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耐多药结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因katG突变分析
异烟肼(isoniazid,INH)是一种重要的抗结核药物,其在细菌体内被过氧化氢酶-过氧化物酶KatG氧化为乙酰异烟肼自由基和活性氧自由基等活性物质,进而攻击结核分枝杆菌多个靶位点来发挥杀菌作用[1].Zhang等[1]通过Southern印迹杂交(Southern blot)发现结核分枝杆菌katG 基因缺失和异烟肼耐药相关.研究表明,异烟肼耐药与许多基因相关,发生频率高的为katG编码区和inhA启动子区的突变[2-3],katG315位突变常见,有30%~94%的耐药株发生该突变[2,4],但国内对于该基因其他位点的突变研究较少.本研究通过对河南省耐多药(multidrug resistant,MDR)结核分枝杆菌katG编码区全长突变进行分析,进一步分析异烟肼的耐药机制.
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二氢杨梅素对K562/A02细胞阿霉素耐药性的逆转作用
目的:探讨二氢杨梅素(dihydromyricetin,DMY)对人慢性粒细胞白血病耐药细胞株K562/A02细胞对阿霉素(adriamycia,ADM)耐药的逆转作用及可能机制.方法:用DMY(5、10、20、40、60、80和100 mg/L)和ADM((0.05-100 mg/L)处理K562和K562/A02细胞48 h,采用MTT法检测细胞活力及DMY对K562/A02细胞ADM耐药的逆转效应,流式细胞术检测细胞内阿霉素的相对浓度,Western blot检测耐药相关基因的p-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance related protein 1,MRP1)、谷胱甘肽转移酶π(glutathione transferaseπ,GSTπ)和BCL-2蛋白表达.结果:DMY能抑制K562和K562/A02细胞的增殖且呈剂量依赖效应(r1 =0.37,r2 =0.38),IC50分别为71.23±6.51和72.88±5.49 mg/L.5、10和20 mg/L为DMY的低细胞毒性剂量.DMY(5、10和20 mg/L)增敏K562细胞和K562/A02细胞对ADM耐药性且呈剂量依赖效应(r1=-0.62,r2=-0.71),耐药逆转倍数介于1.38-28.59之间.DMY(5,10和20 mg/L)增加K562/A02细胞内ADM的浓度也呈剂量依赖效应(r=0.34).与对照组比较,DMY(5,10和20 mg/L)均显著降低了K562/A02细胞中PgP、MRP1、GSTπ和BCL-2蛋白表达,呈剂量依赖性(r1=-0.41,r2=-0.37,r3=-0.58,r4=-0.46).与ADM组比较,DMY(5,10和20 mg/L)+ADM组P-gp、MRP1、GSTπ和BCL-2蛋白表达均显著降低(r1=-0.55,r2=-0.41,r3=-0.38,r4=-0.44).结论:DMY可以逆转K562/A02细胞对ADM的耐药性,其作用机制可能与下调耐药相关基因P-gp、MRPI、GSTπ和BCL-2的表达有关.
关键词: 二氢杨梅素 K562/A02细胞 阿霉素耐药 耐药相关基因 -
一株携带三种β内酰胺酶基因铜绿假单胞菌的发现
近年来铜绿假单胞菌(Pa)耐药率不断增加,已经出现对三代头孢菌素和亚胺培南耐受的Pa菌,给临床治疗带来极大困难.我们从一例脑外伤合并严重肺部感染患者的气管分泌物中分离出1株多重耐药Pa菌,并对其进行了12种β内酰胺类耐药相关基因的检测与分析.
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22株肠球菌耐药性及8种耐药基因研究
我们收集了2003年12月至2004年5月分离自解放军98医院(湖州)的22株肠球菌,对其进行了耐药性和β内酰胺类耐药相关基因(TEM)、氨基糖苷类耐药相关基因[aac(6′/aph(2″),aph(3′)Ⅲ,ant (6)Ⅰ]、四环素耐药相关基因(tetM)、红霉素耐药相关基因(ermB)、万古霉素耐药相关基因(vanA、vanB)检测.
