首页 > 文献资料
-
人杀菌/渗透增强蛋白N端功能片段基因突变文库的构建和鉴定
目的 为提高杀菌/渗透性增强蛋白N端功能片段BPI23对内毒素(lipopolysaccharides,LPS)的亲和性,通过易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA改组技术,对其编码序列BPI600进行突变,在大肠杆菌XL10-Gold中构建BPI600基因突变体库.方法 通过控制Mg2+和Mn2+的浓度进行易错PCR,获得BPI600随机突变基因片段,经测序和基因比对,确定BPI600的随机突变率.再对易错PCR产物进行DNA改组,将改组产物克隆至pYD1载体中,转化大肠杆菌XL10-Gold,从Amp抗性(LuriaBertani,LB)固体培养平板上任选10个单菌落,增菌后提取质粒,得到pYD1-shuffled BPI600重组质粒,将质粒进行Hind Ⅲ/ XhoⅠ酶切鉴定,取5个阳性质粒进行DNA测序,通过基因和氨基酸比对鉴定突变情况.结果 测序和基因比对显示,BPI600经易错PCR所获突变文库的随机突变率达2.3％;改组后重组质粒的酶切结果表明,在随机选择的10个菌落所提质粒中,有6个含BPI600,表明构建了重组质粒pYD1-shuffled BPI600;在5个阳性质粒中,有4个重组质粒的BPI23编码序列分别发生了6、9、11和14个碱基突变;1个不仅有10个碱基突变,还存在1个碱基的缺失.氨基酸比对表明,有2个质粒(分别有6和14个碱基突变)具有正确的读码框,能够翻译完整的蛋白质,各有4或14个氨基酸突变.3个质粒因含终止密码子而不能表达完整目的蛋白.结论成功构建pYD1-shuffled BPI600重组质粒,获得库容量为2×105的突变文库,为高内毒素亲和力突变体的筛选奠定了基础.
关键词： 人杀菌/渗透增强蛋白 定向进化 易错PCR DNA改组
