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肺炎链球菌表型多样化的分子机制:遗传与表观遗传策略的共同作用
肺炎链球菌采取高度的遗传可塑性来产生表型多样性.其遗传可塑性体现在该物种具有高度多变的基因组序列,进而产生不同菌株间包括耐药性、荚膜多糖和表面蛋白的抗原性、菌落形态、致病性等的表型多样性.肺炎链球菌的自然转化介导的从环境中获取外源DNA的能力是使其产生遗传可塑性的主要机制.我们实验室近的单分子测序研究发现肺炎链球菌能够通过DNA甲基转移酶基因的重组产生具有不同染色体DNA甲基化图案(甲基化谱)的子代细胞,这些表观遗传水平上的可逆性变化进而产生透明菌落与非透明菌落之间的可逆性相转变.产生透明菌落与非透明菌落的肺炎链球菌在宿主上皮细胞的黏附和上呼吸道的定植等致病性相关表型方面存在很大差异.在这篇综述中,我们描述了肺炎链球菌如何利用遗传和表观遗传机制增加其表型多样性,重点总结DNA重组所导致的表观遗传变异与菌落形态相转变在该病原体定植与致病性方面的贡献.
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蛋白质药物的功能分类及发展趋势
经过半个多世纪的快速发展,生命科学的理论体系更加丰富,生命科学领域的新概念、新进展不断涌现.以基因克隆、DNA重组为代表的分子生物学及生物技术体系逐步完善;基因组、蛋白质组、转录组、代谢组等各种"组学"(-omics)的海量数据库及生物信息学的广泛运用;分子医学进步带来的对疾病病因、病理及发病机制认识的逐步深入;
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肠出血性大肠埃希菌O157:H7 espA基因的克隆与表达
目的通过DNA重组技术表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的EspA蛋白,并分析其免疫学性质.方法采用PCR技术从EHEC O157:H7基因组中扩增espA基因,T/A法克隆,连接至pET-28a(+)载体上,转化宿主细胞E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE测定其相对分子质量,同时分析其N端氨基酸序列,免疫家兔鉴定其抗原性.结果重组espA基因片段的测序结果与GenBank上基因序列只有1个碱基不同,一致性为99.83%,所编码的氨基酸序列没有改变.重组EspA蛋白在工程菌中以包涵体的形式表达,表达量约30%.免疫家兔所得抗体滴度为1:32.结论构建高效表达EspA蛋白的重组载体pET-28a(+)-espA,表达的蛋白具有良好的免疫原性,为进一步制备亚单位疫苗奠定基础.
关键词： EHEC O157:H7 espA基因表达 DNA重组 -
线粒体DNA A1555G突变大规模筛查及其预防意义探讨
目的探讨在高危人群和特定人群中进行线粒体DNAA1555G突变基因筛查在预防药物性耳聋中的必要性.方法应用自主研制的线粒体DNA A1555G突变检测试剂盒对来自全国不同省市的1836例散发的非综合征性耳聋患者进行线粒体DNAA1555G突变基因筛查,筛出阳性个体,进一步了解阳性病例所有母系家庭成员状况,绘制详细家庭系谱图,对母系成员中未发病者进行防聋宣教.结果1836例中,63例存在线粒体DNAA1555G突变,突变率3.43%;在63个母系遗传家系中,8例失随访,3例不愿提供家系资料;52个有完整随访资料的家系中,存活母系家庭成员737人,耳聋发病201人(含先证者),未发病536人.结论在高危人群和特定人群中进行线粒体DNAA1555G突变基因筛查发现氨基糖甙类抗生素致聋敏感个体,进而对其未发病母系家庭成员进行防聋宣教是预防药物性耳聋、减少药物性耳聋发生率的有效措施.
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高迁移率族蛋白B1及其信号分子作用研究进展
HMGB1是HMGB亚家族成员之一.早期研究显示,HMGB1是一种DNA结合蛋白,通过与多种转录因子、复制蛋白、甾体受体及RAG1重组酶作用,参与DNA重组、修复、基因转录调控,细胞复制和分化成熟等多种生命活动[1].
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DNA甲基化与膀胱癌研究进展
DNA甲基化(DNA methylation)是在DNA序列不变的情况下,控制基因表达,维护染色体的完整性和调节DNA重组及某些特定基因组区域的转录活性,是恶性肿瘤普遍存在的分子生物学改变.肿瘤相关基因启动子CpG岛甲基化状态异常广泛见于肿瘤,有望作为临床肿瘤诊断的分子标记[1].膀胱癌是泌尿系常见的恶性肿瘤,而膀胱癌与DNA甲基化关系近年来已成为膀胱癌研究热点之一.
