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hnRNP K调控细胞自噬参与急性髓系白血病阿霉素耐药研究
目的:探索核内不均一的核糖核蛋白K(hnRNP K)调控细胞自噬参与急性髓系白血病耐药机制,为白血病治疗提供新的分子标志物.方法:应用荧光定量PCR技术,分别从临床标本及细胞株水平验证hnRNP K与髓系白血病耐药的关系;利用RNA干扰技术调节hnRNP K的表达水平,Western blot方法检测细胞自噬相关蛋白LC3I/Ⅱ表达变化,并进一步检测hnRNPK调控前后细胞对化疗药物(阿霉素)的敏感性.结果:在骨髓未缓解及复发的原代细胞及耐药细胞株中,hnRNP K的表达水平明显增高,而细胞自噬相关蛋白LC3I/Ⅱ表达水平也明显升高,将hnRNP K的表达水平降低后,LC3I/Ⅱ蛋白水平亦降低,而细胞对于阿霉素的敏感性可以恢复.结论:hnRNPK可能通过调控细胞自噬参与急性髓系白血病阿霉素耐药的形成.
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二氢杨梅素对K562/A02细胞阿霉素耐药性的逆转作用
目的:探讨二氢杨梅素(dihydromyricetin,DMY)对人慢性粒细胞白血病耐药细胞株K562/A02细胞对阿霉素(adriamycia,ADM)耐药的逆转作用及可能机制.方法:用DMY(5、10、20、40、60、80和100 mg/L)和ADM((0.05-100 mg/L)处理K562和K562/A02细胞48 h,采用MTT法检测细胞活力及DMY对K562/A02细胞ADM耐药的逆转效应,流式细胞术检测细胞内阿霉素的相对浓度,Western blot检测耐药相关基因的p-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance related protein 1,MRP1)、谷胱甘肽转移酶π(glutathione transferaseπ,GSTπ)和BCL-2蛋白表达.结果:DMY能抑制K562和K562/A02细胞的增殖且呈剂量依赖效应(r1 =0.37,r2 =0.38),IC50分别为71.23±6.51和72.88±5.49 mg/L.5、10和20 mg/L为DMY的低细胞毒性剂量.DMY(5、10和20 mg/L)增敏K562细胞和K562/A02细胞对ADM耐药性且呈剂量依赖效应(r1=-0.62,r2=-0.71),耐药逆转倍数介于1.38-28.59之间.DMY(5,10和20 mg/L)增加K562/A02细胞内ADM的浓度也呈剂量依赖效应(r=0.34).与对照组比较,DMY(5,10和20 mg/L)均显著降低了K562/A02细胞中PgP、MRP1、GSTπ和BCL-2蛋白表达,呈剂量依赖性(r1=-0.41,r2=-0.37,r3=-0.58,r4=-0.46).与ADM组比较,DMY(5,10和20 mg/L)+ADM组P-gp、MRP1、GSTπ和BCL-2蛋白表达均显著降低(r1=-0.55,r2=-0.41,r3=-0.38,r4=-0.44).结论:DMY可以逆转K562/A02细胞对ADM的耐药性,其作用机制可能与下调耐药相关基因P-gp、MRPI、GSTπ和BCL-2的表达有关.
关键词： 二氢杨梅素 K562/A02细胞 阿霉素耐药 耐药相关基因 -
线粒体转移引起肿瘤细胞阿霉素耐药的机制研究
目的 探讨肿瘤细胞与成纤维细胞之间是否存在线粒体转移现象,研究发生线粒体转移后对肿瘤细胞抗药性的影响.方法 分别采用荧光蛋白标记肿瘤细胞和成纤维细胞线粒体.采用激光共聚焦显微镜观察细胞和线粒体的形态.采用流式细胞仪分析并分选双阳性细胞群体.采用MTT法检测阿霉素对细胞的增殖抑制作用.结果 成功构建HCT-15/GFP细胞和NIH3T3/mito-RFP细胞.从两种细胞共培养体系中,分选出GFP+/RFP+双阳性细胞,比率为3.32%±0.58%.HCT-15/GFP+/RFP+对阿霉素的敏感性较HCT-15/GFP显著下降,化疗抗性提高了3.18倍.结论 成纤维细胞中的线粒体能向肿瘤细胞进行转移.发生线粒体转移的肿瘤细胞对阿霉素出现了耐药现象.这为阿霉素耐药提出了新的作用机制.
