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阿霉素诱导Egr-1启动子调控GM-CSF基因表达的实验研究
本研究探讨阿霉素(ADM)诱导Egr-1启动子调控造血生长因子基因表达对化疗后造血损伤的修复作用.构建携带Egr-1调控序列启动的GM-CSF和eGFP双顺反子基因pCIneo真核表达载体(Egr-EG);通过脂质体转染骨髓基质细胞系HFCL,挑出G418抗性的阳性克隆(HFCL/EG);采用流式细胞仪和倒置荧光显微镜观察eGFP绿色荧光表达的阳性细胞;在加入ADM的HFCL/EG细胞培养体系中,用ELISA方法检测GM-CSF的含量;将从脐血中分离的单个核细胞接种于含有ADM后的HFCL/EG上清培养液中,观察其对CFU-GM的增殖作用;采用活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸鉴定化疗通过活性氧诱导Egr-1启动子CArG序列调控下游基因表达的特异性.结果表明:成功地构建了Egr-1调控序列启动的双顺反子基因表达载体(Egr-EG);在HFCL/EG细胞中有外源性基因eGFP和GM-CSF的表达.在加入ADM后HFCL/EG细胞培养上清液中GM-CSF含量和CFU-GM形成数量较未加ADM组明显增高(p＜0.01);在ADM处理的HFCL/EG细胞中,N-乙酰半胱氨酸明显降低GM-CSF水平.结论:ADM诱导Egr-1启动子调控的造血生长因子基因表达对化疗后的造血损伤具有一定的修复作用.
关键词： Egr-1 阿霉素 粒-巨噬细胞集落刺激因子 骨髓基质细胞 活性氧中间物 -
T细胞白血病病毒1型Tax蛋白阳性细胞中早期生长反应基因-1对NF-κB活性的影响
目的 观察人T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax蛋白阳性细胞中早期生长反应基因-1(EGR-1)与NF-κB的关系.方法 RT-PCR扩增MT2细胞中EGR-1的cDNA全长,连接于真核表达载体pcDNA3.0;用脂质体介导的方法将pcDNA3.0-EGR-1转染TaxP/TaxN细胞,48 h后PCR检测EGR-1和p65 mRNA的表达,Western blot检测EGR-1及p65蛋白的表达;将pcDNA3.0-EGR-1和NF-κB报告基因共转染TaxP及TaxN细胞48 h后检测荧光素酶活性.结果 成功构建了重组表达质粒pcDNA3.0-EGR-1,Tax可以促进EGR-1 mRNA和蛋白的表达;EGR-1可以促进TaxP细胞p65 mRNA和蛋白的表达,上调NF-κB活性.结论 EGR-1可能通过促进NF-κB活化参与成人T淋巴细胞白血病(adult T-cell leukemia,ATL)的发病.
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吗啡慢性处理和吗啡戒断对PC12细胞Egr-1基因表达的影响
目的:探讨Egr-1基因在吗啡慢性处理或吗啡戒断细胞中的表达以及在吗啡成瘾过程中的作用.方法:分别用浓度为0、1、10、100和1000 μmol/L的吗啡和0、0.01、0.1、1和10 μmol/L纳洛酮急性处理PC12细胞,1h后Egr-1蛋白免疫荧光染色.吗啡慢性处理实验分4组,A组,B组、C组和D组.C组和D组细胞加入100 μmol/L吗啡,培养48h,A组和B组仅加入同体积0.9%氯化钠.48h后B组和D组给予10 μmol/L纳洛酮拮抗,A组和C组加入同体积0.9%氯化钠.在纳洛酮拮抗后1、2、4、8和24h,Egr-1蛋白免疫荧光染色;用MTT比色法观察各组PC12细胞的损害,并用FITC-Annexin Ⅴ/PI流式凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率.结果:0～100 μmol/L吗啡及各浓度的纳洛酮作用下细胞未见明显Egr-1阳性染色,而1000 μmoL/L时有少量阳性染色细胞.D组在纳洛酮戒断后1 h即出现Egr-1蛋白阳性染色并持续24 h,并在12 h时可见部分细胞折光性能力减弱,细胞中颗粒增多,核固缩并断裂成数个等.C组仅有少许细胞出现Egr-1阳性染色.与A组相比较,C组细胞生存率下降,并在12 h和24 h时差异有统计学意义;而D组生存率则进一步下降,与A组和C组相比差异有统计学意义.FITC-Annexin Ⅴ/PI流式凋亡检测到C组细胞凋亡8.42±2.09%,D组细胞凋亡率则增加到37.62±7.19%.结论:吗啡慢性处理或吗啡慢戒断后出现Egr-1基因表达增加和细胞凋亡,而Egr-1基因的表达增加和细胞凋亡可能参与吗啡成瘾机制.