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肺炎克雷伯菌耐药遗传元件样本和指标聚类分析初探
我们从新生儿中分离到1组(19株)厄他培南等碳青霉烯类药物耐药的多重耐药肺炎克雷伯菌( multidrugresistant Klebsiella pneumoniae,MDRKPN),对该组菌株进行了β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类等药物的耐药相关基因和多药外排泵基因,以及毒力基因、可移动遗传元件的遗传标记检测,并对检测结果作了样本和指标聚类分析,以探讨菌株的亲缘性和耐药基因与可移动遗传元件相互关系.
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耐药鲍曼不动杆菌获得性耐药基因和可移动遗传元件检测与指标聚类分析
为了探讨一组耐药鲍曼不动杆菌获得性耐药相关基因和可移动遗传元件的关系.我们收集2009年1月至12月医院住院患者痰标本中分离的耐药鲍曼不动杆菌共20株,采用聚合酶链反应(PCR)方法进行了54种水平转移获得的β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类获得性耐药基因和12种接合性质粒、转座子、插入序列、整合子等可移动遗传元件遗传标记检测,并对检测结果作指标聚类分析(UPGMA法).
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同一株菌两种新基因型CMY-22、TEM-144β-内酰胺酶的发现及其临床意义
大肠埃希菌是临床常见致病菌,也是院内获得性感染的重要病原菌.其耐药性的变迁和多重耐药的出现,主要与耐药基因编码酶有关,其中以质粒介导的超广谱β-内酰胺酶(ESBL)和AmpC酶为重要.我们在近一项关于大肠埃希菌抗生素耐药相关基因的研究中,发现1株大肠埃希菌(ZY163)同时携带2种新型ESBL和AmpC酶,现报告如下.
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40株MRSA菌消毒剂及抗菌药物耐药基因研究
近年国外学者从金黄色葡萄球菌中检出耐消毒剂的菌株.为了解耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的耐消毒剂和抗菌药物耐药基因状况,我们收集了2003年12月~2004年5月苏州大学医学院附属第三医院分离到的20株MRSA菌和解放军98医院分离到的20株MRSA菌,共40株.对其进行了耐消毒剂基因(qacA)和β内酰胺类耐药相关基因(mecA、TEM)、氨基糖苷类耐药相关基因[aac(6′)/aph(2″)、aph(3′)-Ⅲ、ant(3″)-Ⅰ、ant(2″)-Ⅰ、ant(6)-Ⅰ]、四环素耐药相关基因(tetM)、红霉素耐药相关基因(erm)、万古霉素耐药相关基因(vanA、vanB)等12种主要耐药基因检测.
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结核分枝杆菌耐药机制及耐药性检测的研究进展
自20世纪80年代以来,结核病疫情重新上升,成为严重危害公共卫生的问题之一。据世界卫生组织估计,目前全球约有20亿人感染结核分枝杆菌(结核菌),其中约有5 000万人感染耐药结核菌[1]。因此对结核菌耐药机制和耐药性检测的研究意义重大。结核菌的耐药性的产生主要是由于不合理用药引起的结核菌内抗结核药物作用靶基因突变所致[2]。目前检测结核菌耐药性的方法有表型检测和基因型检测两大类。 一、结核菌的耐药机制 染色体基因变异是结核菌产生耐药性的主要机制。结核菌95%以上的基因变异是直接由于抗结核药物引起[2]。细菌可以通过染色体自身突变或者外源遗传因子如质粒或转座子而获得耐药性,但迄今为止结核菌中尚未发现质粒和转座子介导的耐药[2]。Musser等经大量研究发现大约12种基因突变和结核菌的耐药性有关。