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水蛭素基因DNA家族改组方法的建立
目的:运用DNA家族改组技术,增加改组分子库的多样性.方法:取水蛭素HV1、HV2、HV3基因等量混合,用DNase Ⅰ消化,回收50bp左右的片段,再经无引物和有引物PCR扩增获得与原基因大小相同的改组分子,将其与载体连接获得水蛭素改组文库,DNA测序观察改组效果.结果:随机挑取3个克隆均为3种模板基因片段的杂合体,表明改组分子库多样性较好,改组方法较为成功.结论:水蛭素基因DNA家族改组方法的成功建立为进一步筛选高活性的水蛭素奠定了基础.
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定向进化人α型干扰素基因家族的研究
应用DNA改组(DNA shuffling)技术重组了12种人α型干扰素基因,并结合噬菌体表面呈现(phage display)技术构建了噬菌体干扰素改组文库,采用简便的、功能性的定向竞争筛选方法, 获得了比活达1.0×109IU/mg的新型α型基因工程复合干扰素,是目前国际上已投产的α2型干扰素的5倍,具有生产应用前景,上述策略也为其它细胞因子或酶的改造提供了借鉴方法.
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生物分子工程面临的挑战及我国现状——生物分子工程领域的研究进展
生物分子工程是科学研究和生产中一个崭新的领域,其主要任务是发现和生产有价值的生物分子,随着对生物分子在细胞内作用认识的深化,生物分子工程必将有重大的进展,这一进展又会进一步推动生物分子工程在医药、工业、农业和环保等领域更加广泛的应用.DNA改组(DNA shuffling)做为一种实用的分子进化技术自诞生之日起就受到了广泛的关注,它在生物分子工程中起着关键的作用.本文综述了生物分子工程领域的关键技术和主要产品及发展动态.
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尘螨Ⅱ类变应原Der f2和Der p2的DNA改组及生物信息学分析
目的 构建尘螨Ⅱ类变应原Der f2和Der p2嵌合基因文库,并进行生物信息学分析.方法 用PCR分别扩增Der f2和Der p2,扩增产物等量混合后用DNaseI酶解；回收50 ～ 100 bp的片段,连续3轮无引物PCR,以Der f2基因的特异性引物进行有引物PCR,扩增片段连接于pUCm-T载体并转化E.coliDH-5α,随机挑取60个单菌落测序,应用生物信息学进行序列比对分析和抗原表位预测(包括T和B细胞抗原表位).结果 获得的10个重组子其编码蛋白不仅呈现新的Th细胞表位,也减少了B细胞表位.结论 成功获得Der f2和Der p2嵌合基因文库,为后期筛选和制备高免疫原性和低变应原性的高效尘螨哮喘疫苗奠定了基础.
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杀菌蛋白DNA改组的初步研究
目的运用DNA家族改组方法提高杀菌蛋白(BPI23)的杀菌活性. 方法首先将人、猴、兔BPI23基因的PCR产物等量混合,用DNAaseⅠ消化,回收50bp左右的片段,再经无引物和有引物2步PCR反应获得与原基因大小相同的改组分子,将其与载体连接获得改组文库.应用Flp-InTM定点整合表达系统,将BPI23改组文库插入CHO细胞基因组中1个单拷贝位点,分别检测各个细胞克隆的杀菌活性,从中筛选高活性的BPI23改组分子. 结果经过2轮改组和筛选,共获得4个活性高于人BPI23约4倍的克隆,它们与人BPI23基因有7～13个氨基酸的变化. 结论探索了在CHO系统中进行DNA改组和筛选的方法与技术路线,成功进行了杀菌蛋白的改组,并为其它分子的改组提供了借鉴.
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DNA改组--定向进化的技术革命
DNA改组(DNA shuffling)是90年代中期发展起来的一种新技术.该文概述了有关DNA改组的基本原理和方法,并跟踪了当今该领域的新研究成果和发展动态.
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一种优化的DNA家族改组方法
目的:优化DNA家族改组方法,增加改组分子库的多样性.方法:以人、猴、兔的BPI23基因为模板,首先将3种基因的PCR产物等量混合后用DNaseⅠ消化,回收50bp左右的片段,再经过无引物和有引物两步PCR反应获得与原基因大小相同的改组分子,将其与载体连接获得改组分子库.随机挑取4个克隆测序观察改组效果.结果:4个克隆均为3种模板基因片段的杂合体,其中3个克隆还包含氨基酸点突变,表明改组分子库多样性较大,改组方法较为成功.结论:该方法的建立为进一步筛选高活性的BPI23分子打下基础,并为改组其他基因家族提供了借鉴.