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PIRES-EGR-1-endostatin基因放疗抗肿瘤效应的实验性研究
肿瘤基因-放疗(gene-radiotherapy,GR)是目前研究热点,电离辐射可启动重组表达载体中早期生长反应因子1(early growth response-1,EGR-1)同时诱导下游基因的超强表达.
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辐射诱导的野生型及突变型PTEN基因重组质粒的构建及鉴定
目的 构建辐射诱导人野生型及突变型PTEN基因重组质粒并进行鉴定.方法 以HeLa细胞总DNA为模板PCR扩增Egr-1基因启动子辐射敏感区,将PCR产物分别定向插入携带野生型PTEN和突变型PTEN蛋白编码基因的表达载体pEGFP-PTEN和pEGFP-PTEN-G129E启动子区,构建具有辐射诱导能力的重组表达质粒pEgr-PTEN和pEgr-PTEN-G 129E.同时,将Egr-1基因启动子辐射敏感区亚克隆入pGL3-Promoter载体中,通过荧光素酶报告实验,验证不同照射剂量、照射后不同时间点下人肝癌SMMC-7721细胞中Egr-1启动子区对X线照射的辐射诱导能力.Western印迹检测X线照射对PTEN蛋白表达的影响.结果 凝胶电泳分析证实,PCR扩增出Egr-1基因启动子辐射敏感区,构建出具有辐射诱导能力的重组表达质粒pEgr-PTEN和pEgr-PTEN-G129E,经不同酶切实验均证实含有与Egr-1辐射诱导区和PTEN基因相同片段大小的条带.荧光素酶报告实验证实,在不同时间点和不同照射剂量照射下,含Egr-1启动子区报告质粒细胞组的荧光素酶活性均明显高于转染空载体细胞,Western印迹检测表明,转染了pEgr-PTEN和pEgr-PTEN-G129E的细胞组在未接受照射时PTEN蛋白的表达量极低,但在接受8 Gy的X线照射后,PTEN蛋白的表达量明显提高,高于转染了pEGFP-pTEN和pEGFP-PTEN-G129E的细胞.结论 成功构建了具有辐射诱导能力的含人野生型及突变型PTEN基因的重组质粒,为今后肿瘤的治疗奠定了基础.
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X射线全身照射诱导小鼠胸腺Egr-1和Egr-4基因表达水平的实时定量RT-PCR分析
目的 应用实时定量RT-PCR技术检测X射线伞身照射诱导小鼠胸腺Egr-1和Egr-4基因的表达变化.方法 小鼠接受X射线全身照射后4和24 h,提取胸腺mRNA,以GAPDH作为内参基因,利用实时定量RT-PeR检测方法,探讨Egr-1和Egr-4基因的相对表达量与不同照射剂量之间的关系.同时计数骨髓嗜多染红细胞微核率作为辐射生物剂量参照.结果 Egr-l和Egr-4基因表达量在0.5～6 Gy全身照射后4和24 h均与照射剂量之间存在显著的相关性(r=0.974,0.987,0.978,0.999,P<0.01),其剂量效应曲线可拟合成线性平方方程.各剂量点Egr-1和Egr-4基因表达量与骨髓嗜多染红细胞微核率高度相关(r=0.866、0.947、0.983、0.835,P<0.05).进一步分析表明,照射后4 h Egr-4基因表达不仅剂量效应关系良好,且增幅为明显,并与骨髓嗜多染红细胞微核率的剂量效应曲线相平行.结论 实时定量RT-PCR技术检测Egr-4基因的早期表达有可能成为建立大批量、快速辐射生物剂量估算方法的候选者.
