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rpoD和gyrA基因对气单胞菌鉴定的比较分析
目的 使用rpoD和gyrA基因对气单胞菌进行种水平的鉴定,比较两者分类结果的差异,同时对本研究中187株气单胞菌进行较为准确的种水平的分类.方法 对生化鉴定的187株气单胞菌进行rpoD和gyrA基因聚合酶链反应扩增并测序,将序列与种特异的参考序列一起构建系统发育树.结果 187株菌经rpoD基因鉴定为7个种,经gyrA基因鉴定为9个种,还有一个未定种.两者鉴定多的3个种一致,即维氏气单胞菌温和生物变种、豚鼠气单胞菌和水族馆气单胞菌.gyrA基因鉴定增加的2个种是异嗜糖气单胞菌和简氏气单胞菌.rpoD和gyrA基因对气单胞菌鉴定一致的有174株(93％),但有13株菌(7％)两者鉴定不一致.结论 rpoD和gyrA基因能够对大部分气单胞菌进行准确一致的分类,对于两者鉴定不一致的菌株,应增加管家基因进行分析.
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多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因突变与环丙沙星耐药关系研究
目的 研究多重耐药鲍曼不动杆菌(MDR-ABA)gyrA基因突变与环丙沙星耐药关系.方法 以鲍曼不动杆菌gyrA基因序列为靶序列,用PCR+DNA测序等方法对62株临床分离株gyrA基因突变进行对比研究.结果 在53株耐环丙沙星MDR-ABA菌中,有52株gyrA基因的83位表现出突变,其突变方式全为TCA-TTA,导致氨基酸丝氨酸→亮氨酸;8株环丙沙星敏感和1株环丙沙星中介的MDR-ABA菌gyrA基因无突变.结论 临床分离的MDR-ABA菌对环丙沙星耐药的分子机制主要表现为gyrA基因83位氨基酸密码子突变.
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淋病奈瑟菌对氟喹诺酮类药物的耐药性与gyrA和ParC基因突变关系的研究
目的 探讨江苏省淋球菌对氟喹诺酮的耐药状况、耐药基因突变型的分布情况及二者之间的关系.方法 采用琼脂稀释法检测淋球菌氟喹诺酮类药物(环丙沙星、左氧氟沙星)的小抑菌浓度(MIC),采用PCR法扩增含有喹诺酮耐药决定区的gyrA和parC基因片段,并进行测序分析.结果 根据所测MIC,本研究分离的95株淋球菌对环丙沙星100%的耐药;通过测序分析,在54株淋球菌中检测到gyrA和parC的18种突变形式,parC基因突变点越多,MIC相对也较高.结论 parC基因的突变导致淋球菌对喹诺酮类药物的高水平耐药.
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志贺菌喹诺酮类耐药株gyrA和parC基因突变研究
目的 检测志贺菌对喹诺酮类药的耐药情况,指导临床合理用药:探讨志贺菌喹诺酮类耐药株gyrA和parC基因的突变,分析GyrA和ParC氨基酸改变与喹诺酮类耐药的关系. 方法 2010～2012年从宿州市3家综合性医院收集志贺菌76株,进行分离培养和血清型鉴定;采用K-B纸片法进行药物敏感试验;采用PCR方法检测志贺菌喹诺酮耐药决定区(QRDR)相关gyrA和parC基因1,并挑选部分PCR产物进行DNA测序分析. 结果 收集的76株志贺菌中福氏志贺菌74株(占97.4％),宋内志贺菌2株(占2.6％);药敏结果显示志贺菌耐药情况严重,其中对阿莫西林耐药率高,达100％;对头孢噻肟耐药率低,为6.5％.对gyrA基因的序列分析发现3个导致氨基酸改变的基因点突变:Ser83→Leu,Asp87→Gly及His211→Tyr;对pa rC基因序列分析发现2个导致氨基酸改变的基因点突变:parC Ser80→Ile和Asp197→Asn. 结论 宿州市志贺菌感染仍以福氏志贺菌为优势菌群,且耐药严重,临床治疗志贺菌感染可优先选择头孢噻肟.志贺菌属对喹诺酮类药物产生耐药性与gyrA和parC基因突变有关,GyrA His211→ Tyr和ParCAsp197→Asn氨基酸变异与喹诺酮类耐药的关系需进一步研究.