关键词： DNA改组 体外进化 杀菌/通透性增加蛋白 -
人杀菌/渗透增强蛋白N端功能片段基因突变文库的构建和鉴定
目的 为提高杀菌/渗透性增强蛋白N端功能片段BPI23对内毒素(lipopolysaccharides,LPS)的亲和性,通过易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA改组技术,对其编码序列BPI600进行突变,在大肠杆菌XL10-Gold中构建BPI600基因突变体库.方法 通过控制Mg2+和Mn2+的浓度进行易错PCR,获得BPI600随机突变基因片段,经测序和基因比对,确定BPI600的随机突变率.再对易错PCR产物进行DNA改组,将改组产物克隆至pYD1载体中,转化大肠杆菌XL10-Gold,从Amp抗性(LuriaBertani,LB)固体培养平板上任选10个单菌落,增菌后提取质粒,得到pYD1-shuffled BPI600重组质粒,将质粒进行Hind Ⅲ/ XhoⅠ酶切鉴定,取5个阳性质粒进行DNA测序,通过基因和氨基酸比对鉴定突变情况.结果 测序和基因比对显示,BPI600经易错PCR所获突变文库的随机突变率达2.3％;改组后重组质粒的酶切结果表明,在随机选择的10个菌落所提质粒中,有6个含BPI600,表明构建了重组质粒pYD1-shuffled BPI600;在5个阳性质粒中,有4个重组质粒的BPI23编码序列分别发生了6、9、11和14个碱基突变;1个不仅有10个碱基突变,还存在1个碱基的缺失.氨基酸比对表明,有2个质粒(分别有6和14个碱基突变)具有正确的读码框,能够翻译完整的蛋白质,各有4或14个氨基酸突变.3个质粒因含终止密码子而不能表达完整目的蛋白.结论成功构建pYD1-shuffled BPI600重组质粒,获得库容量为2×105的突变文库,为高内毒素亲和力突变体的筛选奠定了基础.
关键词： 人杀菌/渗透增强蛋白 定向进化 易错PCR DNA改组 -
DNA改组及其在HPV治疗性疫苗研制中的应用
DNA改组(DNA shuffling)技术是一项全新的体外人工进化模式,是迄今为止所建立的有效的分子进化技术.近年来,随着该技术的改进及高通量筛选方法的日趋成熟和完善,DNA改组在基因工程疫苗开发中表现出巨大的发展潜力.
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宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E7基因的DNA改组
目的 利用DNA改组技术进化人乳头瘤病毒16型E7(HPV16E7)基因,建立HPV16E7基因突变体库.方法 从宫颈癌标本中扩增出HPV16E7基因,用脱氧核糖核酸酶(DNaseⅠ)碎片化该基因,切割成50 bp左右的小片段.这些小片段在不外加引物的条件下,利用PCR反应进行重聚,再将重聚物经过一轮普通PCR扩增.结果 电泳切胶回收获得与原片段大小相当的基因片段,改组结果较为成功.结论 DNA改组在HPV16E7改组中的应用并成功,有利于从HPV16E7基因突变题库中筛选出高免疫原性的基因型别,并为进一步构建HPV治疗性疫苗奠定基础.
关键词： 人乳头瘤病毒16型E7基因 DNA改组 宫颈癌 人乳头瘤病毒疫苗 -
利用DNA改组筛选高活性抗凝血酶Ⅲ
目的利用DNA改组技术大幅度提高抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)的生物活性.方法采用RQ1 DNase Ⅰ不完全酶解ST-Ⅲ基因,产生长度为50～100 bp的随机片段,用低熔点胶回收.无引物PCR从小片段组装成大片段,通过有引物PCR得到正确大小的片段.线性化的质粒通过电转转入毕赤酵母GS115细胞.结果获得了5株高活性的克隆.结论探索了在毕赤酶母进行DNA改组和筛选的方法和路线,成功进行了AT-Ⅲ的改组,并为其它分子的改组提供借鉴.
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酶的体外定向进化策略研究进展
酶的体外定向进化是目前酶学工程发展的一个新技术,本文综述了易错PCR、DNA重组等策略的进展,该项技术为医学、工业、农业等方面提供了广阔的前景.
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酶定向进化的研究策略
定点突变是酶工程中研究酶的结构与功能的常规手段,并广泛用于改变酶的性能.酶的体外定向进化是改造生物催化剂的一种有效的新策略,主要是模拟自然进化进程,通过容错PCR等技术对编码酶的基因进行随机突变,再由DNA改组、交错延伸过程、随机引导重组、递增截短技术等进行突变基因的体外重组,终经筛选获得所需的酶.本文综述了酶定向进化的研究与应用.
