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催化甾体羟基化的P450氧化酶BM3的蛋白质工程的研究进展
甾体关键位点的羟基化在药用甾体的合成中发挥重要作用。为探究细胞色素 P450（CYP450）氧化酶 BM3在甾体羟基化合成中的潜在应用，基于细胞色素 P450 BM3的蛋白质工程逐渐发展起来。在取得的若干 P450 BM3突变酶的基础上，通过新一代测序技术和生物信息学分析等方法，筛选出催化甾体羟基化的相关 CYP450。根据易错 PCR等定向进化技术获得了突变位点信息，进一步采用（饱和）定点突变等进化技术对活性氨基酸位点进行分析，再经过筛选获得既高于亲本酶也高于易错 PCR技术得到的突变酶活力的新突变酶，并对突变体进行功能验证，进一步阐明甾体羟基化的可行性和重要性。此外，P450 BM3催化底物和生成产物的选择性可以通过迭代的组合活性位点突变而改变。本文旨在探究近年来科研人员在 P450氧化酶 BM3蛋白质工程催化甾体羟基化的改良领域中所做的尝试、获得的成果以及存在的问题，为 P450 BM3羟基化疏水性甾体的深入研究提供理论依据。
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DNA改组--定向进化的技术革命
DNA改组(DNA shuffling)是90年代中期发展起来的一种新技术.该文概述了有关DNA改组的基本原理和方法,并跟踪了当今该领域的新研究成果和发展动态.
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人杀菌/渗透增强蛋白N端功能片段基因突变文库的构建和鉴定
目的 为提高杀菌/渗透性增强蛋白N端功能片段BPI23对内毒素(lipopolysaccharides,LPS)的亲和性,通过易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA改组技术,对其编码序列BPI600进行突变,在大肠杆菌XL10-Gold中构建BPI600基因突变体库.方法 通过控制Mg2+和Mn2+的浓度进行易错PCR,获得BPI600随机突变基因片段,经测序和基因比对,确定BPI600的随机突变率.再对易错PCR产物进行DNA改组,将改组产物克隆至pYD1载体中,转化大肠杆菌XL10-Gold,从Amp抗性(LuriaBertani,LB)固体培养平板上任选10个单菌落,增菌后提取质粒,得到pYD1-shuffled BPI600重组质粒,将质粒进行Hind Ⅲ/ XhoⅠ酶切鉴定,取5个阳性质粒进行DNA测序,通过基因和氨基酸比对鉴定突变情况.结果 测序和基因比对显示,BPI600经易错PCR所获突变文库的随机突变率达2.3％;改组后重组质粒的酶切结果表明,在随机选择的10个菌落所提质粒中,有6个含BPI600,表明构建了重组质粒pYD1-shuffled BPI600;在5个阳性质粒中,有4个重组质粒的BPI23编码序列分别发生了6、9、11和14个碱基突变;1个不仅有10个碱基突变,还存在1个碱基的缺失.氨基酸比对表明,有2个质粒(分别有6和14个碱基突变)具有正确的读码框,能够翻译完整的蛋白质,各有4或14个氨基酸突变.3个质粒因含终止密码子而不能表达完整目的蛋白.结论成功构建pYD1-shuffled BPI600重组质粒,获得库容量为2×105的突变文库,为高内毒素亲和力突变体的筛选奠定了基础.
关键词： 人杀菌/渗透增强蛋白 定向进化 易错PCR DNA改组 -
DNA改组技术及其在蛋白类药物定向进化中的应用
自DNA重组(DNA shuffling)技术诞生以来,作为现代生物技术核心的基因工程技术得到了飞速的发展,特别是改组技术在基因重组,分子、蛋白蛋进化等领域得到了快速的发展,开创了定向分子进化的新纪元.
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利用定向进化技术提高米黑霉脂肪酶活性及基因突变位点分析
目的:获得催化油脂活性明显提高的米黑霉脂肪酶(Rhizomucor miehei Lipase,RML)突变体.方法:选取大肠杆菌表达体系,利用定向进化技术,进行四轮易错PCR. 结果:得到5个活性明显提高的酶突变体,其中突变体M5催化油脂活性可达(3 241±100)U/mg,而野生型脂肪酶活性为(253±30)U/mg,活性提高12倍. 结论:结合RML成熟蛋白结构,对M5基因成熟区的5个突变位点Ser168、Ser173、phe240、Thr311、Asp313进行分析, 发现Ser168、Ser173位于蛋白结构中覆盖活性中心的"盖子"结构附近,而phe240、Thr311、Asp313则分布在目标蛋白活性中心上下游的位置. 据此,研究为RML基因的进一步改造提供重要的突变位点.
