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中国轮状病毒非结构蛋白NSP4基因变异特征的分析
目的研究我国轮状病毒流行株NSP4基因的变异特点.方法对近年来从我国不同地区获得的27份人轮状病毒流行株的NSP4基因用RT-PCR进行扩增,克隆后进行全长cDNA序列分析,并利用Clustal×1.8,TreeView32及DNAStar软件与参比株Wa、KUN、AU-1、EW及来自GenBank的OSU、SA11、Hochi、US244、Bristol株的NSP4序列进行分析比较.采用PCR分型方法对VP7血清型进行鉴定,确定轮状病毒G型与NSP4基因型的关系.结果氨基酸同源性比较表明,我国轮状病毒不同流行株NSP4之间同源性为81.7%～99.4%,据此可将27株RV NSP4分为2组,分别以Wa株和KUN株为代表,其中以Wa组为主.组内同源性分别为92.0%～99.4%和92.0%～98.9%,组内变异率分别为0～8.5%及1.2%～8.5%.两组间变异率达16.6%～21.0%.氨基酸进化树提示在Wa组内包括3个亚组.轮状病毒G血清型与NSP4基因型之间的联系不确定.结论我国流行株NSP4基因主要可分为Wa组和KUN组,在Wa组内可形成三个亚组,并且在高变区有特征性的氨基酸位点.NSP4的变异与年份有关而与地域关系不密切.
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少弱畸形精子症患者H19及MEST基因DNA甲基化分析
目的 比较正常生育男性及少弱畸形精子症患者父系印记基因H19及母系印记基因MEST DNA甲基化的差异. 方法 对2011年3月至2012年2月15例正常生育男性和33例少弱畸形精子症患者精液标本进行常规分析和精子形态分析.密度梯度离心法提纯精液,提取精液基因组DNA并进行亚硫酸氢盐处理,利用PCR体外扩增并将纯化后的PCR产物与pMD(R)18-T载体连接及酶切验证,并对阳性克隆进行测序和DNA甲基化程度差异分析. 结果 正常生育男性H19DNA高甲基化5例,甲基化率为100.0％,10例少弱畸形精子症患者DNA甲基化水平显著下降,甲基化率为93.0％,两组比较差异有统计学意义(P＜0.01).正常生育男性MEST DNA低甲基化10例,甲基化率为1.6％,23例少弱畸形精子症患者DNA甲基化率为4.8％,两组比较差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 H19差异甲基化区域的甲基化异常和男性不育有关,可能成为人类精子形成缺陷的生物学标志之一.
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非小细胞肺癌中表皮生长因子受体基因及蛋白的异常
目的 检测国人非小细胞肺癌标本中表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂疗效预测指标:EGFR蛋白过表达、基因高拷贝和基因突变的发生特点及相互关系.方法 226例肺腺、鳞癌标本制作成组织微阵列,使用免疫组织化学检测EGFR蛋白表达、荧光原位杂交检测基因拷贝数,其中94例腺癌标本进行EGFR基因突变检测.结果 国人非小细胞肺癌中EGFR蛋白过表达率为55.3%,鳞癌中的过表达率高于腺癌(P=0.001);EGFR基因高拷贝发生率42.0%,与各临床特征无显著相关(P>0.05);EGFR基因突变在腺癌标本发生率为42.6%,与女性和非吸烟显著相关(P=0.002);EGFR蛋白过表达与基因高拷贝显著相关(P=0.005),但EGFR基因突变与基因高拷贝和蛋白过表达均无相关(P>0.05).结论 EGFR抑制剂疗效预测指标中,EGFR蛋白过表达和基因高拷贝的发生情况在国人非小细胞肺癌与西方病人相近,仅EGFR基因突变的发生率高于西方病人.