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人胸苷激酶基因在大肠杆菌中的表达
目的在大肠杆菌中表达人胸苷激酶(hTK).方法用内切酶将hTK TA克隆中的hTK基因切下,并与同样内切酶切的载体PET28a+连接,转化大肠杆菌,筛选阳性克隆,酶切和DNA序列分析鉴定,用IPTG诱导培养阳性克隆;SDS-PAGE鉴定hTK在大肠杆菌中的表达.结论 hTK基因重组入PET28a+的EcoRI和XhoI位点,IPTG可以明显诱导hTK在大肠杆菌中表达.
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人内皮生长抑素基因在大肠杆菌中的高效表达及活性检测
目的获得具有抑制血管内皮细胞生长活性的人重组内皮生长抑素(endostatin)蛋白,以研究其在治疗肿瘤及血管性疾病中的潜在应用价值.方法从人的胎盘中分离总RNA经反转录聚合酶链反应(RT-PCR), 得到endostatin的全基因,并将其与质粒pUCm-T重组,测序证明获及的人内皮生长抑素基因的序列与先前报道一致后,用限制性内切酶将其切下与表达载体pET-11a重组,转化受体菌BL-21(DE3)中,用IPTG诱导以包涵体形式表达,经层析纯化,鸡绒毛尿囊膜血管(CAM )检测活性.结果经SDS-PAGE检测,重组人内皮生长抑素蛋白的分子量为2 0 KD,表达量约占蛋白总量的40%.纯化后的内皮生长抑素对鸡的绒毛尿囊膜血管的生长有明显的抑制作用.结论得到了具有生物活性的重组人内皮生长抑素蛋白,为下一步的临床肿瘤及血管性疾病的治疗奠定了基础.
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携带人野生型PKGⅠα基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定
目的:克隆人PKGⅠa基因,构建其重组腺病毒载体.方法:用RT-PCR方法从人肺动脉平滑肌组织中扩增PKGⅠa基因全长,经T/A克隆后,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建穿梭质粒pAdTrack-PKGⅠα.PmeⅠ酶切pAdTrack- PKGⅠα,然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pAdTrack-PKGⅠα转化至BJ5183感受态细菌中进行同源重组,PacⅠ酶切线性化重组质粒AdCMV-PKGⅠα后转染Ad293细胞进行病毒包装和扩增.检测PKGⅠα基因的表达,并用绿色荧光蛋白(GFP)法测定其滴度.结果:用RT-PCR方法,从人肺动脉中层扩增出PKGⅠα,测序证实为人PKGⅠα基因.构建了PKGⅠα基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒保存液.结论:成功地克隆了人PKGⅠα基因,并构建其重组腺病毒载体,为进一步研究PKGⅠα基因在低氧肺血管重建中的作用提供了有效的基因转移载体.
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人PRX 3原核表达质粒的构建及表达
目的 构建人Peroxiredoxin 3(PRX3)原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达.方法 采用基因工程技术将PRX3编码序列插入原核表达质粒载体pET-30(a),再将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析.结果 酶切鉴定和DNA测序证实人PRX3编码序列全长正确地插入表达质粒中,序列与GenBank报道的一致;重组PRX3在大肠杆菌获得高效表达,且易形成包涵体.结论 人PRX3原核表达质粒构建成功,并能在大肠杆菌中高效表达,为后续研究奠定了良好基础.
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单纯疱疹病毒1型特异性表位的串联表达及免疫性质的研究
目的: 串联重组表达单纯疱疹病毒1型(HSV-1)特异性表位,以获得具有抗原反应性能用于HSV-1鉴别诊断的抗原. 方法: 采用DNA重组技术将HSV-1特异性表位gG112-127进行串联,获得不同倍数重复串联的基因片段.将含有不同重复倍数的基因片段与表达载体连接,转化至宿主细胞JM109,异丙基-硫代-β-D-半乳糖苷诱导,SDS-PAGE分析其表达,Western 印迹分析其抗原反应性. 结果: 获得了4×、8×、16×、32×重复串联的阳性重组子.其中8×重组子在JM109细菌中得到了17.5%的表达,其表达产物主要以包涵体形式存在.Western 印迹显示此重组蛋白能与HSV-1抗血清发生抗原抗体反应,而不与HSV-2抗血清发生抗原抗体反应.结论: HSV-1-gG112-127重组蛋白可作为HSV-1特异性检测的抗原来鉴别诊断HSV-1和HSV-2的感染.