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重组P450BM3:生物催化的多面手
目的 介绍近年来重组P450BM3在生物催化领域的研究进展,为定向进化P450BM3获得催化其它底物的突变体提供参考.方法 通过系统的文献调研,以近年来60余篇外文相关文献为依据进行归纳总结.结果 介绍了P450BM3结构与功能关系,并对已报道的P450BM3及其突变体催化的反应进行分类与总结.结论 为拓展P450BM3催化的底物谱奠定基础.
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酶立体选择性的定向进化策略
酶立体选择性定向进化的基本方法是用合适的分子生物学手段使酶基因发生随机突变,然后进行基因表达和高通量筛选.本文主要对引入突变技术和高通量筛选方法做一简要综述.
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酶定向进化的研究策略
定点突变是酶工程中研究酶的结构与功能的常规手段,并广泛用于改变酶的性能.酶的体外定向进化是改造生物催化剂的一种有效的新策略,主要是模拟自然进化进程,通过容错PCR等技术对编码酶的基因进行随机突变,再由DNA改组、交错延伸过程、随机引导重组、递增截短技术等进行突变基因的体外重组,终经筛选获得所需的酶.本文综述了酶定向进化的研究与应用.
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新型α-淀粉酶的研究进展
α-淀粉酶在食品、发酵、药品、纺织等行业有着广泛的用途.它能水解淀粉内部α-1,4糖苷键形成小分子产物,例如葡萄糖、麦芽糖、低聚糖等.然而α-淀粉酶有一定的局限性,例如在较低pH不能发挥高酶活.从极端微生物中寻找耐酸性和耐高温的α-淀粉酶以及对现有酶的改造成为近年来研究的热点.耐酸性和耐高温α-淀粉酶可以从真菌,细菌,古生菌获得.该文着重阐述通过分子生物学,定向进化技术及结构构造学去改善α-淀粉酶的性质,获得了很好的效果,并且满足了各种工业应用的需求.
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DNA家族改组技术的进展及应用
DNA家族改组(DNA family shuffling)是一项高效的体外进化技术,该技术利用自然界中具有同源序列的基因家族--如来自不同种属的相同基因以及同一种属的相关基因等进行改组,为蛋白质定向进化和结构--功能关系分析等研究提供了有效获得突变文库的方法.近年来,DNA家族改组技术不断取得新的发展,应用领域日益扩展,在生物合成途径的改造、植物抗病能力的加强、环境污染的治理、医药工业的发展、异源表达体系的建立等方面都发挥了重要作用.文章综述了这项技术在近年来的新发展和新应用,并展望了DNA家族改组技术的发展前景.
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合理的分子设计与工程化蛋白质药物
治疗性蛋白的分子设计与工程化已取得突破进展,基因工程药物已进入了第三代蛋白质治疗药物发展新阶段.文章重点介绍了蛋白质工程技术在优化蛋白质的疗效、稳定性、靶向性、特异性以及改善免疫原性和药代动力学等方面的分子设计策略,并结合本实验室的研究工作介绍了新近研究成功的蛋白质工程药物类型.对近年来在蛋白质工程药物研究中,常采用的的一些新技术,新方法,如点突变技术、融合蛋白技术、DNA改组技术、分子定向进化技术和蛋白质分子展示技术也作了简要讨论,同时还展望了合理的分子设计与蛋白质工程药物的发展前景.
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蛋白质工程技术与新型生物催化剂设计
生物催化剂的分子设计研究是发展新型生物催化剂的重要手段.蛋白质工程技术的应用为其发展提供了有效的技术平台.定点突变技术、DNA改组与体外定向进化技术等已在创造新型生物催化剂、改造天然生物催化剂的结构与功能方面呈现出良好发展前景.本文对有关技术的原理与应用及其已取得的主要研究成果做了简要介绍与讨论.
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蛋白定向进化及应用进展
目的 作为对自然进化的体外模拟,定向进化是改进蛋白功能与活性的有效手段.定向进化的成功与否取决于突变体库的多样性以及筛选方法的效率.目前已发展出多种创造和筛选突变体的策略及手段,并将定向进化的对象从蛋白延伸到有机体,使定向进化在许多领域得到了广泛的应用.
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蛋白质的定向进化及应用
酶的定向进化是蛋白质工程的新策略,它模拟自然的进化机制,用突变和定向筛选的方法在体外人为改造酶.此文综述了定向进化的原理和基本方法,并阐述了研究意义和在医药领域的新研究成果.