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艰难梭菌毒素A 对白血病细胞株K562增殖、凋亡及相关基因调控的研究
目的 探讨艰难梭菌毒素A(TcdA) 对白血病细胞株K562 增殖、凋亡的作用及其机制.方法采用四唑蓝比色试验( MTT) 检测TcdA 对K562 细胞增殖的影响;流式细胞术(FCM) 检测细胞凋亡情况;RT-PCR 法检测TcdA 作用后细胞Bcl-2 /Bax,Egr-1mRNA 表达的变化.结果 TcdA能抑制K562细胞的增殖,作用48h 后的抑制率(IR) 为47.67%,流式细胞仪分析出现典型的亚二倍体峰( 凋亡峰).TcdA 作用后K562 细胞Bcl-2 基因表达下调,Bax 基因表达上调,而Egr-1 基因表达上调,并呈量效关系.结论艰难梭菌毒素A 可诱导K562 细胞凋亡,其机制可能与下调Bcl-2,上调Bax,上调Egr-1 基因表达水平有关.
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Egr-1的诱骗性脱氧核苷酸对大鼠颈总动脉损伤后内膜增生的影响
目的:针对大鼠Egr-1的诱骗性寡脱氧核苷酸(decoy ODN),作用于损伤后的动脉内膜,观察其对血管损伤后新生内膜增生的影响.方法:行HE染色观察血管内膜、中膜的厚度改变,并分组进行计算机图象分析,计算出内膜/中膜(I/M)的面积比.结果:治疗组与同一时间点对照治疗组和对照组相比,内膜增生受到抑制,两者之间差异有显著性(P＜0.01).结论:decoy ODN通过诱骗转录因子与它结合,下调转录因子所调控的基因表达,减轻了大鼠动脉损伤后新生内膜的增生程度.
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早期生长反应基因-1在急性肺栓塞大鼠肺组织中表达
目的:研究早期生长反应基因-1在急性自体血栓肺栓塞大鼠肺组织不同时间点的表达.方法:采用改良右心导管法建立大鼠自体血栓急性肺栓塞模型,动态监测肺动脉压,结合肺灌注扫描ECT影像和组织病理镜下观察评估,用免疫组化、逆转录一聚合酶链反应检测Egr-1蛋白和mRNA表达.结果:模型组肺动脉压在注栓后0.5 h明显升高,2 h达到峰值,能维持4 h,和同时间点对照组比较(P<0.01).造模后1 h,ECT扫描可见明显充盈缺损,HE染色镜下观察见注入血栓团块.免疫组化法显示Egr-1蛋白在造模后2 h的支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞和肺血管平滑肌细胞表达显著升高,和同时间点对照组比较(P<0.01),4 h后表达逐渐下降,RT-PCR法显示mRNA同步改变.结论:Egr-1在对照组肺组织中仅低水平表达,在急性肺栓塞肺组织2 h表达显著升高,表达具有组织细胞特异性,可能是急性肺栓塞后病理变化的重要环节.
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Egr-1基因的辐射生物学效应研究进展
Egr-1(early growth response-1)基因是一系列“立即早期基因(immediate early gene)”之一，参与细胞的多种辐射生物效应。研究表明，Egr-1在多种正常细胞和肿瘤细胞受到电离辐射后的早期就能被激活，它的激活表达与辐照后细胞的生长、周期、凋亡等的改变密切相关。另外，Egr-1基因调控序列具有辐射可诱导特性，这一特点使其具有潜在的临床和基因工程生产应用前景。
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辐射敏感性早期生长应答-1基因启动子的研究
肿瘤基因放射治疗已成为研究热点,早期生长应答-1(Egr-1)基因启动子为肿瘤基因放射治疗提供一种可能的方法.综述了Egr-1基因启动子及应用Egr-1基因启动子构建辐射诱导调控系统的研究.