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蛋白质工程技术与新型生物催化剂设计
生物催化剂的分子设计研究是发展新型生物催化剂的重要手段.蛋白质工程技术的应用为其发展提供了有效的技术平台.定点突变技术、DNA改组与体外定向进化技术等已在创造新型生物催化剂、改造天然生物催化剂的结构与功能方面呈现出良好发展前景.本文对有关技术的原理与应用及其已取得的主要研究成果做了简要介绍与讨论.
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蛋白定向进化及应用进展
目的 作为对自然进化的体外模拟,定向进化是改进蛋白功能与活性的有效手段.定向进化的成功与否取决于突变体库的多样性以及筛选方法的效率.目前已发展出多种创造和筛选突变体的策略及手段,并将定向进化的对象从蛋白延伸到有机体,使定向进化在许多领域得到了广泛的应用.
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蛋白质的定向进化及应用
酶的定向进化是蛋白质工程的新策略,它模拟自然的进化机制,用突变和定向筛选的方法在体外人为改造酶.此文综述了定向进化的原理和基本方法,并阐述了研究意义和在医药领域的新研究成果.
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丙型肝炎病毒C区的DNA改组
目的:利用DNA改组技术进行不同基因型别丙型肝炎病毒(HCV)基因组C区的人工进化. 方法:首先利用PCR扩增了三段具有较高序列同源性的460 bp基因片段,然后将其等量混合,在Mg2+存在的条件下,用脱氧核糖核酸酶(DNase Ⅰ)切割成50 bp左右的小片段.这些小片段在不外加引物的条件下,利用PCR反应进行重聚,再将重聚物经过一轮正常的PCR扩增. 结果:获得了与原片段大小相当的基因片段. 结论:这一技术为进一步筛选高活性的HCV C区基因打下基础,有利于从一组序列同源性程度较高的基因库构建随机嵌合基因,并为改组其他基因家族提供了借鉴.
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DNA改组及其在疫苗研制中的应用
DNA改组(DNA shuffling)是上世纪90年代中期发展起来的一种全新的分子水平上的人工定向进化技术.它模拟自然界进化的机制,改变了传统的进化途径,通过体外重组来改造靶基因,并定向筛选具有预期性状的突变体,从而大大加速了蛋白质的进化进程.该技术自建立以来,已在生物工程各领域得到了越来越广泛的应用.本文总结了DNA改组的基本原理、技术路线、特点、改进与发展,并综述了其在疫苗研制方面的研究进展.
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粉尘螨主要变应原基因Der f2和Der f3基因改组的优化
目的：优化粉尘螨变应原Der f2和Der f3基因改组条件，以期获得粉尘螨变应原融合突变基因。方法 RT- PCR方法扩增粉尘螨变应原Der f2和Der f3基因，用DnaseⅠ分别酶解Der f2和Der f3基因10、15、20、25、30min；酶解相同时间的Der f2和Der f3基因两两混合，采用DNA shuffling技术对粉尘螨变应原Der f2和Der f3基因进行重组，电泳检测重组子。结果以Der f1 F和Der f1 R、Der f2 F和Der f2 R为引物分别在酶切10min、15min、20min、25min均可扩增出清晰条带；以Der f2 F和Der f3 R为引物在酶切10min、15min和30min的模板中亦出现PCR片段。结论通过多种条件的组合，可获得多个粉尘螨变应原Der f2和Der f3基因间的融合基因，为大规模制备高效，低价的哮喘疫苗奠定基础。
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粉尘螨主要变应原基因Der f1和Der f3改组的研究
目的:探索粉尘螨变应原基因Der f 1和Der f 3改组条件,以期获得粉尘螨变应原融合突变基因.方法:RT-PCR方法扩增粉尘螨变应原Der f 1和Der f 3基因,用DnaseⅠ分别酶解Der f 1和Der f 3基因10、15、20、25、30 min;酶解相同时间的Der f 1和Der f 3基因片段两两混合,采用DNA shuffling技术对粉尘螨变应原Der f 1和Der f 3基因进行重组,琼脂糖凝胶电泳检测重组子.结果:以Der f 2 F和Der f 2 R为引物在酶切10、15、20、25、30 min均可扩增出清晰条带;以Der f 1 F和Der f 1 R、Der f 1 F和Der f 2 R、Der f 2 F和Der f 1 R为引物在酶切10、15、20、25、30 min的模板中均无条带出现;而其他引物组合则在不同酶切时间的模板中均出现条带.结论:通过多种条件的组合,可获得多个粉尘螨变应原基因Der f 1和Der f 3间的融合基因,为大规模制备高效、低价的哮喘疫苗奠定了基础.
