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催化甾体羟基化的P450氧化酶BM3的蛋白质工程的研究进展
甾体关键位点的羟基化在药用甾体的合成中发挥重要作用。为探究细胞色素 P450(CYP450)氧化酶 BM3在甾体羟基化合成中的潜在应用,基于细胞色素 P450 BM3的蛋白质工程逐渐发展起来。在取得的若干 P450 BM3突变酶的基础上,通过新一代测序技术和生物信息学分析等方法,筛选出催化甾体羟基化的相关 CYP450。根据易错 PCR等定向进化技术获得了突变位点信息,进一步采用(饱和)定点突变等进化技术对活性氨基酸位点进行分析,再经过筛选获得既高于亲本酶也高于易错 PCR技术得到的突变酶活力的新突变酶,并对突变体进行功能验证,进一步阐明甾体羟基化的可行性和重要性。此外,P450 BM3催化底物和生成产物的选择性可以通过迭代的组合活性位点突变而改变。本文旨在探究近年来科研人员在 P450氧化酶 BM3蛋白质工程催化甾体羟基化的改良领域中所做的尝试、获得的成果以及存在的问题,为 P450 BM3羟基化疏水性甾体的深入研究提供理论依据。
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氨基糖苷类抗生素导致mtDNA A1555G和mtDNA A7445G突变的相关遗传药理分析
Mitochondrial DNA A1555G (mtDNA 1555)和mitochondria DNA A7445G (mtDNA 7445)位点突变是氨基糖苷类抗生素(aminoglycoside antibiotics,AmAn)诱导的耳聋(aminoglycoside antibiotics induced deafness,AAID)的主要遗传基础[1-2],mtDNA 7445位点的突变与糖尿病合并耳聋有关[3].
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关于乙型肝炎病毒预存耐药变异的认识
核苷(酸)类似物长期抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)治疗面临的重要问题之一是HBV的耐药性问题[1].目前口服的核苷(酸)类似物,包括拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定,治疗过程中均可出现耐药性.特别是近年来发现慢性乙型肝炎患者在核苷(酸)类似物治疗前即存在耐药位点突变,即预存耐药变异(pre-existing antiviral resistance mutation),引起了临床医师的高度关注.一、HBV预存耐药变异的基础.
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用萘啶酸预测大肠埃希菌gyrA基因突变的探讨
近年来,大肠埃希菌对环丙沙星的耐药率上升明显,其对喹诺酮类药物耐药性的产生主要与染色体gyrA基因突变有关[1],而它的突变过程是渐进的,即首先发生单基因位点突变,此时菌株对环丙沙星仅表现为敏感性下降.如在药物继续作用下,则极易发生双基因或多基因位点突变[2],表现为高度耐药.如能检出单基因位点突变菌株对防止大肠埃希菌演变成耐药菌有重要临床意义.目前检测gyrA基因突变均采用分子生物学方法,如聚合酶链反应(PCR)、基因测序等,无法作为常规方法.为此,我们用萘啶酸预测gyrA基因突变进行了探讨,现报告如下.一、材料与方法1.菌株:从病房和门诊病人送检标本分离63株临床菌株,其中对萘啶酸、环丙沙星均敏感24株;萘啶酸耐药、环丙沙星敏感或低水平耐药17株;萘啶酸、环丙沙星均耐药22株.1株标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922,萘啶酸、环丙沙星均敏感.2.药敏采用纸片扩散(K-B)法:药敏纸片、M-H培养基均为OXOID产品.药敏结果按美国临床实验室标准化委员会1999年标准判断.3.基因检测:PCR扩增,喹诺酮类耐药决定区(QRDR)引物按文献[3],引物1为5′-GAGGAAGAGCTGAAGAGCTCCT-3′,引物2为5′-CCGGTACGGTAAGCTTCTTCAA-3′,由中国军事医学科学院合成;Hinf
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结核分枝杆菌耐药机制及耐药性检测的研究进展