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原发性自发性气胸的FLCN基因突变
目的 探讨中国汉族原发性自发性气胸患者FLCN基因的突变情况.方法 搜集102例无血缘关系的中国汉族原发性自发性气胸患者外周血标本(8例有家族史、94例为散发),并以120例无亲缘关系的中国汉族健康人为对照.采用Chelex-100提取法从外周血标本中分离白细胞,并提取全基因组DNA,以特异引物聚合酶链反应(PCR)扩增,通过单链构象多念性分析(SSCP)以及直接测序法检测并验证突变.结果 10例患者存在FLCN基因编码序列突变,其中4例(有家族史、散发各2例)在FLCN基因第6外显子924～926位存在3个碱基的缺失,可造成苯丙氨酸的缺失;4例(有家族史、散发各2例)在FLCN基因第10外显子1611～1631位20个碱基的缺失,可因移码在下游187nt形成终止密码;1个家系FLCN基因第11外显子1733位16插入C,可因移码在下游187nt形成终止密码;1例散发者在FLCN基因第11外显子1740位C替换成T,即使密码子429处组氨酸变为酪氨酸.健康对照组无FLCN基因编码序列突变.结论 在中国汉族人中,无论散发或是家族性原发性自发性气胸患者均存在较高频率的FLCN基因突变(10%),且有两类新型突变(第6外显子924～926和第10外显子1611～1631位碱基缺失)频发(各为4%).
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子宫颈癌放射治疗后Aurora-A、p21基因的改变
目的 探讨子宫颈癌患者放射治疗前后子宫颈癌组织Aurora-A、p21基因的转录表达变化与临床放射治疗之间的关系.方法 运用RT-PCR的方法检测103例患者子宫颈癌组织中Aurora-A、p21的表达情况及放射治疗前后的变化.结果 103份子宫颈癌组织中89份(86.40%)检测到Aurora-A表达,经放疗后,63份(61.17%)表达减弱、7份(6.80%)表达增强,19份(18.45%)无明显变化,14份(13.59%)放疗前未检测到Aurora-A表达的子宫颈癌组织仍未检测到其表达.有75份(72.82%)组织表达p21,放射治疗后58份(56.31%)表达减弱,3份(2.91%)没有明显改变,14份(13.59%)表达增强,其余28份子宫颈癌组织(27.18%)放疗前后均未检测到p21表达.结论 放射治疗可使子宫颈癌组织中Aumra-A和p21基因表达呈现降低趋势.Aurora-A可能通过调节细胞周期及相关蛋白p21和c-myc等的功能,而与放射治疗效果存在一定联系.
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老年PAOD同型半胱氨酸代谢相关酶基因突变频率的研究
目的:探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T、胱硫醚β合成酶(CBS)基因844ins68、甲硫氨基合成酶(MS)基因A2756G三种同型半胱氨酸(Hcy)代谢相关酶基因突变在北京社区汉族老年周围动脉闭塞性疾病(PAOD)发病中的意义.方法:PCR扩增老年PAOD 83 例及 100 例老年健康对照的MTHFR、CBS、MS基因突变点,直接或经限制性内切酶消化后行凝胶电泳确定基因型. 结果:老年PAOD病例组MTHFR基因中,T/T基因型占34.9%,明显高于老年健康对照组的19%(P<0.01);C/C占13.3%,明显低于老年健康对照组的31%(P<0.01);C/T与老年健康对照组无明显差异(P>0.05).老年PAOD病例组MTHFR等位基因T突变位点的频率占60.8%,明显高于老年健康对照组的44%(P<0.01).CBS 844ins68、MS A2756G各种基因型频率和等位基因频率在老年PAOD病例组和老年健康对照组之间无差异. 结论:在北京社区汉族老年人群中,MTHFR等位基因C677T突变可能是老年PAOD独立的遗传性危险因子,而CBS基因844ins68、MS基因A2756G的突变可能不足以成为遗传危险性.