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重组人白细胞介素15表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达
目的:获得重组人白细胞介素15(rhIL-15)高效表达菌株.方法:经细菌脂多糖+γ干扰素活化的人外周血单个核细胞提取细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增出编码人IL-15 cDNA的基因片段,采用pBV220表达载体,经DNA重组技术构建IL-15基因工程菌.结果:核酸序列测定与预期一致,所表达的IL-15经SDS-PAGE证明分子量约15kD,表达量占菌体总蛋白的28%,经CTLl2细胞检测,表达产物粗提物1∶100复性后效价可达到106IU/ml.结论:构建的基因工程菌为IL-15高效表达菌株.
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Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶重组腺病毒载体的构建、鉴定及初步应用
目的: 构建携带Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶(PKGⅡ)基因的重组腺病毒载体,并以此初步研究PKGⅡ对增殖相关的MAPK信号转导的影响.方法: 将PKGⅡ cDNA片段自载体pRC/CMV-GKⅡ(wt)中切出,克隆至穿梭质粒pENTR 1A,用ClonaseⅡ将pENTR-PKGⅡ中的PKGⅡ cDNA片段定向克隆到pAd/CMV/V5-DEST中构建pAd/CMV/V5-DEST-PKGⅡ(Ad-PKGⅡ).重组质粒Ad-PKGⅡ用PacⅠ酶酶切,使其线性化,再用脂质体转染法转染HEK293A细胞进行包装和扩增,微量全细胞病变法检测病毒滴度,蛋白质印迹法检测重组腺病毒Ad-PKGⅡ感染细胞后PKGⅡ的表达以及MAPK通路关键成分胞外信号调节激酶(ERK)活性的变化.结果: 重组腺病毒滴度达5×109 pfu/ml,蛋白质印迹法检测显示重组腺病毒感染CS54细胞后使其PKGⅡ表达明显增高;在BGC-823胃癌细胞株, PKGⅡ对EGF导致的ERK的激活有明显抑制作用.结论: 成功构建了携带PKGⅡ基因的重组腺病毒,初步证明PKGⅡ对细胞增殖相关信号转导有抑制作用,为进一步研究PKGⅡ与肿瘤细胞发生发展的关系提供了基础.
关键词： Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶 腺病毒载体 DNA重组 胞外信号调节激酶 -
降钙素基因相关肽真核表达载体pcDNA3.1/CGRP的构建
目的 构建带有大鼠降钙素基因相关肽基因(rCGRP)的重组真核表达载体pcDNA3.1(+)/rCGRP.方法 应用Trizol试剂从SD大鼠脑组织提取总RNA,RT-PCR扩增rCGRPcDNA(PCR引物上加上双酶切位点),产物通过Hind Ⅲ和BamH I酶切、纯化、连接,将目的 基因插入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+),再将重组质粒转化感受态细菌,通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,再经PCR、酶切和测序鉴定所得克隆.结果 (1)RT-PCR产物电泳分析扩增产物行1%琼脂糖凝胶电泳后可见一条特异的片段,和rCGRPcDNA大小相吻合;(2)重组克隆鉴定①PCR鉴定.PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳后可见一条特异的片段,和rCGRPcDNA大小相吻合;②酶切鉴定,抽提质粒经双酶切.酶切产物行1%琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪下可见两特异性条带,分别和pcDNA3.1(+)和rCGRPcD-NA大小相吻合;③DNA测序,测序结果经BLAST分析,与rCGRP基因编码区全长序列完全一致.结论 (1)大鼠脑组织中有rCGRP的表达;(2)通过RT-PCR及基因重组技术成功构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)/rCGRP.
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弓形虫和乙型肝炎病毒混合核酸疫苗的研究Ⅰ.pcDNA3-HBsAg-GRA1真核表达质粒的构建及鉴定
目的构建pcDNA3-HBsAg-GRA1真核表达质粒,为提高弓形虫DNA疫苗保护性做出新的探索,并期望"一/+-苗两用".方法采用PCR分别扩增HBsAg、GRA1;经BclⅠ、EcoRⅠ双酶切HBsAg;EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切GRA1;BamHⅠ、XhoⅠ双酶切载体pcDNA3.0;HBsAg、GRA1、pcDNA3.0双酶切纯化产物与T4DNA连接酶在22℃连接过夜,用双酶切及双脱氧末端终止法测序鉴定重组质粒.结果成功构建pcDNA3-HBsAg-GRA1真核表达质粒.结论为进一步研究pcDNA3-HBsAg-GRA1诱导的保护性免疫奠定了基础.