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血液感染金黄色葡萄球菌gyrA基因突变与耐药性关系研究
目的 探讨血液感染患者感染的金黄色葡萄球菌gyrA基因突变情况与其耐药性之间的关系,为合理选用抗生素治疗血液感染提供参考.方法 分离血液感染患者组织中的金黄色葡萄球菌并进行药敏试验,对其gyrA基因进行扩增及测序;采用琼脂稀释法进行药敏试验,分析其突变位点及与其耐药性间的关系.结果 血液感染金黄色葡萄球菌分离株对环丙沙星、氧氟沙星、洛美沙星、诺氟沙星、司帕沙星及恩诺沙星均产生不同程度的耐药,MIC50小为28 μg/ml,MIC90小为112 μg/ml,其耐药率小为42.0％.PCR法扩增金黄色葡萄球菌的gyrA基因,大小为565 bp;基因测序显示gyrA基因的73位、82位由天冬氨酸(GAC)突变为甘氨酸(GGC),81位由丝氨酸(TCA)突变为甘氨酸(TTC),84位由丝氨酸(TCA)突变为丙氨酸(GCA)或亮氨酸(TTA),88位由谷氨酸(GAA)突变为赖氨酸(AAA),106位由甘氨酸(GGA)突变为天冬氨酸(GAA),112位由丝氨酸(TCA)突变为精氨酸(TCG),这些氨基酸突变情况与其耐药性关系密切.结论 血液感染患者感染的金黄色葡萄球菌gyrA基因发生突变,导致其编码的氨基酸发生变化,进而导致菌株产生耐药性,可为血液金黄色葡萄球菌感染的治疗提供参考.
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呼吸道感染患者肺炎克雷伯菌gyrA基因和parC基因突变情况及其耐药机制分析
目的 通过药敏试验探究肺炎克雷伯菌的耐药情况,分析其gyrA基因和parC基因突变与其耐药性的相关性,进而为呼吸道感染肺炎克雷伯菌的临床治疗提供指导. 方法 从呼吸道感染患者体内分离肺炎克雷伯菌并进行鉴定,然后测定其对各种抗生素的耐药情况,并通过基因测序研究gyrA基因和parC基因的突变情况与其耐药性关系.结果 药敏试验结果显示,肺炎克雷伯菌对诺氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、加雷沙星、加替沙星和莫西沙星的耐药率分别为45.65％、39.13％、30.43、27.17％、i3.30％、14.13％和10.87％.通过PCR方法成功地对gyrA和parC基因进行了扩增,并从电泳图得出gyrA基因分子量大小为449 bp、parC基因分子量大小为319 bp.通过基因测序比对发现,gyrA基因的83位、87位和parC基因的80位、91位都有不同类型的突变,这些突变与肺炎克雷伯菌的耐药性密切相关. 结论 gyrA基因和parC基因突变与肺炎克雷伯菌的耐药性密切相关,但是若要彻底解决其耐药性问题,应从源头卜控制抗生素的合理选用,从而更好地指导呼吸道感染的临床治疗.
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南阳地区手术感染大肠埃希菌gyrA基因突变的耐药研究及抗生素合理选用
目的 研究手术感染大肠埃希菌gyrA基因突变及耐药性,以指导临床治疗中抗生素的合理选用. 方法 分离提取40株大肠埃希菌gyrA基因,进行PCR扩增及基因测序,分析突变位点,并进行细菌药敏试验. 结果 药敏试验显示,40株手术感染大肠埃希菌分离株(诺氟沙星耐药)对萘啶酸、诺氟沙星、培氟沙星的耐药率均为100.0％,对氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、依诺沙星的耐药率分别为90.0％、75.0％、75.0％和70.0％,对加替沙星和莫西沙星耐药率为15.0％和10.0％.PCR扩增gyrA基因,大小为285 bp.对其进行测序分析,此基因的突变多数发生在密码子编码氨基酸的第83位和第87位,主要有:83位丝氨酸(Ser)突变为亮氨酸(Leu)或色氨酸(Trp)或丙氨酸(Ala)或缬氨酸(Val),87位天冬氨酸(Asp)突变为天冬酰胺(Asn)或甘氨酸(Gly)或酪氨酸(Tyr)或组氨酸(His)或缬氨酸(Val). 结论 47株手术感染大肠埃希菌分离株为诺氟沙星耐药株,该细菌对多数抗菌药物产生了耐药性,gyrA基因突变是导致手术感染大肠埃希菌对抗菌药物产生耐药性的主要原因之一.因此,在治疗手术感染大肠埃希菌时应根据药敏试验结果选用抗生素.