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Connexin43基因缺陷新生小鼠心脏组织病理学研究
目的观察不同程度Connexin43基因缺陷对新生小鼠心脏发育的影响.方法采用Cx43基因敲除(Cx43 KO)和CMV43CT两种Cx43基因缺陷的小鼠模型,聚合酶链反应鉴定基因型.然后将新生小鼠心脏分离固定,HE染色观察心脏的形态结构.普通C57BL6/SJ小鼠作为对照.结果所有11只纯合型Cx43 KO小鼠生后1 d内均死亡,心脏表现为严重右室流出道梗阻.在20只纯合型CMV43CT新生小鼠中,有12只生后2 d内死亡,其心脏不仅表现有右室流出道梗阻,还出现了房间隔缺损、室间隔缺损等其他心脏畸形;而另外8只未见心脏异常.所有杂合型Cx43 KO和CMV43CT基因缺陷的小鼠生后均存活,心脏病理学检测未见异常.结论 Cx43基因缺陷与心脏发育异常有密切的关系,但不同类型和不同程度的Cx43基因功能缺失对心脏发育的影响也不尽相同.
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线粒体DNA A1555G突变大规模筛查及其预防意义探讨
目的探讨在高危人群和特定人群中进行线粒体DNAA1555G突变基因筛查在预防药物性耳聋中的必要性.方法应用自主研制的线粒体DNA A1555G突变检测试剂盒对来自全国不同省市的1836例散发的非综合征性耳聋患者进行线粒体DNAA1555G突变基因筛查,筛出阳性个体,进一步了解阳性病例所有母系家庭成员状况,绘制详细家庭系谱图,对母系成员中未发病者进行防聋宣教.结果1836例中,63例存在线粒体DNAA1555G突变,突变率3.43%;在63个母系遗传家系中,8例失随访,3例不愿提供家系资料;52个有完整随访资料的家系中,存活母系家庭成员737人,耳聋发病201人(含先证者),未发病536人.结论在高危人群和特定人群中进行线粒体DNAA1555G突变基因筛查发现氨基糖甙类抗生素致聋敏感个体,进而对其未发病母系家庭成员进行防聋宣教是预防药物性耳聋、减少药物性耳聋发生率的有效措施.
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微囊化转Maspin基因细胞对乳腺癌微血管密度及肺转移影响的实验研究
目的 观察Maspin基因抑制肿瘤血管形成和肺转移的作用及微囊化转基因细胞体内治疗恶性肿瘤的可行性.方法 将乳腺癌细胞Bcap37细胞注射到裸鼠背部皮下,制成荷瘤裸鼠动物模型,再用微囊化转Maspin基因的中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO细胞)进行干预治疗,1个月后,测量移植肿瘤的大小,免疫组化法检测肿瘤组织的血管内皮生长因子(VEGF)表达,并据此计算微血管密度(MVD),同时观察肺转移的情况.结果 干预治疗1个月后,移植肿瘤的MVD明显降低[(26±9)与(60±16),P＜0.05],肺转移率也明显减低(55%与15%,P＜0.05).结论 Maspin可明显抑制肿瘤血管形成和肺转移的发生,微囊化转基因细胞体内治疗恶性肿瘤是可行的.
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myc拮抗基因Mad1、Mxi1和Rox在白血病细胞中的表达和突变
目的 分析Mad1、Mxi1和Rox基因突变在白血病发病中的作用.方法 利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、单链构象多态性(SSCP)分析及DNA序列分析技术检测了26例初治急性白血病(AL)患者、30名健康对照者和7种白血病细胞株中Mad1、Mxi1和Rox基因表达及突变情况.结果 RT-PCR检测结果显示所有标本中均可检测到Mad1、Mxi1和Rox基因的表达;SSCP分析结果显示所有标本中有4个位点发生多态性改变:Mad1中2个位点,Mxi1和Rox中各1个位点.DNA序列分析显示所有标本中有9个位点发生错义突变:Mad1中2个位点均发现于初治AL患者;Mxi1中4个位点,其中3个位点发现于初治AL患者,1个位点发现于KG1细胞株;Rox中3个位点均发现于初治AL患者.26例初治AL患者Mad1、Mxi1和Rox基因的突变发生分别为2例、3例和3例.结论 首次在AL患者细胞中发现Mad1、Mxi1和Rox基因突变,提示Mad1、Mxi1和Rox基因的突变可能与白血病的发病有关.
