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引入易错PCR和DNA-shuffling技术构建单链抗体库
目的 引入易错PCR和DNA-shuffling技术构建高库容量的单链抗体库.方法 收集不同年龄、性别、健康状态的人的静脉血各5 mL,提取单个核细胞总RNA,反转录为cDNA,PCR扩增VH和VL基因,应用易错PCR对VH和VL基因进行突变,同时用DNA-shuffling技术对全长单链抗体基因进行体外改组,获得的分子与T载体连接,转化E.coli DH5α,选取阳性克隆,经菌落PCR后酶切鉴定抗体库多样性,计算分析单链抗体库容量.结果 成功构建了库容量为4.37×1013的单链抗体库,经酶切鉴定,初步判定抗体库多样性良好.结论 引入易错PCR和DNA-shuffling技术,成功构建了单链抗体库,为后续筛选高亲和力抗体奠定了实验基础.
关键词： 易错PCR DNA-shuffling 单链抗体库 -
人杀菌/渗透增强蛋白N端功能片段基因突变文库的构建和鉴定
目的 为提高杀菌/渗透性增强蛋白N端功能片段BPI23对内毒素(lipopolysaccharides,LPS)的亲和性,通过易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA改组技术,对其编码序列BPI600进行突变,在大肠杆菌XL10-Gold中构建BPI600基因突变体库.方法 通过控制Mg2+和Mn2+的浓度进行易错PCR,获得BPI600随机突变基因片段,经测序和基因比对,确定BPI600的随机突变率.再对易错PCR产物进行DNA改组,将改组产物克隆至pYD1载体中,转化大肠杆菌XL10-Gold,从Amp抗性(LuriaBertani,LB)固体培养平板上任选10个单菌落,增菌后提取质粒,得到pYD1-shuffled BPI600重组质粒,将质粒进行Hind Ⅲ/ XhoⅠ酶切鉴定,取5个阳性质粒进行DNA测序,通过基因和氨基酸比对鉴定突变情况.结果 测序和基因比对显示,BPI600经易错PCR所获突变文库的随机突变率达2.3％;改组后重组质粒的酶切结果表明,在随机选择的10个菌落所提质粒中,有6个含BPI600,表明构建了重组质粒pYD1-shuffled BPI600;在5个阳性质粒中,有4个重组质粒的BPI23编码序列分别发生了6、9、11和14个碱基突变;1个不仅有10个碱基突变,还存在1个碱基的缺失.氨基酸比对表明,有2个质粒(分别有6和14个碱基突变)具有正确的读码框,能够翻译完整的蛋白质,各有4或14个氨基酸突变.3个质粒因含终止密码子而不能表达完整目的蛋白.结论成功构建pYD1-shuffled BPI600重组质粒,获得库容量为2×105的突变文库,为高内毒素亲和力突变体的筛选奠定了基础.
关键词： 人杀菌/渗透增强蛋白 定向进化 易错PCR DNA改组 -
酶的体外定向进化策略研究进展
酶的体外定向进化是目前酶学工程发展的一个新技术,本文综述了易错PCR、DNA重组等策略的进展,该项技术为医学、工业、农业等方面提供了广阔的前景.
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基于易错PCR的菌丝霉素的定向进化
以菌丝霉素成熟肽经大肠杆菌密码子优化后的基因为基础,采用易错PCR技术,使用低保真的Taq酶,调整Mg2+浓度、添加Mn2+,改变PCR扩增程序,获得易错PCR产物.经克隆、转化后,挑取200株突变体进行测序鉴定,并进行抑菌活性筛选,筛得突变体M-1.基因比对结果显示,突变体M-1中有1个碱基发生突变,使得31位氨基酸由丙氨酸(Ala)变成精氨酸(Arg).蛋白质分子空间结构模拟显示,突变位点位于蛋白质的β折叠上,靠近活性中心,氨基酸残基由疏水性变成极性,推测更有利于与lipid Ⅱ的特异性结合,增强抑菌活性.本研究还对突变体小肽M-1进行了分离纯化.抑菌活性试验表明,突变体小肽M-1的抑菌活性是菌丝霉素的2倍.
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基于易错PCR的头孢菌素C酰化酶的定向进化
以前期工作中获得的一个可以直接转化头孢菌素C (CPC)为7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的CPC酰化酶为基础,采用易错PCR,引入不同浓度的Mg2+和Mn2+,所得易错PCR产物经克隆、转化后进行初筛,共筛选了400株转化子,其中有35株酶活力得到提高.采用金属螯合亲和色谱法分离得到纯酶后再进行复筛,其中一株酶活力显著提高,转化率提高约35％.测序结果显示,该CPC酰化酶突变蛋白的编码序列中有两个碱基发生突变,使得第122位的丙氨酸被替换为缬氨酸.在适条件下,该酶催化CPC生成7-ACA的转化率为95％.
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全局转录工程法构建产S-腺苷蛋氨酸重组酿酒酵母的研究
利用全局转录工程(global transcription machinery engineering,gTME)方法对酿酒酵母RNA聚合酶Ⅱ中的转录因子SPT15和TAF25编码的基因进行克隆并结合易错PCR随机突变,将SPT15和TAF25的易错PCR产物连接改造的pYES2.0表达载体.并用醋酸锂转化的方法转化酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2846中,研究了SPT15和TAF25的定向进化对酿酒酵母产S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)的影响.经过筛选分别获得了重组酿酒酵母菌株spt15-81和taf25-36.对其发酵性状分别进行了初步研究,在28℃、200 r/min条件下,250 mL摇瓶(50 mL O-medium)发酵48 h时,SAM的产量分别比对照菌株提高了2.0倍和1.8倍.由此表明,SPT15和TAF25是对酿酒酵母进行代谢工程改造的重要转录因子
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微生物基因工程育种技术的研究进展
微生物基因工程育种是20世纪末发展起来的分子定向育种技术,该文重点概述了基因定点突变、易错PCR、DNA重排及基因组重排这几种微生物基因工程育种的基本原理和操作过程,并对这些方法的研究进展进行了扼要综述.
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蛋白质定向进化技术在改进单链抗体亲和力方面的研究进展
蛋白质定向进化(DE)在蛋白质工程中取得了令人瞩目的成就,其核心技术--随机突变库构建技术已成为近年来体外DE研究的热点.在对单链抗体进行改进时可以通过引入有性PCR,易错PCR和DNA改组等蛋白质DE技术进行突变和重组,对所得的抗体库进行DE,增加分子遗传多样性,从而提高获得高亲和力、良好稳定性抗体的概率.我们综述了DE的原理和基本方法,并阐述了研究意义和在改进单链抗体亲和力方面的新研究成果.
