS606的分布,并对其分布特点进行分析.结果中国5地区Hp菌株IS605的阳性率为40%,IS606的阳性率为18%.云南菌株IS605的阳性率有高于其他地区的趋势,不同地区IS606的分布差异无显著性.不同临床诊断结果分离的菌株IS605、IS606的分布差异无显著性.IS605的两个开码读框ORFA、ORFB共存.结论中国5地区Hp菌株广泛存在IS605、IS606,且IS605的分布可能与菌株分离个体的地理位置有关.
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鼠疫菌102 kb基因座一端IS100的缺失与pgm+稳定性的研究
目的了解鼠疫菌102 kb pgm基因座一端IS100的缺失与pgm+稳定性的关系.方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增国内各型鼠疫菌102 kb pgm基因座色素沉着这一端IS100的片段,并选择克隆测序分析.结果通过PCR扩增,其中只能扩增出约2560 bp左右条带的生态型,也就是其102 kb pgm基因座色素沉着这一端IS100的片段缺失,除锡林郭勒高原布氏田鼠型,还有北天山东段型、北天山西段A、B型,其pgm+表型非常稳定;而有一部分菌株的扩增结果为阴性另一部分菌株扩增出4492 bp条带的生态型,扩增出4492 bp条带的菌株102 kb pgm基因座色素沉着这一端有IS100,结果为阴性的菌株其整个102 kb pgm基因座可能已经丢失,此种情况包括祁连山型,青藏高原型,冈底斯山型,滇西纵谷型等,其pgm+表型表现出不稳定.结论鼠疫菌102 kb pgm基因座一侧缺失IS100的菌株,可具有较稳定的pgm+表型,而鼠疫菌102 kb pgm基因座两侧有IS100的菌株,pgm+表型不稳定.
关键词: 鼠疫耶尔森菌 102 kb pgm基因座 插入序列 -
布氏田鼠鼠疫菌102 kb pgm基因座结构研究
目的研究布氏田鼠鼠疫菌株102 kb pgm基因座结构与其他类型鼠疫菌是否有区别,及其与布氏田鼠鼠疫菌株的独特特征的关系.方法采用聚合酶链反应(PCR)的方法,共设计25对嵌套的引物,以喜玛拉雅旱獭鼠疫菌株和布氏田鼠鼠疫菌株的染色体DNA为模板,分段扩增该区域内的DNA,选择差异较大的扩增片段进行克隆和测序,与已发表的序列比较.结果布氏田鼠鼠疫菌株的102 kb pgm基因座一端缺失了1 952个碱基,即插入序列IS100.另外,在测序的这段基因中,一类似于可变数量串联重复序列(VNTR)的区域,布氏田鼠鼠疫菌比已发表的序列多出几个拷贝.结论布氏田鼠鼠疫菌株的102 kb pgm基因座序列改变了,一端缺失了插入序列IS100,这就使得它的毒力岛不容易丢失,保持了pgm+表现型的稳定;与其毒力的关系,有待于进一步研究.
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鼠疫耶尔森氏菌IS 1541的研究
目的:研究鼠疫耶尔森氏菌的插入序列IS 1541的插入位点的特性.方法:用一条锚定的IS 1541内部锚定引物和一条随机引物进行PCR扩增;核酸分子杂交技术;克隆;测序.结果:14株鼠疫菌的扩增图谱基本相同,杂交图谱差异,可分成3种类型.克隆、测序其中一个片段,其序列仅在两端的引物区与IS 1541同源,而与E.coli K-12 MG 1655的prlc基因同源性较高.结论:IS 1541在鼠疫菌中的分布有差异,可以作为该菌的基因标志,用于分型.
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耶尔森菌中IS100研究概况
IS100是特异性地出现在鼠疫菌和假结核耶尔森菌中的插入序列,它在鼠疫耶尔森菌的染色体中有多个拷贝,在质粒中也有分布.它的转座活性较高,致使鼠疫菌中出现多个假基因,同向IS100之间的同源重组可以导致鼠疫菌发生基因的水平转移.
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耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌β-内酰胺酶与膜孔蛋白编码基因以及KPC-ISKpn6连锁检测
目的 探讨耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌的耐药机制.方法 对南京地区两家三甲综合性医院的耐碳青霉烯抗菌药物肺炎克雷伯菌临床分离株,采用PCR方法对其40种β-内酰胺酶基因、膜孔蛋白编码基因及KPC-ISKpn6连锁进行检测,PCR阳性产物进行测序,测序结果BLAST对比分析.结果 24株耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌的A类β-内酰胺酶编码基因TEM-1及SHV的阳性检出率为100% (24/24)、KPC-2的阳性检出率为95.8% (23/24)、LAP-2的阳性检出率为45.8% (11/24),C类β-内酰胺酶编码基因DHA的阳性检出率为4.2% (1/24),KPC-ISKpn6连锁检测阳性率为95.8% (23/24),膜孔蛋白编码基因ompK35与ompK36的突变率分别为95.8% (23/24)及100%(24/24).结论 本组肺炎克雷伯菌β-内酰胺酶TEM-1、SHV、KPC-2、LAP-2的携带率较高,其中KPC-2的高携带率及膜孔蛋白编码基因ompK35、ompK36的高突变率是本组肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制;插入序列ISKpn6可能参与了KPC-2基因的介导.