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海南省71例黎、汉族葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患者的基因突变型分析
目的 分析海南省29例汉族和42例黎族葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症患者的G6PD基因突变类型.方法 采用突变特异性扩增系统法筛查海南省人群中G6PD缺乏症的G1376T、G1388A和A95G三种常见突变位点;运用DNA测序技术鉴定未知突变标本G6PD基因外显子2至外显子13的基因突变类型.结果 在29例汉族G6PD缺乏症患者中,发现G1376T 11例(37.9%)、G1388A 2例(6.9%)、G1376T复合G1388A突变1例(3.4%)和G1376T复合A95G突变1例(3.4%),G1376T、G1388A、A95G三种常见突变及其复合突变共占汉族G6PD缺乏症患者的51.7%;在42例黎族G6PD缺乏症患者中,发现G1376T 25例(59.5%)、G1388A 6例(14.3%)、A95G 2例(4.8%)、G1376T复合G1388A突变4例(9.5%)和G1376T复合A95G突变1例(2.4%),G1376T、G1388A、A95G三种常见突变及其复合突变共占黎族G6PD缺乏症患者的90.5%;18例(汉族14例,黎族4例)未发现G1376T、G1388A、A95G.对这18例标本的测序发现:1例G6PD内含子5第636或637位核苷酸T缺失(IVS-5 636或637 T del)突变;2例C1311T复合IVS-11 T93C突变,其余标本未发现突变.结论 G1376T和G1388A是海南省人群中常见的基因突变型;在我国人群中存在IVS-5636或637 T del突变型;在海南省黎族人群中首次报道G1376T/A95G复合突变型.
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同型半胱氨酸及其代谢酶基因多态性与动脉粥样硬化
同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是一种含硫的氨基酸,它是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的一个重要中间产物.
关键词： 同型半胱氨酸 亚甲基四氢叶酸还原酶 基因转变 动脉粥样硬化 -
三种华法林基因预测模型与心脏瓣膜置换术后华法林剂量的相关性研究
目的 研究湖北地区汉族人细胞色素P450 (CYP) 2C9基因和维生素K环氧化物还原酶复合体1(VKORC1)基因型;评估3种不同华法林剂量预测模型与其剂量的相关性.方法 收集我院收治的心脏瓣膜置膜术后应用华法林的108例患者并获取华法林稳态剂量,采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测CYP2C9和VKORC1基因型.比较3种基因预测模型结果与实际华法林稳态剂量的相关性.结果 根据基因型判断的华法林用药剂量与稳态剂量相关性更大,同时预测模型3相关性略高于预测模型2.结论 在湖北地区汉族人群中,存在CYP2C9和VKORC1基因多态性,且不同基因型患者华法林用量存在差异,预测模型有助于预测华法林稳态剂量.
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CYP2C9基因突变与心脏瓣膜置换术后华法林初始剂量的相关性研究
目的 探讨心脏机械瓣膜置换术后服用华法林抗凝的初始剂量与细胞色素P450酶2C9(CYP2C9)基因突变的关系.方法 选择我院2012年3-8月行心脏机械瓣膜置换手术的108例,根据是否有CYP2C9基因突变分为突变组8例和无突变组100例,比较两组华法林初始累积剂量及国际标准化比值(INR)的变化.结果 两组华法林初始累积剂量比较差异无统计学意义(P＞0.05).术后患者在服用华法林第1～5天,突变组INR值均较无突变组升高(P＜0.05).结论 CYP2C9*3杂合突变对华法林服药初期INR值影响很大,有较大的出血风险,建议在用药之前做基因检测.