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JNJ-7706621对阿霉素耐药乳腺癌细胞生长的抑制作用研究
目的 研究JNJ-7706621对人阿霉素耐药MCF-7/ADR乳腺癌细胞生长的作用.方法 采用MTT试验检测JNJ-7706621对MCF-7/ADR耐药细胞生长的影响;采用TUNEL染色试验分析JNJ-7706621对MCF-7/ADR耐药细胞凋亡的激活作用;Caspase酶活性检测分析JNJ-7706621处理后,MCF-7/ADR细胞中Caspase-8、Caspase-9活化程度;应用流式细胞周期分析检测JNJ-7706621对MCF-7/ADR耐药细胞周期的影响.结果 JNJ-7706621能有效抑制阿霉素耐药细胞MCF-7/ADR的生长,并呈现明显的浓度依赖性,作用48 h的IC50仅为0.83 μmol/L.2 μmol/L JNJ-7706621作用24 h后,TUNEL染色阳性的MCF-7/ADR细胞比率较对照组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);MCF-7/ADR细胞中Caspase-8、-9酶活性均显著升高,差异亦具有统计学意义(P<0.05).在1 μmol/L JNJ-7706621作用24 h后,G2/M期细胞比率由对照(7.1±1.3)%升高至(23.8±3.1)%,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 JNJ-7706621能同时激活内外源性凋亡途径,诱导MCF-7/ADR细胞凋亡的发生,并将MCF-7/ADR细胞周期阻滞在G2/M期,从而对阿霉素耐药MCF-7/ADR细胞的生长发挥有效抑制作用.
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长春瑞滨联合顺铂治疗阿霉素耐药的晚期乳腺癌的效果研究
目的:分析长春瑞滨联合顺铂治疗阿霉素耐药的晚期乳腺癌的临床效果,为阿霉素耐药的晚期乳腺癌的临床治疗提供科学参考依据.方法:选取2012年1月-2013年12月本院收治的阿霉素耐药的晚期乳腺癌患者100例作为研究对象,将其随机分为观察组与对照组,各50例.观察组采用长春瑞滨联合顺铂治疗,对照组采用吉西他滨联合顺铂治疗,比较两组的近期疗效、远期疗效、安全性与不良反应.结果:两组患者的近期疗效比较,差异无统计学意义(P>0.05);观察组无进展生存期和总生存时间均明显优于对照组(P<0.05);观察组不良反应发生率均显著低于对照组(P<0.05).结论:长春瑞滨联合顺铂与吉他西滨联合顺铂在治疗阿霉素耐药的晚期乳腺癌的近期疗效相似,但长春瑞滨联合顺铂的远期疗效更加显著且安全性更高,值得在临床中推广使用.