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感染性心内膜炎分离表皮葡萄球菌gyrA基因变异与喹诺酮类药物耐药关系研究
目的 研究表皮葡萄球菌耐药机制,以指导感染性心内膜炎的治疗. 方法 取感染性心内膜炎患者血标本,培养分离表皮葡萄球菌,采用药敏试验,检测表皮葡萄球菌的耐药性;提取表皮葡萄球菌DNA,采用PCR扩增gyrA基因并测序,分析gyrA基因变异与喹诺酮类药物耐药的关系. 结果 药敏试验显示诺氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、培氟沙星、依诺沙星、环丙沙星对表皮葡萄球菌的MIC值分别为256、128、128、64、32、32 μg/ml,耐药率分别为100.o％、80.0％、60.0％、60.0％、50.0％和30.0％;加替沙星对表皮葡萄球菌的MIC值为2μg/ml,即细菌对该药敏感.PCR扩增表皮葡萄球菌gyrA基因片段,大小为275 bp.对gyrA基因测序,耐药株的107位发生了C到G的突变,36位氨基酸由Pro突变为Ala;耐药菌株的251位碱基发生由C到T的突变,相应编码的氨基酸由Ser突变为苯丙氨酸Phe;耐药株的336位C碱基缺失,发生错位突变;此外还发生了一些无义突变,如190位的T突变为G,223位的T突变为C. 结论 表皮葡萄球菌gyrA基因变异导致其对喹诺酮类抗菌药物产生耐药性,临床治疗表皮葡萄球菌所致的感染性心内膜炎时优先考虑使用加替沙星.
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肠球菌的耐药基因研究
目的 了解肠球菌属的耐药性趋势和耐药基因分布,为临床合理用药提供依据.方法 采用VITEK2 COMPACT全自动微生物鉴定系统对2008年1月至2012年5月间临床送检标本中分离的319株肠球菌进行鉴定和药敏试验,采用PCR方法对ermB、mef、gyrA耐药基因进行研究.结果 319株肠球菌中以屎肠球菌多205株(64.26％),其次为粪肠球菌63株(19.75％),其他种类肠球菌51株(15.99％).肠球菌常用抗生素药敏结果显示屎肠球菌和粪肠球菌耐药率低的是万古霉素(1.0％,1.6％),其次是利萘唑胺和替考拉宁(3.9％,3.2％),耐药率高的是红霉素(94.6％,79.4％).肠球菌中ermB基因阳性率为73.4％(234/319),gyrA基因阳性率为67.1％(214/319),mef基因均为阴性.结论 肠球菌获得gyrA基因和ermB基因是肠球菌对氟喹诺酮类药物和红霉素类药物耐药的主要原因.
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鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药机制分析
目的 探讨鲍曼不动杆菌((Acinetobacter baumanii,Ab)对喹诺酮类药物的耐药机制.方法 收集2007年11月至2008年10月全国多省市21家医院院内下呼吸道感染住院患者痰标本2698份进行培养鉴定,对Ab分离株进行药敏检测,采用聚合酶链反应对Ab的不同耐药基因进行扩增,并进行序列分析.结果 2698份痰标本共计培养出39株Ab.对环丙沙星耐药率为61.54%,对左氧氟沙星耐药率为53.85%.39株Ab中有30株(76.92%)发生ParC 基因突变,19株( 48.72%)发生gyrA基因突变,15株同时发生ParC基因和gyrA基因突变.结论 Ab对喹诺酮类药物耐药机制主要与gyrA、parC基因突变有关.
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应用不同引物检测耐氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因点突变对结果判定的影响
目的：探讨以PCR-SSCP技术为基础，应用不同引物检测耐氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因点突变以及固定/终止液的组成对判定结果可能会产生的影响。方法采用2对引物，经PCR-SSCP检测，利用银染显色的方法显现耐氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因点突变的DNA单链位移。结果对比标准株H37Rv及H37Ra gyrA基因的单链带位置，在被测试的89株菌株中发生位置变化的；对氧氟沙星的耐药程度＞10μg/ml的分别有4株与14株，约占89株检测总数的4.49%和87.5%，对氧氟沙星的耐药程度介于≥2且≤10μg/ml之间的26株中，有与标准株gyrA基因的单链带位置发生改变的分别有20株与7株，约占89株检测总数的22.47%和7.87%；对氧氟沙星的耐药程度＜2μg/ml的47株中分别有2株与11株，约占89株检测总数的2.25%和12.36%。用含5.0%乙醇和4.5‰冰醋酸配比的固定/终止液可为利用银染法显现核酸凝胶分离DNA提供温和的反应环境，操作过程方便，观测效果较为理想。结论应用不同引物检测耐氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因点突变会对结果的判定产生影响，采用含5.0%乙醇、4.5‰冰醋酸的固定/终止液可为应用非变性聚丙烯酰胺凝胶分离核酸检测的银染着色法提供温和的反应环境，并产生清晰可辨的被检测标本的DNA单链条带。
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大肠埃希菌耐环丙沙星gyrA基因突变的研究
目的了解临床分离大肠埃希菌耐环丙沙星gyrA基因突变情况.方法用环丙沙星浓度梯度法试条检测临床分离大肠埃希菌低抑菌浓度(MIC),聚合酶链反应(PCR)扩增gyrA基因喹诺酮耐药决定区,扩增产物片段长度为668 bp,用限制性内切酶HinfⅠ消化PCR产物,行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳.结果共检测大肠埃希菌41株,14株MIC在0.25～0.5 μg/ml的菌株,未检出耐药性突变位点;4株MIC在1～2 μg/ml的菌株(2株MIC为1μg/ml、1株为1.5 μg/ml,1株为2 μg/ml)均出现gyrA基因突变;耐药菌23株(1株MIC为16 μg/ml,其余≥32 μg/ml)也均发生gyrA基因突变.结论临床分离大肠埃希菌对环丙沙星耐药性与HinfⅠ酶切位点突变密切相关,低水平耐药菌株gyrA基因发生突变具有一定临床意义.