已确定主要为基因突变引起耐药性的抗结核药有利福平(RFP)、异烟肼(INH)、链霉素(SM)、吡秦酰胺(PZA)、乙胺丁醇(EMB)、喹诺酮类等。 1.RFP通过和结核菌中DNA依赖的RNA聚合酶的结合来抑制转录过程,导致细胞死亡[3]。96%RFP耐药菌株的产生是因为编码该酶β亚基的rpoB基因发生改变所致。这些改变主要是集中在rpoB中的81个碱基区域(利福平耐药决定区)内的各种突变,也有少量碱基插入或缺失,共35种,其中43%为531-Ser错义突变,此位点突变常见;36%为526-His错义突变。rpoB基因中513、526、531位点突变导致RFP高度耐药(MIC>32 μg/ml),尤以513位点突变产生的耐药性高;514、521、533位点突变导致RFP低度耐药(MIC<12.5 μg/ml)[4]。已知rpoB基因的9种突变同时和结核菌对利福布丁(refabutine)、利福喷丁(refapentine)等的耐药有关[3]。 2.INH被结核菌内过氧化氢-过氧化物酶(由katG基因编码)激活,作用于enoyl-ACP还原酶(由inhA基因编码),抑制杆菌酸和细胞壁合成。结核菌耐INH的机制比较复杂,katG基因的突变、部分缺失是主要机制,该基因的完全缺失在INH耐药株中只占很小一部分但导致高度耐药[5]。多数文献都对KatG基因中315位AGC突变成ACC及463位CGG突变成CTG作了报道,认为这两个突变和耐药性关系密切[6]。但近年来有些学者认为R463/L突变无意义[7]。inhA、katA、ahpC等基因和结核菌对INH的耐药关系正在研究之中,近又提出kasA可能是一个耐药相关基因[8]。InhA 突变也对乙硫异烟胺1314th(ETH 1314th)耐药[3]。
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多重耐药绿脓假单胞菌耐药基因及亲缘性分析
为了解我院临床分离的绿脓假单胞菌(Pa)多重耐药原因,我们采用分子生物学技术检测了18种β内酰胺类药物耐药相关基因, 5种氨基糖苷类修饰酶编码基因和消毒剂-磺胺耐药基因(qacE△1-sulⅠ), 并以耐药基因为分子标记作聚类分析.
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新生儿感染耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌耐药基因的研究
为了解新生儿败血症中分离的耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)对消毒剂和抗菌药物的耐药基因状况,我们收集了40株新生儿血液感染的MRCNS进行了β内酰胺类耐药相关基因mecA、红霉素耐药相关基因ermA/B/C、消毒剂耐药相关基因qacA/B等基因检测.
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结肠癌耐药细胞株LoVo/5-FU的建立及其差异表达基因的筛选
目的:建立结肠癌细胞耐药模型LoVo/5-FU并初步筛选可能的耐药相关基因.方法:采用5-FU浓度递增法建立人结肠癌细胞耐药模型LoVo/5-FU,观察其生长规律并绘制细胞生长曲线;用MTT法鉴定耐药细胞株耐药性并计算耐药指数(RI);用基因芯片技术检测耐药细胞株LoVo/5-FU与其亲本细胞株LoVo中的差异表达基因,从中筛选出可能的耐药相关基因;用半定量RT-PCR方法对筛选出的部分耐药相关基因在耐药细胞及其亲本细胞中的表达情况进行验证.结果:LoVo/5-FU细胞与LoVo细胞相比,生长缓慢,细胞体积增大.LoVo/5-FU对5-FU、ADM、MMC耐药,而对CDDP无耐药性(RI:7.69,2.78,1.43和0.96).通过基因芯片筛选出差异表达基因425个,可能的耐药相关基因包括CYP1B1,NAT2,RNF20,SNAI2,MAP3K2,其中CYP1B1在LoVo/5-FU与LoVo中的表达有明显差异(Cv5/Cy3=5.877).结论:LoVo/5-FU细胞株耐药性稳定,耐药机制可能与CYP1B1,NAT2等耐药相关基因有关.