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ISEcp1-like插入序列与CTX-M型超广谱β-内酰胺酶的水平播散
20世纪90年代后,中国多个地区不断发现产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(CTX-M-ESBL)肠杆菌科细菌的流行.近年,在4组CTX-M-ESBL(CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-9和CTX-M-25)基因上游均发现存在ISEcp1-like插入序列,其对CTX-M-19、CTX-M-2以及氨基糖苷类耐药基因rmtC的转移能力亦得到证实.目前CTX-M-ESBL在我国临床菌株中的传播与ISEcp1-like插入序列的关系尚不清楚.本文旨在探讨ISEcp1-like序列与CTX-M-ESBL在肺炎克雷伯菌临床株中传播的关系进行研究.
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耐药鲍曼不动杆菌获得性耐药基因和可移动遗传元件检测与指标聚类分析
为了探讨一组耐药鲍曼不动杆菌获得性耐药相关基因和可移动遗传元件的关系.我们收集2009年1月至12月医院住院患者痰标本中分离的耐药鲍曼不动杆菌共20株,采用聚合酶链反应(PCR)方法进行了54种水平转移获得的β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类获得性耐药基因和12种接合性质粒、转座子、插入序列、整合子等可移动遗传元件遗传标记检测,并对检测结果作指标聚类分析(UPGMA法).
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一株由插入序列引起外膜孔蛋白OprD2缺失的亚胺培南耐药铜绿假单胞菌
铜绿假单胞菌广泛分布于周围环境及正常人的皮肤、呼吸道和消化道等部位,是年老体弱、慢性疾病和免疫功能低下患者合并感染的常见病原菌之一,有时可引起严重感染,其在各大医院细菌分离率调查中均居于首要位置,由铜绿假单胞菌引起的院内感染高达30%以上[1].
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结核分枝杆菌IS6110单拷贝菌株的流行病学研究
采用RFLP(restriction fragment length polymorphism)技术,利用结核分枝杆菌插入序列(insertion sequence,IS)IS6110中的片段为探针,可在结核分枝杆菌的DNA水平上进行鉴定和分型,有利于流行病学调查如结核病的暴发流行、在社区中的传播及 MDR菌株的传播等.但有些菌株,尤其是亚洲地区流行的部分结核分枝杆菌含有较少的IS6110拷贝,甚至不含IS6110拷贝,对于这些菌株不能用IS6110-RFLP分型的方法分析.本研究即发现1株IS6110零拷贝株和1株IS6110单拷贝株.
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4种方法比较检测新鲜和陈旧标本中的结核分枝杆菌
我们应用抗酸染色、细菌培养、荧光染色、聚合酶链反应(PCR)4种方法分别检测陈旧标本和新鲜标本中结核分枝杆菌,并作比较分析如下.一、材料与方法1.标本来源:120份标本来自1996年10月~1997年4月长治医学院附属和平医院传染科结核患者的痰、脑脊液、胸腹水等并置于灭菌青霉素小瓶中.当即对其中43份标本处理,取每份标本的1/2做抗酸染色、细菌培养、荧光染色、PCR检测.其余的1/2留在容器中放4℃冰箱,直至1999年10月再用4种方法检测.2.抗酸染色、细菌培养按实验室常规方法操作.荧光染色试剂金胺0-罗丹明,结核分枝杆菌在背景中呈现金黄色荧光.PCR根据TB多拷贝插入序列S6110自行设计的寡
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IS6110-限制性片段长度多态性DNA分型在结核分子流行病学研究中的应用
目的建立宁夏、北京和上海等地结核分支杆菌临床分离株IS6110-RFLP DNA指纹图谱,观察其流行病学特征.方法提取结核分支杆菌基因组DNA,经限制性内切酶 PvuⅡ切割、琼脂糖凝胶电泳和 Southern转印后,用荧光标记的IS6110 DNA序列中245 bp探针杂交,以核酸化学发光试剂盒探测荧光信号,比较各菌株指纹的IS6110拷贝数和带型,分析不同地理区域流行菌株的特点.结果 103例结核患者的临床分离株,经245 bp探针杂交后的指纹图谱显示大部分菌株含8~21个IS6110拷贝.在宁夏和北京地区流行的结核分支杆菌带型具有共同特点,并有成簇分布的现象;在上海分离株中发现1 株零拷贝株和1株单拷贝株.结论 IS6110-RFLP DNA分型方法可用于我国流行的结核分支杆菌分子流行病学研究;宁夏分离株与北京分离株在基因上亲缘关系较相近.
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细胞壁缺陷结核分枝杆菌IS986序列的检测与分析
插入序列(insertion sequence,IS)是染色体的特殊组分,是导致染色体大片段基因突变的主要原因.许多细菌的IS在其进化及作为一种基因标志在流行病学中的作用已被证实[1],因此我们探讨细胞壁缺陷变异对结核分枝杆菌染色体DNA保守重复序列IS986的影响.