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木香烃内酯对K562/A02细胞阿霉素耐药的逆转作用研究
目的：探索木香烃内酯对白血病耐药细胞系 K562/A02阿霉素耐药的逆转作用。方法将木香烃内酯与 K562/A02细胞共培养72 h后，采用MTT法检测木香烃内酯对细胞生长的抑制作用。不同浓度木香烃内酯处理K562/A02细胞24 h后，采用Annexin V和PI双染法检测木香烃内酯对细胞的凋亡。不同浓度木香烃内酯与阿霉素共培养72 h后采用MTT法检测木香烃内酯对K562/A02细胞的耐药逆转情况。采用流式细胞仪检测木香烃内酯处理24 h之后K562/A02细胞阿霉素蓄积以及细胞膜表面P-糖蛋白（P-gp）的表达。结果木香烃内酯对K562/A02细胞的生长具有明显抑制作用，呈显著的剂量相关性。与对照组比较，2.5～50μmol/L木香烃内酯组K562/A02细胞存活率显著降低（P＜0.05、0.01、0.001）。随着木香烃内酯浓度的增加，凋亡细胞的比例明显增加。与对照组比较，不同浓度木香烃内酯组细胞凋亡比例显著升高（P＜0.05、0.01、0.001）。加入5μmol/L木香烃内酯后，使K562/A02细胞对阿霉素的敏感性提高12倍。木香烃内酯处理后K562/A02细胞内部阿霉素的蓄积明显增加，呈浓度相关性。与对照组比较，5、10μmol/L木香烃内酯组K562/A02细胞内部阿霉素的蓄积增加显著升高（P＜0.05）。细胞表面的 P-gp 的表达并无显著影响。结论木香烃内酯能够抑制 K562/A02细胞增殖，诱导K562/A02细胞凋亡，增强阿霉素的化疗敏感性，逆转阿霉素耐药。
关键词： 木香烃内酯 K562/A02细胞 阿霉素耐药 细胞凋亡 P-糖蛋白 -
解毒胶囊干预乳腺癌阿霉素耐药PTEN-PI3K/AKT信号通路的进展及机制
该文对解毒胶囊治疗乳腺癌的机制进行了研究,主要从阿霉素耐药PTEN-PI3K/AKT信号通路进行分析探讨,综述了解毒胶囊对乳腺癌阿霉素耐药的近况以及研究进展,说明了解毒胶囊干预乳腺癌阿霉素耐药具有很好的发展前景.
关键词： 解毒胶囊 乳腺癌 阿霉素耐药 PTEN-PI3K/AKT通路 -
EZH2过表达在 MCF －7获得性耐药中的作用
目的：探讨EZH2过表达在MCF－7／ADR获得性耐药中的作用。方法应用荧光定量PCR技术和 Western blot技术分别检测EZH2在MCF－7和MCF－7／ADR中的mRNA和蛋白的相对表达量。将带有报告基因eGFP的EZH2 shRNA、EZH2 shRNA－scramble质粒分别转染MCF－7／ADR细胞后，用G418筛选获得稳转细胞株，应用荧光定量PCR技术验证EZH2 shRNA组EZH2 mRNA表达是否被抑制。采用WST－1方法检测EZH2 shRNA、EZH2shRNA－scramble和阴性对照组细胞对阿霉素敏感性的变化情况。结果 MCF－7／ADR中EZH2 mRNA相对表达量约为MCF－7的2．52±1．523倍，MCF－7／ADR中EZH2蛋白相对表达量约为MCF－7的1．58±0．58倍，差异均有统计学意义（ P＜0．05）。 EZH2 shRNA组稳转的细胞株EZH2 mRNA的抑制率约为84％（P＜0．05），加入阿霉素后细胞增殖能力约下降25％（P＜0．05），而EZH2 shRNA－scramble组和阴性对照组加入阿霉素后细胞增殖能力无明显变化。结论在MCF－7／ADR细胞中EZH2 mRNA和蛋白的相对表达量较MCF－7细胞高。沉默EZH2的表达有可能逆转MCF－7／ADR细胞对阿霉素的耐药性。
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姜黄素脂质体通过调节miRNA的表达改变乳腺癌细胞对阿霉素的化疗敏感性
目的 初步研究姜黄素脂质体(CUR)在人乳腺癌细胞株MCF-7中对阿霉素(ADR)药物敏感性的影响,并分析其通过调控miRNA途径的作用机制.方法 以人乳腺癌细胞株MCF-7为亲本细胞,采用低浓度逐步加量法诱导阿霉素耐药株MCF-7/ADR,利用薄膜法制备姜黄素脂质体,MTT法检测姜黄素脂质体增加MCF-7/ADR耐药株敏感性的性能及与阿霉素的协同增效作用,miRNA和mRNA微阵列分析筛选出差异表达的miRNA和mRNA,联合生物信息学预测软件和mRNA微阵列预测差异表达的miRNA可能的靶基因,应用荧光定量PCR验证部分微阵列结果.结果 阿霉素与姜黄素脂质体对MCF-7/ADR的细胞抑制率有协同增效作用.芯片结果显示,与耐药株MCF-7/ADR细胞相比,miRNA和mRNA在亲本MCF-7/ADR细胞和经姜黄素脂质体处理后的MCF-7/ADR细胞中的表达差异明显,共发现67个差异表达的miRNA和323个差异表达的mRNA.根据预测软件和mRNA芯片结果发现20个共同靶基因.qPCR进一步验证hsa-miR-29b-1-5p,hsa-miR-29b-3p,hsa-miR-6068,hsa-miR-6790-5p,has-miR-4417和DDIT4,EPAS1,VEGFA,RPS14,DCDC2在3株细胞中的表达与芯片结果基本一致.结论 姜黄素脂质体能在一定程度上逆转人乳腺癌对阿霉素的耐药性.通过调控miRNA的表达来影响相关信号通路可能是姜黄素脂质体调节乳腺癌细胞对阿霉素药物敏感性的一条重要分子途径.