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矽肺结核病耐喹诺酮(gyrA)基因情况分析
目的研究矽肺结核耐喹诺酮药敏试验与gyrA基因突变的关系.方法通过药敏试验和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术鉴定31株分枝杆菌临床分离株的菌种,分析gyrA基因突变的情况.结果30株临床分离株的16S rDNA SSCP电泳图谱均与结核分枝杆菌标准株相同.16株耐喹诺酮类药临床分离株中,11株异常,占68.75%.结论gyrA基因突变与结核分枝杆菌对喹诺酮类药物耐药有关,且gyrA基因突变在药敏实验高、低浓度区均可发生.
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葡萄球菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制研究
目的了解临床分离凝固酶阳性和阴性葡萄球菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制. 方法应用PCR-RFLP、PCR-SSCP技术及利血平逆转实验,检测gyrA基因的突变及norA基因的表达.结果 40株凝固酶阳性(70.2%)和28株凝固酶阴性葡萄球菌(77.8%)检出gyrA基因84位点突变;4株未检测出84位点突变的菌株SSCP带型与标准菌株SA42和SA42R均不同;利血平逆转实验发现88%的凝固酶阳性和72%凝固酶阴性葡萄球菌存在norA耐药表型;36株凝固酶阳性和20株凝固酶阴性葡萄球菌涉及两种耐药机制.结论 gyrA基因84位点突变可能是喹诺酮类药物靶位耐药的重要途径之一,其他位点突变也可能存在;多数临床耐药分离株靶位改变和膜耐药双重耐药机制共存.
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3′BS-PCR方法探测氟喹诺酮耐药大肠埃希菌 gyrA基因2 4 8位点突变的探讨
目的对3′BS PCR法用于快速、准确鉴定耐药细菌染色体基因点突变进行探讨.方法 3′BS-PCR方法检测喹诺酮耐药大肠埃希菌gyrA基因常见突变点(C 248)是否突变;gyrA基因喹诺酮耐药决定区PCR产物序列分析进行验证;研究菌株包括大肠埃希菌野生株Ecs及其实验室诱变耐药株R2、R256和临床分离耐药株R5、R6.结果 R5、R6和R256均存在gyrA基因第248位C→T的突变;对R2、R5和R6的序列分析显示R5和R6还发生了259位G→A(R5)/T(R256)突变.结论 3′BS-PCR方法具有确定突变碱基特异性高,可靠且简便快速的优点,适合用于细菌染色体基因耐药突变的快速探测.
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多药耐药肺炎克雷伯菌尿液分离株检出gyrA基因新亚型
目的 了解1株多药耐药肺炎克雷伯菌的遗传学背景.方法 采用聚合酶链反应(PCR)的方法分析1株多药耐药肺炎克雷伯菌可能存在的65种耐药相关基因:包括β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类耐药相关基因及可移动的遗传元件(整合子、转座子、接合性质粒)遗传标记、抗菌制剂外排泵基因.结果 该株多药耐药肺炎克雷伯菌耐β-内酰胺类药物基因检出blaTEM,耐氨基糖苷类药物基因检出aph(3’)-Ⅰ,耐喹诺酮类药物基因检出gyrA,Ⅰ类整合子遗传标记检出intⅠ 1,转座子遗传标记检出tnp513,接合性质粒遗传标记检出trbC;抗菌制剂外排泵基因检出qacE△1-sul1,gyrA基因是新亚型(GenBank登录号:JN232083),83位密码子突变方式为TCG→TTC,导致氨基酸从丝氨酸(S)→苯丙氨酸(F)；87位密码子突变方式为GAC→GCC,导致氨基酸从天冬氨酸(D)→丙氨酸(A).结论 携带多药耐药基因和抗菌制剂外排泵基因是这株肺炎克雷伯菌呈多药耐药的主要原因,携带多种可移动遗传元件使细菌的耐药性在同种细菌菌株之间,甚至不同种细菌菌株之间得以快速传播.