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重组腺病毒及其基因组裸DNA免疫效果差异的初步分析
目的:研究重组腺病毒及其基因组裸DNA免疫效果的差异,探讨重组腺病毒疫苗免疫接种的新途径.方法:构建人乳头瘤病毒重组腺病毒rAd5-L1E7,用TCID50微量滴定法测定病毒滴度.将0.1ml滴度为10-4重组腺病毒和10μg重组腺病毒基因组DNA分别肌肉注射免疫BALB/c小鼠,在接种后第1～5周分离小鼠血清.以HPV16 L1E7重组蛋白为抗原,用ELISA方法检测血清HPV16特异性抗体水平.通过T细胞增殖试验和检测脾细胞IFN-γ水平确定疫苗诱导的细胞免疫,并分析二者之间的差异.结果:重组腺病毒及其基因组裸DNA免疫接种均能有效地诱导体液和细胞免疫,抗体达到高峰的时间不同,二者在第3和第4周血清抗体IgG水平差异有统计学意义(P<0.05).T淋巴细胞增殖试验结果和脾细胞分泌IFN-γ水平差异无统计学意义.结论:重组腺病毒基因组裸DNA接种能够有效地诱导细胞和体液免疫应答,是腺病毒疫苗接种的一种新途径.
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人内皮抑素基因改造、表达、纯化及活性检测
目的克隆诱变的人内皮抑素(human endostatin,hES)氨基端基因,并检测其活性.方法双酶切已诱变的人内皮抑素基因,电泳回收氨基端片段,与质粒pTYB-2重组,转化E.coli BL-21(DE3).通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验,MTT实验,HE染色及流式细胞术检测重组小分子人内皮抑素对新生血管生成、细胞增殖和细胞凋亡的影响.结果基因重组小分子内皮抑素对鸡胚尿囊膜新生血管生成具有明显的抑制作用;对脐静脉内皮细胞和肝癌细胞增殖的抑制存在量效关系;作用24 h后,观察到细胞凋亡现象;与对照组相比,细胞凋亡数增加.结论成功构建了人内皮抑素氨基端基因工程菌,得到了具有生物活性的氨基端小分子内皮抑素,为便利临床应用奠定了基础.
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利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒
目的: 利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒,为制备PEP-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础. 方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT 全长cDNA.将扩增的CAT cDNA 与dATP 反应,利用Taq DNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CAT cDNA的3′末端加"A"并纯化,然后应用TA克隆策略将纯化后的CAT cDNA插入至中间载体pGEM-T Easy Vector中,经PCR、限制性酶切分析鉴定重组子pGEM-T-CAT.人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸,两端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1,然后酶切鉴定.pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经SalⅠ-BglⅡ和XhoⅠ-BamHⅠ双酶切,利用同尾酶(SalⅠ与XhoⅠ,BglⅡ与BamHⅠ)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CAT cDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实. 结果: 获得pET15b-PEP-1-CAT重组子,经测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为"AY028632"的CAT cDNA序列一致. 结论: pET15b-PEP-1-CAT的成功构建为产生融合蛋白His tag-PEP -1-CAT进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定了基础.
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弓形虫真核表达质粒pcDNA3/ GRA1的构建及序列测定
目的:构建弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)真核表达质粒,为进一步开展DNA疫苗的保护性研究打下基础.方法:采用PCR扩增出编码GRA1目的基因,用EcoRⅠ/XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切,将GRA1定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ/XhoⅠ位点;对重组质粒进行PCR,双酶切初步鉴定后做序列测定.结果:特异扩增出预计的GRA1片段,大小为573 bp;扩增产物双酶切后成功连接到pcDNA3中,经PCR,双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有GRA1读框.结论:成功构建弓形虫GRA1真核表达质粒.
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两种DNA的PCR产物克隆入同一载体的构建策略
目的以克隆小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛可变区首尾区域的双独立片段为例,探讨克隆入同一载体的基因数多于一个时可采取的构建策略.方法在一个基因A正义引物与另一基因B负义引物的5'端分别设计与克隆载体相匹配的酶切位点,在B基因正义引物与A基因负义引物的5'端设计相同的酶切位点.分别进行PCR扩增,再通过引物的5'端相同的酶切位点进行两PCR产物的酶切与连接,以连接产物为模板,应用A基因正义引物和B基因负义引物进行PCR扩增,将此次PCR产物经常规方法克隆入载体.