自20世纪80年代以来,结核病疫情重新上升,成为严重危害公共卫生的问题之一。据世界卫生组织估计,目前全球约有20亿人感染结核分枝杆菌(结核菌),其中约有5 000万人感染耐药结核菌[1]。因此对结核菌耐药机制和耐药性检测的研究意义重大。结核菌的耐药性的产生主要是由于不合理用药引起的结核菌内抗结核药物作用靶基因突变所致[2]。目前检测结核菌耐药性的方法有表型检测和基因型检测两大类。 一、结核菌的耐药机制 染色体基因变异是结核菌产生耐药性的主要机制。结核菌95%以上的基因变异是直接由于抗结核药物引起[2]。细菌可以通过染色体自身突变或者外源遗传因子如质粒或转座子而获得耐药性,但迄今为止结核菌中尚未发现质粒和转座子介导的耐药[2]。Musser等经大量研究发现大约12种基因突变和结核菌的耐药性有关。已确定主要为基因突变引起耐药性的抗结核药有利福平(RFP)、异烟肼(INH)、链霉素(SM)、吡秦酰胺(PZA)、乙胺丁醇(EMB)、喹诺酮类等。 1.RFP通过和结核菌中DNA依赖的RNA聚合酶的结合来抑制转录过程,导致细胞死亡[3]。96%RFP耐药菌株的产生是因为编码该酶β亚基的rpoB基因发生改变所致。这些改变主要是集中在rpoB中的81个碱基区域(利福平耐药决定区)内的各种突变,也有少量碱基插入或缺失,共35种,其中43%为531-Ser错义突变,此位点突变常见;36%为526-His错义突变。rpoB基因中513、526、531位点突变导致RFP高度耐药(MIC>32 μg/ml),尤以513位点突变产生的耐药性高;514、521、533位点突变导致RFP低度耐药(MIC<12.5 μg/ml)[4]。已知rpoB基因的9种突变同时和结核菌对利福布丁(refabutine)、利福喷丁(refapentine)等的耐药有关[3]。 2.INH被结核菌内过氧化氢-过氧化物酶(由katG基因编码)激活,作用于enoyl-ACP还原酶(由inhA基因编码),抑制杆菌酸和细胞壁合成。结核菌耐INH的机制比较复杂,katG基因的突变、部分缺失是主要机制,该基因的完全缺失在INH耐药株中只占很小一部分但导致高度耐药[5]。多数文献都对KatG基因中315位AGC突变成ACC及463位CGG突变成CTG作了报道,认为这两个突变和耐药性关系密切[6]。但近年来有些学者认为R463/L突变无意义[7]。inhA、katA、ahpC等基因和结核菌对INH的耐药关系正在研究之中,近又提出kasA可能是一个耐药相关基因[8]。InhA 突变也对乙硫异烟胺1314th(ETH 1314th)耐药[3]。
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e抗原阴性乙型肝炎患者病毒前C区1 896点突变的检测
通过本文,我们主要分析报道乙型肝炎病毒(HBV)前C区中重要、常见的1 896位点突变在乙肝病毒e抗原(HBeAg)阴性的乙肝患者中的检测结果.
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关于《如何正确认识HBeAg和抗-HBe同时阳性》的答复
编辑同志:张晓宁读者就2008年第1期专家答疑栏目"为何在临床工作中会遇到同一份标本的对应抗原、抗体同时阳性,如何解释?"一文中关于HBeAg和抗-HBe同时阳性的解释提出了自己的不同看法.现就来信中所提出的观点进行探讨.关于读者提到的第一点,即高剂量HBeAg因钩状效应有可能导致抗-HBe假阳性的解释是合理的,但是关于宿主免疫反应激活过程以及突变或抗病毒治疗造成HBeAg和抗-HBe同时阳性的解释十分牵强.宿主免疫反应激活过程机制与测定HBeAg和抗-HBe结果同时阳性没有关联性,而G1896A或A1762T/G1764A的位点突变主要是造成HBeAg的低表达或不表达,也不是引起HBeAg和抗-HBe结果同时阳性的主要原因.
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河南抗-HBe阳性慢性乙型肝炎患者病毒前C区1896位点的突变及临床意义
目的:了解抗-HBe阳性慢性乙型肝炎患者HBV前C区1896位点的突变状况.方法:应用3'碱基特异聚合酶链反应(3'BS-PCR)结合PCR产物直接测序法检测前C区热点突变.结果:72例抗-HBe阳性慢性乙型肝炎患者HBV前C区1896位点突变检出率为34.7%;慢性肝炎重度患者19例检出8例单纯突变株感染,其检出率显著高于慢性肝炎轻度组(P<0.05);慢性肝炎重度组总突变率(47.4%)亦显著高于慢性肝炎轻度组(17.4%)(P<0.05);16例患者经测序发现有1例存在前C 1899位点G→A点突变.结论:河南地区抗-HBe阳性慢性乙型肝炎患者存在一定比例的病毒变异株;HBV前C区1896位点的变异与慢性肝炎进展程度相关.