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光动力法配合激素治疗对增生性瘢痕患者VSS评分改善效果及p-STAT3 Egr-1表达的影响
目的:探讨光动力法配合激素治疗对增生性瘢痕患者VSS评分改善情况及p-STAT3、Egr-1表达的影响.方法:选取2014年1月至2016年7月增生性瘢痕患者124例,按照随机数字表将其分为对照组和观察组,每组各62例.对照组单纯使用糖皮质激素进行治疗,观察组在对照组基础上联合光动力疗法治疗,分别对两组患者治疗前后不同时间VSS评分、疗效进行评价并分析,同时检测两组患者治疗前后p-STAT3、Egr-1表达情况.结果:治疗后2个月后观察组的VSS评分显著低于对照组(P<0.05),观察组治疗有效率显著高于对照组(P<0.05).治疗后两组患者p-STAT3、Egr-1水平均显著降低(P<0.05),并且观察组两项指标均显著低于对照组(P<0.05).两组患者不良反应发生率无显著差异(P>0.05).结论:采用光动力法联合糖皮质激素可有效抑制增生性瘢痕患者p-STAT3、Egr-1的表达水平,降低VSS评分,具有更好的治疗效果,并且具有一定安全性.
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APE1/Ref-1、EGR-1在食管鳞癌中的表达及相关性研究
目的 本研究旨在明确APE1/Ref-1和EGR-1在食管鳞癌及癌旁组织中的表达情况,并结合临床资料评估其表达与组织分级和临床分期之间的关系,为进一步研究食管鳞癌的发生发展机制提供参考依据,并为食管鳞癌的预防、诊治提供临床指标.方法 随机选取2009至2010年接受胸外科手术治疗的86例食管癌标本,术前均未经放化疗等任何抗癌治疗.采用免疫组织化学法(S-P法)测定APE1/Ref-1的蛋白、EGR-1的蛋白表达情况,对其相关性进行分析.结果 APE1/Ref-1在ESCC组织中细胞质和细胞核联合阳性表达率为68.6%明显高于癌旁组织的联合阳性表达率8.1%,差异有统计学意义(P<0.01).APE1/Ref-1在癌旁组织中的细胞核阳性表达率为91.9%明显高于ESCC组织的24.4%,差异有统计学意义(P<0.01).EGR-1在ESCC组织的阳性表达率显著低于癌旁组织(P<0.01).结论 在ESCC中,APE1/Ref-1胞核胞质联合表达率随着组织学分级降低和临床分期的升高有增强的趋势,EGR-1的阳性表达率随着组织学分级降低和临床分期的升高有降低的趋势.
关键词： APE1/Ref-1 Egr-1 免疫组织化学 食管鳞状细胞癌 -
Egr－1及NF－κB在大鼠急性心梗心肌组织表达的研究
目的：通过建立心肌梗死大鼠模型，进而且分子生物学手段检测心肌 Egr －1和 NF －κB 的表达，以期为心梗医学鉴定提供更多的数据和更好的方法。方法（1）通过手术建立心肌梗死大鼠模型；（2）应用半定量 PCR 和免疫组织化学法检测心肌组织内 Egr －1的表达；（3）半定量 PCR 方法和 weatern blotting检测 p65表达。结果（1）在术后1～7 d ，有7只死于左心室破裂或急性心力衰竭。其梗死面积可达（44．2±1．8）％；（2）手术组的 Egr －1相对表达量明显高于正常组和假手术组（P ＜0．05）；（3）NF －κB P65在手术组中的表达量高（ P＜0．05）。结论在心肌梗死中有相同的刺激因表使得 NF －κB 和 Erg －1被活化，从而使得其表达量上升为心肌梗死的诊断和预防提供条件。
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辐射诱导Smac表达腺病毒穿梭载体构建及鉴定
目的 构建辐射敏感启动子Egr-1诱导人线粒体促凋亡基因(Smac)表达的腺病毒穿梭载体pshuttle-Egr1-hSmac.方法 利用RT-PCR方法从5月龄流产的胎儿肝脏组织中扩增出人Smac DNA编码序列(CDs),从pMD19T-Egr1质粒上将Egr-1基因切下,利用基因重组技术构建含有辐射诱导启动子Egr1的腺病毒穿梭载体pshut-tle-Egr1-hSmac.结果 经测序证实,获得的人Smac基因与GenBank公布的完全一致,表明克隆人Smac基因成功;pshuttle-Egr1-hSmac分别用EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ和BamH Ⅰ进行单酶切,片段大小分别为2621和5137;1437,2282和4039;3303和4455 bp,酶切鉴定结果与预期结果完全一致,说明质粒pshuttle-Egr1-hSmac构建正确.结论 成功地克隆了人Smac基因和构建了辐射诱导表达的腺病毒穿梭载体pshuttle-Egr1-hSmac.