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AGEs与其受体相互作用与K562及K562/A02细胞耐药性
目的 观察晚期糖基化终末产物( AGEs)与其受体相互作用是否与K562及K562/A02细胞对阿霉素(ADM)耐药性相关.方法 用流式细胞术检测K562及K562/A02细胞晚期糖基化终末产物受体(RAGE)及P-糖蛋白(P-gp)的表达和细胞凋亡率,CCK-8法观察AGEs对K562及K562/A02细胞增殖的影响,计算AGEs作用下两种细胞对ADM的半抑制浓度(IC50)值,用半定量RT-PCR检测mdr1 mRNA相对表达水平.结果 K562与K562/A02细胞RAGE表达比较差异无统计学意义.AGEs可呈浓度和依赖性促进K562及K562/A02细胞增殖(P＜0.05)；AGEs作用K562及K562/A02细胞48h后,K562细胞mdrl mRNA及P-gp的表达均为阴性,K562/A02细胞mdr1mRNA及P-gp的表达与不加AGEs组比较差异均无统计学意义.结论 AGEs不能改变K562细胞对ADM的敏感性,同时亦不能改变K562/A02细胞对ADM的耐药性；AGEs与其受体相互作用与K562及K562/A02细胞耐药性无关.
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抑制自噬对乳腺癌阿霉素耐药的逆转作用
目的 探讨自噬在乳腺癌阿霉素耐药过程中发挥的作用.方法 采用大剂量阿霉素间歇诱导MCF-7细胞;应用MTT法检测阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADM的耐药指数;通过qRT-PCR、Western blot及细胞免疫荧光法检测自噬表达;选用自噬抑制剂3-Methyladenine(3-MA)抑制细胞自噬,并检测MCF-7/ADM细胞株耐药性的逆转情况.结果 乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADM成功建立,MCF-7/ADM细胞对ADM有明显的耐药性,阿霉素抑制MCF-7和MCF-7/ADM细胞存活的IC50值分别为1.0 971 μg/ml和175.8 921 μg/ml,耐药倍数为160(P ＜0.01),且MCF-7/ADM细胞自噬表达升高,加入3-MA的实验组细胞耐药逆转倍数为1.16,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 抑制自噬可部分逆转MCF-7/ADM细胞耐药.
关键词： 乳腺肿瘤 阿霉素耐药 MCF-7/ADM 自噬 3-Methyladenine -
MiR-186-5p通过靶向调控RAB2A在乳腺癌细胞阿霉素耐药性中的逆转作用机制
目的 探讨miRNA-186-5p在乳腺癌细胞阿霉素耐药性逆转作用中的分子机制.方法 采用阿霉素诱导人乳腺癌细胞系MCF-7,建立阿霉素耐药性细胞株,命名为MCF-7/ADR;采用双荧光素酶实验检测miR-186-5p与RAB2A的靶向结合情况;采用qRT-PCR和Western blot分别检测细胞中miR-186-5p、RAB2A mRNA的表达及RAB2A蛋白的表达情况;特异性上调MCF-7/ADR中的miR-186-5p,下调MCF-7中的miR-186-5p后,采用CCK-8和Western blot分别检测乳腺癌细胞增殖情况以及RAB2A蛋白的表达;采用Western blot和CCK-8分别检测共转染后,细胞增殖情况的变化及PI3K/Akt信号通路的激活情况.结果 双荧光素酶实验结果显示,RAB2A是miR-186-5p的直接靶点;qRT-PCR结果显示,在MCF-7/ADR细胞中miR-186-5p mRNA表达明显下调,而RAB2A mRNA表达没有明显变化,RAB2A的蛋白表达明显上调.特异性上调MCF-7/ADR中的miR-186-5p,其增殖能力明显下降,RAB2A蛋白的表达明显下调;下调MCF-7中的miR-186-5p,其增殖能力明显增加,RAB2A蛋白的表达明显上调.Western blot和CCK-8结果显示,过表达miR-186-5p使PI3K/Akt信号通路表达明显减弱,且上调RAB2A逆转了上调miR-186-5p所致的增殖能力的减弱.结论 miR-186-5p通过靶向调控RAB2A,经PI3K/Akt信号通路调控乳腺癌细胞的阿霉素耐药和增殖.