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凝血因子V基因突变与肺栓塞
肺栓塞的栓子主要来自下肢深部静脉或盆腔静脉。西方国家报道,静脉血栓栓塞性疾病的年发病率约1‰[1],肺栓塞发病率约40.9%。近年来,众多学者在静脉血栓形成机制,特别是在分子水平进行了研究,提出静脉血栓栓塞性疾病是由于遗传和/或环境异常造成的一种多基因、多因素疾病。其中,凝血因子V(Factor V,FV)基因突变是静脉血栓性疾病的重要危险因素并已成为血栓性疾病研究中的一个热点。 一、凝血因子V突变的概念 1993年瑞典科学家Dahlback[2]在对1例19岁的家族性静脉血栓患者的研究中发现,血浆中存在一种对活化蛋白C(Activated Protein C,APC)抗凝活性抵抗现象;经对患者家族成员进行研究,在部分成员得到了同样的结果;初步认为这种现象与遗传有关。1994年荷兰Leiden的科学家Bertina和Dahlback的实验室对活化蛋白C抗凝活性有抵抗现象(Activated Protein C Resistence,APC-R)患者的凝血因子V基因进行了分析,发现凝血因子V基因单个位点突变是APC-R的主要原因[3]。随后,亦有大量的研究证实了这一观点[4~6]。
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结核分枝杆菌embB基因306位点突变与耐药的相关性研究
embB基因突变,特别是其306位点(embB306)的点突变一直被认为是结核分枝杆菌耐乙胺丁醇的重要原因.但是,Hazbon等对来自世界各地的1020株菌株进行分析后认为,embB306突变不直接引起结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药性,而是容易产生对任何药物的耐药性.Plinke等报道,embB306位点突变只发生在乙胺丁醇耐药菌株中,从而说明该位点突变与乙胺丁醇耐药有关.可见embB306位点突变与乙胺丁醇耐药的关系还存在着较大的分歧.
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R371H和P266T位点突变对ATP敏感性钾通道特性的影响
目的 研究R371H和P266T两个位点突变对ATP敏感性钾通道特性的影响,揭示上述位点突变导致心律失常的机制.方法 用人胚肾细胞表达Kir6.2野生型、R371H和P266T位点突变后的通道,用膜片钳技术研究突变后胞内pH对ATP敏感性变构调节的变化.结果 野生型、P266T、R371H均成功记录到内向整流性K+电流.暴露于不同的pH中时,野生型通道的半数电流抑制ATP浓度(IC50)在pH 6.8时较pH 7.4时显著增大(70 vs 22 μmol/L,P<0.05),ATP浓度-电流曲线显著右移;R371H和P266T的IC50在pH 6.8与pH 7.4时差异无统计学意义.结论 胞内pH对ATP敏感性变构调节的丧失,可能是R371H和P266T位点突变时导致心律失常的重要机制.
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CUL7位点突变是造成雅库特人种身材矮小症的原因
据日本学者MaksimovaN等2007年12月发表于<医学遗传学杂志>的研究表明,雅库特人的身材矮小症是由于CUL7位点的突变引起的.该项研究共有来自37个雅库特人家庭的43名身材矮小症患者参与,他们均患有常染色体隐性遗传非进展性生长不足和面部畸形,但智力正常.
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高分辨率熔解曲线分析技术在快速产前诊断β地中海贫血中的应用
β地中海贫血(β地贫)是世界范围内常见的单基因疾病之一[1],是由β珠蛋白(hemoglobin beta,HBB)基因突变导致HBB合成障碍而引起的一种溶血性贫血,呈常染色体隐性遗传.我国长江以南地区为β地贫高发区,其中广西、广东和海南的发病率高,至今已发现有200多种β地贫基因突变[2],其中CDs41-42 -TCTT、IVS2-654C>T、-28A>G、CD17A>T及CDs71-72+A位点突变占所有突变类型的90%以上[3-4].重型β地贫患儿出生后需要定期输血治疗,除非实施造血干细胞移植成功,大部分患儿将于青少年期夭折.由于目前对该病尚无理想的根治方法,因此,通过产前诊断阻止重型β地贫患儿出生是首选的预防措施.目前,国内外检测β地贫基因突变的方法主要有等位基因特异性PCR( ARMS)、反向点杂交(RDB)、变性高效液相色谱( DHPLC)等[5-8].高分辨率熔解(high resolution melting,HRM)曲线分析技术是一种高效稳定的PCR技术,不受突变碱基位点与类型的局限,无需序列特异性探针,存PCR反应结束后直接进行HRM即可完成对样品的突变筛查和基因型分析.本研究探讨HRM分析技术在快速产前诊断β地贫中的应用价值.
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人钠/碘转运体354位点基因突变与先天性甲状腺功能减退症的相关性研究
我们于2001年12月~2003年1月,采用聚合酶联反应-限制性酶切技术,对青岛地区先天性甲状腺功能减退症(CH)患者中是否存在人钠/碘转运体(hNIS) 基因354位点突变及其基因型频率进行研究.
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亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与脑梗死的相关研究
高同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)血症为脑血管病独立危险因素,亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是Hcy代谢关键酶,MTHFR基因C677T位点突变使酶活性下降.我们探讨了我国汉族人群MTHFR基因C677T位点多态性与脑梗死的相关性.