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大黄灵仙颗粒调控IL-6、EGR-1表达治疗胆石症的实验研究
目的:明确大黄灵仙颗粒对慢性肝损伤胆石病兔模型的疗效,研究中药复方对关键致石因素IL-6、EGR-1表达的调控作用.方法:①将50只雄性新西兰大白兔随机分为3组:正常对照组、肝纤维化胆石病组、肝硬化胆石病组,其中正常对照组10只,其余两组各20只,在金博的慢性肝损伤兔模型构建方法的基础上,同时予高热量、高胆固醇致石饲料,建立慢性肝损伤胆石病兔模型.②造模12周后,病理明确诊断肝损伤形成后,将各组剩余实验兔分别分为对照组、治疗组,其中治疗组每天灌胃中药制剂大黄灵仙颗粒0.4 g/(kg·d),其余各组灌胃等量生理盐水,各组大白兔均正常饲料饲养.用药第13周,麻醉后取肝脏组织,分别使用实时荧光定量PCR、免疫组化等方法进行检测.结果:①常规病理:与对照组相比,用药各组光镜下可见遭到破坏的肝小叶逐渐修复,部分肝细胞形态恢复正常,炎性细胞及纤维组织减少,区域呈点状、片状坏死明显减少;②免疫组化:与对照组相比,喂食大黄灵仙颗粒剂的各组肝窦、汇管区的肝细胞胞浆或胞膜上棕褐色颗粒沉积表达明显减少,小胆管胆汁淤积减少,说明用药后肝损伤得到改善;③qPCR检测结果:与对照各组相比,用药各组的IL-6、EGR-1 mRNA的表达量均有不同程度降低(D＜0.05),说明该药可有效减轻肝损伤.结论:本研究结果表明大黄灵仙颗粒对慢性肝损伤性胆石病动物模型具有较明显的改善和防治作用.
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清肝降脂方对脂肪变性LO2细胞HO-1、Egr-1基因及蛋白表达的影响
目的:通过建立游离脂肪酸体外诱导的LO2细胞非酒精脂肪肝模型,探讨不同剂量的清肝降脂方对肝脏脂肪变LO2细胞HO-1、Egr-1基因及蛋白表达水平的影响.方法:建立游离脂肪酸诱导脂肪变性LO2肝细胞体外模型.人肝LO2细胞采用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基培养,待细胞均匀分布,随机分为6组:正常对照组、模型组、清肝降脂方高剂量组、中剂量组、低剂量组、水林佳对照组,每组6瓶.除正常对照组外,其余5组细胞均以0.5 mmol/L的游离脂肪酸诱导LO2非酒精脂肪肝细胞模型,诱导24 h后,各组随机抽取1瓶进行油红O染色,观察LO2细胞的脂肪化程度.确定模型诱导成功后,正常对照组和模型组分别加入10％正常大鼠血清,低、中、高剂量清肝降脂方药物血清组及水林佳药物血清组添加10％含相对应药物的大鼠血清,培养24h后,收集细胞;采用RT-PCR及Western blot法检测血红素氧化酶-I(HO-1)、早期生长反应因子-1 (Egr-1)的基因及蛋白表达水平.结果:与正常对照组比较,模型对照组LO2细胞HO-1、Egr-1 mRNA和蛋白表达有所增加;与模型对照组比较,自拟清肝降脂方三剂量组和对照药物组HO-1 mRNA及蛋白表达有所增高,Egr-1mRNA和蛋白表达明显降低;与对照药物组比较,清肝降脂方高剂量组HO-1 mRNA表达有所增高,Egr-1 mR-NA表达有所降低.结论:Egr-1高表达可能会导致肝损伤机制之—;HO-1高表达可能是保护肝损伤机制之一;两者可能都是通过调节TNF-α表达来调节NAFLD细胞的损伤进展.清肝降脂方可明显改善LO2细胞Egr-1、HO-1 mRNA及蛋白的表达,可能为其治疗机制、临床诊断和判断进展参考指标.