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Salinomycin对乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7／DOX的增殖抑制作用及机制
目的：本研究旨在探讨 Salinomycin 对乳腺癌阿霉素耐药细胞株 MCF-7／DOX 增殖和凋亡的影响及可能作用机制。方法MTS 实验检测 Salinomycin 对 MCF-7／DOX 细胞增殖的影响；Annexin V-FITC ／PI 染色检测 Salinomycin 对MCF-7／DOX 耐药细胞凋亡的影响；DCFH-DA 染色检测 Sali-nomycin 对 MCF-7／DOX 耐药细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生的影响；JC-1法测定细胞线粒体膜电位；Western blot 法检测细胞凋亡相关蛋白 BAX、BCL-2、caspase-3和 caspase-9的表达变化。结果Salinomycin 能明显抑制MCF-7／DOX 耐药细胞增殖，且具有浓度依赖性；流式分析发现 Salinomycin 能够诱导 MCF-7／DOX 细胞凋亡，增加细胞内ROS 水平，降低细胞线粒体膜电位；与对照组相比较，Salino-mycin 处理明显抑制 BCL-2的表达，上调 BAX、cleaved caspase-3和 cleaved caspase-9的蛋白表达；抗氧化剂 N-ace-tylcysteine（NAC）则逆转上述作用。结论Salinomycin 能够诱导 MCF-7／DOX 细胞凋亡，其机制可能与 Salinomycin 诱导ROS 的产生，激活线粒体凋亡途径有关。
关键词： 乳腺癌 Salinomycin 阿霉素耐药 细胞凋亡 活性 -
乳腺癌耐药性中MAPK信号转导通路与EGR-1关系的研究
目的 探讨乳腺癌细胞阿霉素耐药中p38MAPK通路与EGR-1活性的关系.方法 用流式细胞术、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、RT- PCR及Western Blot等方法分别检测SB203580 (15μmol/L)干预后细胞的凋亡、细胞内阿霉素浓度及细胞对阿霉素敏感性的改变;EGR-1 mRNA表达及p-gp、磷酸化p53蛋白及p38蛋白表达情况.结果 经SB203580(15μmol/L)干预,流式细胞仪检测见MCF-7/Adr细胞发生显著凋亡,并呈一定时间依赖性;细胞内阿霉素浓度显著增加;MCF-7/Adr细胞对阿霉素药物的耐受性显著降低;伴随p38MAPK通路活性抑制和EGR-1 mRNA表达增加,磷酸化p53蛋白表达显著上调,而p-gp蛋白显著下调.结论 提示p38MAPK通路与乳腺癌细胞阿霉素耐药密切相关,p38MAPK通路调控的EGR-1激活参与乳腺癌细胞阿霉素耐药的形成.
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乳腺癌耐药性与MAPK信号转导关系的研究
目的 探讨乳腺癌细胞阿霉素耐药性与p38MAPK通路的关系.方法 用流式细胞术检测SB203580 (15μmol/L)干预后细胞的凋亡、细胞内阿霉素浓度的改变、细胞对阿霉素敏感性.结果 经SB203580(15μmol/L)干预24h和48h后,流式细胞仪检测见MCF-7/Adr细胞发生显著凋亡,凋亡率分别为25.36±1.17%和38.21±1.25%,并呈一定时间依赖性 (P<0.05);显著高于空白对照组及DMSO组MCF-7/Adr细胞的0.65±0.21%和0.81±0.16% (P<0.01);细胞内阿霉素浓度亦显著增加,平均荧光强度分别为32.45±2.36及41.66±3.12,均显著高于空白对照组及DMSO组的14.17±1.45及16.28±0.63 (P<0.01);另外,SB203580干预48h使MCF-7/Adr细胞内阿霉素浓度增加的作用强于24h组,两者间差异有统计学意义 (P<0.05).结论 提示p38MAPK通路与乳腺癌细胞阿霉素耐药密切相关.