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垂体性侏儒症的基因治疗
垂体性侏儒症又称生长激素(GH)缺乏症(GHD),是由于生长激素减少或缺乏所引起的生长发育障碍。其发病率在1/4000~1/10000之间。既往认为其中的5%~30%是由遗传因素所致,但近年发现:GH分泌不足大多数为染色体隐性遗传,使人们将大量有遗传学病因的GHD归属于所谓特发性的;而且因对研究对象的标准设立较为严格,导致对轻度GHD重视不足等原因,目前认为实际的比例数要大得多。随着分子生物学的迅速发展,以分子遗传学为基础,运用重组DNA技术进行的GHD基因治疗的文章多见报道。本文将对GHD基因治疗的进展做一综述。 一、GHD基因治疗的分子遗传学基础 现在的研究表明GHD的分子遗传学主要与GH基因缺陷有关。表现为家族性单一GH缺乏的GHD(IGHD),特别应该提到的是对外源性基因重组人生长激素(rhGH)治疗常常有抗体产生,临床疗效欠佳的IGHD IA型;同时,GH基因调控异常也可引起GHD与POUIFI(Pit-1)或PROPI位点突变有关,表现为伴有其它垂体激素缺乏的复合性垂体激素缺乏症(CPHD)。尤其是转录因子Pit-1,它对胚胎期发育及GH,催乳素(PRL),促甲状腺素(TSH)的基因表达起重要作用;另外,生长激素释放激素(GHRHR)基因变异因垂体对GHRHR刺激无反应,也可导致GHD。
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144 Bardet-Biedl综合征
Bardet-Biedl综合征(Bardet-Biedl syndrome,BBS)系常染色体隐性遗传性疾病,主要临床表现有视网膜营养不良,先天性肥胖,多指趾畸形,生殖腺发育不全,智力发育迟缓,肾畸形等。约35%的患者伴有耳聋(主要为传导性耳聋)。分子遗传学研究显示本病具有遗传异质性,目前发现至少有4个致病基因位点,即BBS1、BBS2、BBS3、BBS4,不同基因位点突变临床表现基本无差别,致病机理不清。
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线粒体DNA1555位点突变、非综合征性聋与氨基糖甙类抗生素关系研究
氨基糖甙类抗生素致聋是导致儿童重度感音神经性聋的主要原因,而且具有家族聚集性与易感性.目前认为线粒体DNA1555位点突变是导致氨基糖甙类所致非综合征聋的主要遗传基础.本文试图从线粒体基因1555位点突变结构特点、发病机理、突变的外显率、临床意义等方向作一综述.
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Charcot-Marie-Tooth病伴线粒体DNA14484位点突变一家系
Charcot-Marie-Tooth病又称腓肠肌萎缩症.我们曾于1989年报告Charcot-Marie-Tooth病一家系[1],2010年又对该家系7例成员进行血液mtDNA分子遗传学检测,显示先证者14484位点突变.先证者男性,55岁.因双眼视物逐渐减退,于1986年10月20日到福州东南眼科医院初诊.眼部检查:采用国际标准视力表检查视力,右眼1.2,左眼0.05.双外眼和眼底检查均未见异常.中心视野检查:右眼未见异常,左眼有哑铃状暗点.初诊:左眼急性球后视神经炎.1年后患者右眼视力降至0.1,左眼视力无变化.右眼出现旁中心比较性暗点(约10°),眼底检查无异常.双眼多焦视诱发电位检测,显示P100潜时延长;家族中有类似下肢肌无力和视神经萎缩者(图1).2009年10月先证者复诊,双眼视力0.06;双眼瞳孔中等度散大,对光反应迟钝;双眼球运动良好,无眼球震颤;双眼视乳头萎缩且呈苍白色,散瞳后未见视网膜周边部变性和萎缩.追问病史,得知先证者在15岁时即患双下肢肌肉萎缩,明显跛行.行双下肢腓肠肌活检并电镜检查,未见线粒体异常改变.肌电图检查,显示双下肢腓神经纤维速度异常,提示周围神经源性疾患.
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吉非替尼治疗非小细胞肺癌致间质性肺炎1例
吉非替尼(Gefitinib,易瑞沙)是AstraZenica公司开发的分子靶向治疗药物,其目前获准的适应证为治疗既往接受过化疗或不适于化疗的局部晚期或转移性的NSCLC 以及一线治疗存在EGFR 基因特定位点突变的晚期NSCLC[1].间质性肺疾病是吉非替尼引起的少见、但可致命的严重不良反应.现报道1 例晚期肺癌患者口服吉非替尼治疗致间质性肺炎的情况.