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EGR-1基因转染对环境中小鼠肾小球系膜细胞TGF-β及PDGF-B表达的影响
目的:观察EGR-1基因转染对高糖环境中小鼠肾小球系膜细胞TGF-β及PDGF-B表达的影响,探讨EGR-1在糖尿病肾病发病机制中的作用.方法:高糖环境中培养小鼠肾小球系膜细胞,采用LipofectamineTM 2000瞬时转染EGR-1质粒,于培养12、24、48小时末,应用MTT法检测细胞增殖程度,免疫细胞化学和Western印迹法检测系膜细胞EGR-1、TGF-β及PDGF-B蛋白表达水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养上清Ⅳ型胶原浓度.结果:高糖环境中肾小球系膜细胞EGR-1、TGF-β及PDGF-B表达增强,细胞增殖明显,细胞上清液中Ⅳ型胶原浓度升高,EGR-1基因转染后上述变化较高糖组更加显著.结论:EGR-1可上调TGF-β及PDGF-B表达,促进系膜细胞增殖及系膜外基质积聚,是加速肾小球硬化的可能机制之一.
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辐射诱导人TRAIL基因表达的腺病毒穿梭质粒的构建及鉴定
目的:构建辐射敏感Egr-1启动子诱导人肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因表达的腺病毒穿梭质粒pshuttle-Egr1-hTRAIL.方法:利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从pACCMV-hTRAIL质粒中扩增得到TRAIL基因片段,并将其连接到pMD19T载体进行测序,利用基因重组技术构建含有辐射诱导启动子Egr-1的腺病毒穿梭质粒pshuttle-Egr1-hTRAIL.结果:PCR扩增出约820bp的片段,测序结果证实扩增片段的序列与GenBank公布(NM-003810)的一致.pshuttle-Egr1-hTRAIL用EcoR I、 Kpn I双酶切重组得到大小为3540和4299bp的2个片段,用Sma I酶切得到1517、2282和4040bp的3个片段,用BamH I酶切得到3304和4535bp的2个片段,与预期结果完全一致.结论:成功克隆了hTRAIL基因,并构建了辐射诱导表达的腺病毒穿梭质粒pshuttle-Egr1-hTRAIL.
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多次小剂量pEgr-IFNγ-Endostatin基因-放射治疗对小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用
目的:探讨多次小剂量pEgr-IFNγ-Endostatin基因-放射治疗对荷Lewis肺癌小鼠的抑瘤效应.方法:将荷瘤小鼠随机分为对照组、10 Gy照射组、4次2.5 Gy照射组、4次质粒组、质粒+10 Gy组和4次(质粒+2.5 Gy)组.小鼠肿瘤局部注射脂质体包裹的质粒后36 h,接受X射线照射,观察各组小鼠治疗后不同时间肿瘤生长速率, 18 d后计数各组小鼠肺转移结节数, 并称量瘤重.结果:治疗后12～18 d,4次(质粒+2.5 Gy)组肿瘤生长速率明显低于质粒+10 Gy组(P＜0.001).治疗后18 d,4次(质粒+2.5 Gy)组小鼠肺转移结节数和瘤重明显低于质粒+10 Gy组(分别为P＜0.001和P＜0.01).结论:多次小剂量pEgr-IFNγ-Endostatin基因-放射治疗的抑瘤效应优于单次大剂量基因-放射治疗.
关键词： Egr-1 干扰素Ⅱ型 内皮抑素 Lewis肺癌/治疗 X射线