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蛋白质(或酶)的体外定向技术在药物和疫苗中的应用
蛋白质(或酶)的体外定向进化是蛋白质工程的新策略,它通过模拟自然进化机制,在体外人为地对蛋白质或酶基因进行随机诱变,再结合特定的筛选方法定向选择所需性质的突变体,短期内在试管中完成在自然界需要几百万年的进化过程.由于该技术具有进化速度快、效率高、操作简便等特点,在蛋白质类药物、疫苗研制中具有极大潜力.
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丙型肝炎病毒C区的DNA改组
目的:利用DNA改组技术进行不同基因型别丙型肝炎病毒(HCV)基因组C区的人工进化. 方法:首先利用PCR扩增了三段具有较高序列同源性的460 bp基因片段,然后将其等量混合,在Mg2+存在的条件下,用脱氧核糖核酸酶(DNase Ⅰ)切割成50 bp左右的小片段.这些小片段在不外加引物的条件下,利用PCR反应进行重聚,再将重聚物经过一轮正常的PCR扩增. 结果:获得了与原片段大小相当的基因片段. 结论:这一技术为进一步筛选高活性的HCV C区基因打下基础,有利于从一组序列同源性程度较高的基因库构建随机嵌合基因,并为改组其他基因家族提供了借鉴.
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DNA改组及其在疫苗研制中的应用
DNA改组(DNA shuffling)是上世纪90年代中期发展起来的一种全新的分子水平上的人工定向进化技术.它模拟自然界进化的机制,改变了传统的进化途径,通过体外重组来改造靶基因,并定向筛选具有预期性状的突变体,从而大大加速了蛋白质的进化进程.该技术自建立以来,已在生物工程各领域得到了越来越广泛的应用.本文总结了DNA改组的基本原理、技术路线、特点、改进与发展,并综述了其在疫苗研制方面的研究进展.
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不同亚类小鼠IgG对SpA和SpG单结构域构成的随机组合噬菌体文库的体外进化研究
目的判断不同亚类小鼠IgG Fc段构像及与SpA或SpG的结合特点,采用不同亚类小鼠IgG对SpA和SpG单结构域构成的随机组合噬菌体展示文库进行亲和筛选。方法不同亚类小鼠IgG对噬菌体文库进行亲和筛选,获得具有结合优势的单结构域排列组合,噬菌体ELISA法来比较其与不同亚类小鼠IgG的结合特性,优势组合分子经原核表达蛋白,HRP标记后,ELISA法进一步来比较其与小鼠不同亚类IgG的结合特性。结果小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3分别经过5、4、5和5轮亲和筛选后,其文库的展示片段大小均为2个domain,表明进化完全。测序分析显示：小鼠 IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3筛选得到的具有结合优势组合分子分别是D-D、D-D、A-C和D-C。噬菌体 ELISA验证结合优势组合分子对小鼠不同亚类IgG的结合能力；蛋白经HRP标记后的ELISA结果和筛选不完全一致,但其结合强弱具有一致性,均为：IgG3>IgG2a>IgG2b>IgG1。结论得到3种不存在于天然SpA、SpG分子中,分别与不同亚类小鼠IgG具有较强结合作用的新型组合分子D-D、A-C和D-C,为进一步研究IgG Fc段构像及与SpA或SpG的结合特点提供了新的参考分子。
关键词： 噬菌体文库 定向进化 亚类 新型免疫球蛋白结合分子 -
高通量筛选方法在酶定向进化中的应用
在过去的几十年中,酶作为经济、环保的生物催化剂已经越来越受到工业以及医药领域的重视,与此同时,高通量筛选方法(HTS)作为酶定向进化中的一项重要技术也得到长足的发展.近些年来,一系列高通量筛选方法的建立使得酶的筛选更加灵敏、高效、快捷,大量的能够适用于工业以及医药领域的工程酶也相继产生.综述了近期建立的一些高通量筛选方法,简要概述了各种筛选方法的基本原理以及存在的优点和不足,并对高通量筛选方法将来的发展做出了展望.
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抗菌肽DCD-1L的随机突变及在毕赤酵母中的表达
目的 用毕赤酵母构建抗菌肽DCD-1L的随机多肽库,并使随机多肽在培养基中表达.方法 用定向进化的方法在基因内部造成随机突变,然后将其构建到含有强启动子GAP和α-factor信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体pGAPZαC中,线性化后转化到巴斯德毕赤酵母蛋白酶缺陷株SMD1168中,形成突变库.利用抗生素Zeocin筛选出阳性克隆,并用SDS-PAGE鉴定表达蛋白质.结果 肽库库容达到7.8×103个cfu,在上清中鉴定出了表达蛋白.结论 成功构建了抗菌肽DCD-1L的随机多肽库,并实现了在培养基上清中的表达.