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河南省耐多药结核分枝杆菌利福平耐药相关基因rpoB突变分析
目前认为,编码RNA聚合酶beta亚基rpoB基因突变,使利福平不能与其结合而产生对利福平耐药[1].单耐利福平菌株的rpoB基因突变多分布在利福平耐药决定区(rifampin resistance determining region,RRDR),且通过检测RRDR区内特定突变可发现95%~98%的利福平耐药菌株[1],但仍有2%~5%耐药菌株的耐药机制不明.本研究对较大样本量的耐多药MTB利福平耐药相关基因rpoB编码区进行突变分析,以进一步阐明其耐药机制.
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天津市耐异烟肼或利福平的结核分枝杆菌相关基因突变特征
目前已知多个基因突变与MTB对异烟肼和利福平的耐药有关,但是不同的基因密码子突变率存在地区差异.为此,我们检测了天津市结核病患者异烟肼耐药株katG和inhA启动子以及利福平耐药株rpoB的突变情况,探讨其耐药相关基因的突变特征及基因突变与耐药表型的相关性.
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铜绿假单胞菌耐药性的基因学研究进展
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)又称绿脓杆菌,是引起急性或慢性感染的常见的条件致病菌之一,由其引起的院内感染往往治疗难度极大,几乎具有目前已知的细菌主要耐药机制,已成为引起院内获得性肺炎多重耐药革兰阴性菌的代表[1-2]。PA感染是治疗的难题,归其原因,在于其广泛而多重的耐药性。因此,了解铜绿假单胞菌的耐药相关基因的情况,有助于临床研发更有效的治疗铜绿假单胞菌感染性疾病的抗菌药物。PA的耐药机制概括起来主要有以下几个方面:各种外排泵系统的过度表达、外膜通透性的降低、药物作用靶位的改变、氨基糖苷类修饰酶的产生、细菌生物被膜形成以及产生抗菌药物灭活酶等。由于这些机制可以共存,故PA往往具有多重耐药性。本文主要对上述几种耐药机制的相关耐药基因的进展作一综述。
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多药耐药肺炎克雷伯菌尿液分离株检出gyrA基因新亚型
目的 了解1株多药耐药肺炎克雷伯菌的遗传学背景.方法 采用聚合酶链反应(PCR)的方法分析1株多药耐药肺炎克雷伯菌可能存在的65种耐药相关基因:包括β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类耐药相关基因及可移动的遗传元件(整合子、转座子、接合性质粒)遗传标记、抗菌制剂外排泵基因.结果 该株多药耐药肺炎克雷伯菌耐β-内酰胺类药物基因检出blaTEM,耐氨基糖苷类药物基因检出aph(3’)-Ⅰ,耐喹诺酮类药物基因检出gyrA,Ⅰ类整合子遗传标记检出intⅠ 1,转座子遗传标记检出tnp513,接合性质粒遗传标记检出trbC;抗菌制剂外排泵基因检出qacE△1-sul1,gyrA基因是新亚型(GenBank登录号:JN232083),83位密码子突变方式为TCG→TTC,导致氨基酸从丝氨酸(S)→苯丙氨酸(F);87位密码子突变方式为GAC→GCC,导致氨基酸从天冬氨酸(D)→丙氨酸(A).结论 携带多药耐药基因和抗菌制剂外排泵基因是这株肺炎克雷伯菌呈多药耐药的主要原因,携带多种可移动遗传元件使细菌的耐药性在同种细菌菌株之间,甚至不同种细菌菌株之间得以快速传播.
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耐药基因与凋亡相关基因在肺癌中的表达及其意义
是肺癌综合性治疗的重要措施之一,但多药耐药如耐药相关基因P-gp,GSH/GSTs解毒系及ToPo质与量改变等的共同作用,是导致肺癌化疗失败的主要原因之一.我们应用免疫组化S-P法检测肺癌组织耐药基因与细胞凋亡相关基因的表达,并探讨它们之间的关系及临床意义.