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雷公藤红素对阿霉素耐药乳腺癌细胞生长的抑制作用研究
目的 研究雷公藤红素对人阿霉素耐药MCF-7/ADR乳腺癌细胞生长的作用.方法 采用MTT试验检测MCF-7/ADR细胞对阿霉素的耐药情况以及雷公藤红素对MCF-7/ADR细胞生长的影响;采用Annexin V-FITC/PI双染试验分析雷公藤红素对MCF-7/ADR耐药细胞凋亡的诱导作用;应用流式细胞周期分析检测雷公藤红素对MCF-7/ADR耐药细胞周期的影响.结果 MCF-7/ADR细胞对阿霉素耐药指数达14.54;而雷公藤红素能有效抑制阿霉素耐药细胞MCF-7/ADR的生长,并呈现浓度依赖性,作用48 h的IC50是1.04 μmol/L,MCF-7/ADR对雷公藤红素的耐药指数仅为0.87.2 μmol/L雷公藤红素作用8 h后,Annexin V-FITC染色阳性的MCF-7/ADR细胞比例较对照显著升高,差异有统计学意义(P<0.05).在1 μmol/L雷公藤红素作用24 h后,G1期细胞比例由对照(59.22±3.78)%升高至(77.44±4.21)%,而S期细胞比例由对照(37.51±2.91)%降至(19.65±2.25)%,差异有统计学意义(P<0.05).结论 雷公藤红素能激活MCF-7/ADR细胞凋亡的发生,并诱导MCF-7/ADR发生 G1/S细胞周期阻滞,从而对阿霉素耐药MCF-7/ADR细胞的生长发挥高效抑制作用.
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siRNA沉默c-FLIP对K562/ADR耐药性的影响
目的：探讨c-FLIP siRNA干扰c-FLIP mRNA水平对阿霉素耐药细胞K562/ADR的耐药性的影响及作用机制。方法应用siRNA干扰的方法抑制K562及K562/ADR细胞c-FLIP的表达，通过荧光定量PCR的方法检测c-FLIP mRNA表达及对多药耐药基因MDR1 mRNA水平的影响。MTT法检测c-FLIP干扰与否对K562及K562/ADR细胞增殖的影响，Annexin V/7-ADD双染研究c-FLIP干扰与否对K562及K562/ADR细胞凋亡的影响。结果与阴性siRNA转染组相比较，c-FLIP siRNA转染下调K562细胞中c-FLIP的mRNA后，K562细胞增殖受到一定程度的抑制(P<0.05)，但是并未显著诱导细胞凋亡，c-FLIP干扰与否K562细胞48 h增殖率分别为(69.14±1.82)%和(60.69±2.23)%，凋亡率分别为(1.7±0.3)%和(1.8±0.2)%。与阴性siRNA转染组相比较， c-FLIP siRNA转染抑制K562/ADR细胞中c-FLIP的mRNA后，K562/ADR细胞增殖显著被抑制(P<0.05)，并显著诱导了细胞凋亡增加(P<0.05)，c-FLIP干扰与否K562/ADR细胞48 h增殖率分别为(-6.07±0.71)%和(-37.45±3.53)%，凋亡率分别为(5.2±0.4)%和(9.2±0.4)%。并且c-FLIP siRNA下调c-FLIP mRNA水平后，K562/ADR细胞中的多药耐药基因MDR1的mRNA表达水平也被显著下调(P<0.05)。结论 c-FLIP siRNA下调K562/ADR细胞中c-FLIP的mRNA水平抑制了多药耐药基因MDR1的表达，从而抑制了K562/ADR细胞对阿霉素的耐药性。
关键词： c-FLIP siRNA MDR1 K562/ADR 阿霉素耐药