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gyrA、parC及mdfA基因测序鉴定肺炎克雷伯菌
目的 探讨gyrA、parC和mdfA基因测序鉴定临床分离的泛耐药肺炎克雷伯菌的必要性.方法 采用gyrA、parC和mdfA基因测序方法对经法国生物梅里埃公司API 20 E系统(API LAB plus)和MicroScan WalkAway 96 Plus全自动细菌鉴定系统鉴定为克雷伯菌属或产气肠杆菌的19株临床分离株进行分子鉴定.结果 19株菌gyrA、parC、mdfA基因PCR扩增均阳性,基因序列经GenBank中的BLASTn程序进行同源性比较分析,表明与2株完成全基因组测序的肺炎克雷伯菌肺炎亚种NTUH-K2044(Accession:AP006725.1)和MGH 78578(Accession:CP000647.1)为接近,均为99.0％同源,证实19株均为肺炎克雷伯菌.结论 采用gyrA、parC和mdfA基因测序鉴定肺炎克雷伯菌结果准确.
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耐环丙沙星鲍氏不动杆菌的gyrA基因及parC基因突变分析
目的研究本地区临床分离鲍氏不动杆菌环丙沙星耐药表型与DNA旋转酶A亚单位gyrA基因及拓扑异构酶ⅣparC基因突变的关系.方法收集28株耐药株及2株敏感株,通过PCR扩增其gyrA基因及parC基因,并对扩增产物进行限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)及DNA序列分析.结果敏感株的gyrA基因产物经Hinf Ⅰ酶切后可产生两个片段,耐药株则产生1个片段;而parC基因产物经Hinf Ⅰ酶切后,敏感株及耐药株均产生两个片段;DNA测序显示,5株耐药株gyrA基因存在Ser83→Leu及Ala88→Thr突变,其中Ser83→Leu的突变是导致HinfI酶切位点消失的原因,而1株敏感株无突变;1株敏感株与1株耐药株的pcrC基因存在Ser108→Ile突变,另外14株耐药株存在多位点同义突变.结论与parC基因相比,gyrA基因突变是鲍氏不动杆菌对环丙沙星耐药的主要分子基础,环丙沙星的高水平耐药可能需要多种不同的突变.
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耐萘啶酸甲型副伤寒沙门菌gyrA基因突变研究
目的 研究绍兴地区耐萘啶酸甲型副伤寒沙门菌(SPA)gyrA基因突变情况.方法 对52株SPA进行基因扩增,PCR产物纯化后进行双向测序,用OMIGA2.0软件对DNA促旋酶A亚单位序列进行分析比对,确定gyrA基因突变.结果 耐萘啶酸SPA在gyrA喹诺酮类耐药决定区(QRDR)氨基酸残基83或87位点发生点突变;其中51株在83位发生突变,1株在87位点发生突变;未发现两个位点同时突变菌株;gyrA QRDR其他部位未发现突变.结论 gyrA基因83位突变与SPA耐萘啶酸有直接关系,gyrA基因87位单突变也可导致对萘啶酸耐药;绍兴地区近两年耐萘啶酸SPA主要为83位的TCC→TTC(Ser→Phe)突变.
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201株肺炎克雷伯菌耐药性分析及其gyrA基因分析
目的 了解肺炎克雷伯菌的耐药性及耐药基因gyrA的分布,给临床用药提供依据.方法 收集2003-2009年临床分离的肺炎克雷伯菌201株,采用琼脂稀释法进行药敏检测；利用引物特异性PCR结合测序识别gyrA基因耐药基因.结果 201株肺炎克雷伯菌对甲氧苄啶和氨苄西林有很高的耐药性,但是对亚胺培南和阿米卡星较为敏感；同时,检测到60株占29.9％存在gyrA基因突变.结论 随着抗菌药物的大量使用,肺炎克雷伯菌耐药性较严重,易导致肺炎克雷伯菌产生多药耐药性,给临床抗感染治疗带来了严峻的挑战.