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克隆肺腺癌亲代细胞A549与耐顺铂细胞A549DDP耐药相关基因的差异表达片段
目的克隆肺腺癌耐药相关基因。方法以mRNA差异显示技术检测耐顺铂肺腺癌细胞A549DDP及其亲代细胞A549基因表达的差异。差异表达基因片段被克隆并经Northern blot证实。结果获得4个基因表达的差异cDNA片段,经测序、同源性分析,其中2个片段(A1、D1)在GeneBank中未发现同源序列,一个片段(A2)与白介素-1β转化酶(Interleukin 1β converting enzyme,ICE)89%同源性,一个片段(D2)与MM45s rRNA(Mouse musculus 45s pre-rRNA)基因100%同源。A1、A2 cDNA片段仅表达于A549细胞,D1、D2 cDNA片段仅表达于A549DDP细胞。结论应用mRNA差异显示技术获得4个肺腺癌A549与A549DDP间的基因差异表达片段。2个新的差异表达片段以及与ICE、MM45s RNA高度同源的基因片段是否与耐药相关尚需进一步研究。
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紫杉醇对卵巢癌耐药细胞SKOV3/TAX基因表达谱的影响及耐药机制的探讨
目的 应用高通量Affymetrix人类基因组U133A基因芯片,比较耐药细胞SKOV3/TAX与亲代细胞SKOV3间基因表达差异,筛查获得性紫杉醇卵巢癌耐药的相关基因,为进一步探讨卵巢癌肿瘤耐药机制及临床逆转耐药提供依据.方法 取对数生长期SKOV3、SKOV3/TPT细胞,按Trizol一步法抽提细胞总RNA,使用RNeasy Total RNA Isolation kit进一步纯化总RNA,合成双链cDNA,生物素进行标记,应用Affymetrix人类基因组U133A基因芯片,检测卵巢癌耐药细胞株SKOV3/TAX与敏感细胞株SKOV3细胞基因表达谱的变化,选择差异表达基因,在genbank中明确差异表达基因的功能,寻找与卵巢癌对紫杉醇耐药相关基因.结果 基因芯片检测结果发现,与敏感细胞相比,有111条基因表达有显著性差异,包括45个上调基因和66个下调基因.涉及癌基因、DNA合成、修复、细胞信号和传递蛋白、蛋白翻译合成类以及细胞骨架和运动、离子通道蛋白、细胞代谢、发育相关等相关基因.与耐药有关的上调基因有CLU、BCL2L1、CD24、POR、BSG、SIRPA、PRKCA等;下调基因有YES1、CAV1、TGFBI、HSPH1等.结论 部分基因表达差异与卵巢癌应用紫杉醇化疗耐药有关.
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MDR1、GST-π、p53、bcl-2在上皮性卵巢癌的表达及意义
目的:探讨MDR1、GST-π、p53、bcl-2与上皮性卵巢癌临床病理学特性的关系.方法:采用免疫组化SP法检测 89 例不同性质卵巢组织中MDR1、GST-π、p53、bcl-2的表达情况.结果:①上皮性卵巢癌,交界性肿瘤,良性上皮性肿瘤,正常卵巢组织中四种指标的表达情况:MDR1依次为22/52(42.3%)、3/9(33.3%)、0/21、0/7,GST-π依次为43/52(82.7%)、5/9(55.6%)、1/21(4.8%)、0/7,p53依次为 34/52(65.4%)、1/9(11.1%)、0/21、0/7,bcl-2 依次为31/52(59.6%)、5/9(55.6%)、2/21(9.5%)、1/7(14.3%).四个指标在上皮性卵巢癌中的表达率显著增高;②化疗耐药与MDR1和GST-π相关;③p53表达与肿瘤分期和组织分化程度相关;bcl-2表达与一定的组织类型相关;④p53与bcl-2;p53与MDR1;bcl-2与GST-π间表达具有一定相关性.结论:MDR1、GST-π、p53、bcl-2的过度表达在上皮性卵巢癌中常见,并与一定的临床病理情况有关;MDR1和GST-π的检测有助于临床预测化疗效果;凋亡调节基因与耐药相关基因的关系需进一步探讨.