关键词： 心脏瓣膜假体植入 华法林 剂量 细胞色素P4502C9 基因转变 -
热休克蛋白70与妇产科疾病
热休克蛋白(Heat-shock protein ,HSP)普遍存于在生物细胞中,是一组具有重要生理功能、高度保守的蛋白质分子.应激状态下可被诱导表达,故又称应激蛋白.根据分子量大小可分为:HSP110、HSP70、HSP60、小分子2HSP及泛素等几个家族[1];其中HSP70在细胞生长、发育、分化、基因转变等方面发挥着重要作用.其生物学功能主要表现在应激状态下保护细胞生命活动、维持细胞的生存.HSP70与多种蛋白源形成复合体,并通过其结合和解离调节靶蛋白的活性与功能,但自身不参与靶蛋白的组成,又称伴侣蛋白.HSP70在一些增生性疾病中有过度表达,如肿瘤形成过程中,肿瘤细胞不断增殖,合成代谢增强,需要大量HSP70来调节和稳定这一异常增殖过程[2].正常细胞中,HSP70的表达也受细胞周期调控,而肿瘤细胞中突变或异常蛋白质的存在刺激了HSP70的合成,使其呈现持续的高诱导表达状态[3].本文主要综述HSP70在妇产科学特别是肿瘤方面的一些研究进展.
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乙型肝炎病毒前C区基因变异及与干扰素治疗的关系
目的探讨乙型肝炎病毒前C区基因变异对慢性乙型肝炎患者的影响及前C区基因变异与α-干扰素治疗的关系.方法采用多聚酶链反应银染技术检测32例HBV DNA阳性慢性乙型肝炎患者用干扰素治疗前后的HBV前C区基因变异.结果在治疗前有前C区突变株感染8例,突变株检出率为25%;在治疗后有前C区突变株感染9例,突变株检出率为28.1%.HBV DNA阴转17例,阴转率为53.1%.结论 HBV前C区基因变异不影响对干扰素的应答.
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原发性高血压遗传机制研究:全线粒体基因变异扫描分析
目的:扫描分析原发性高血压患者全线粒体基因变异,探讨其在高血压发病中的可能作用,为高血压的防治提供理论依据.方法:抽提原发性高血压患者和正常血压人群DNA各20例,用32对交叉重叠引物扩增全部线粒体基因,时相温度梯度变性凝胶电泳扫描基因变异,直接测序明确变异基因并进行两组间的比对分析.结果:原发性高血压患者与正常血压人群比较具有线粒体基因高变异频率(分别为27例次/例和20.3例次/例,t=2.05,P=0.047)、高变异密度(分别为3.28/100bp和2.46/100bp,t=2.05,P=0.047)的特点;高血压组D环区的变异密度及tRNA区的变异比例(24.87和10.56)明显高于正常血压组[19.07(t=2.633,P=0.012)和5.67(x2=6.54,P=0.009)].结论:原发性高血压患者具有线粒体基因高变异频率及高变异密度的特点,变异的基因可能通过影响线粒体氧化磷酸化功能而在高血压的发病中发挥一定的作用.
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儿童失神癫痫CACNA1H基因突变筛查和分析
目的:明确T型钙通道CACNA1H基因变异与儿童失神癫痫(CAE)的关系.方法:对100个中国汉族CAE核心家系CACNA1H基因的外显子6～12及其相邻的部分内含子进行PCR产物测序、基因突变筛查和分析.结果:仅在32例CAE患儿中发现14个序列变异,包括2个错义突变、3个同义突变和9个内含子变异,其中12个为新发现的变异.在191例性别匹配的正常对照中未发现这些变异.位于第11内含子的单核苷酸多态性(SNPs)位点52037C＞T在17例彼此无亲缘关系CAE患儿中出现,且在CAE核心家系中存在明显的传递不平衡(χ2=9.783,P=0.001 76).结论:CACNA1H基因可能是中国汉族CAE的重要易感基因.
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外源指导序列逆转临床大肠埃希菌耐药性研究
目的研究外源指导序列(EGS)体外逆转大肠埃希菌临床分离株耐氯霉素菌为敏感菌的能力.方法构建含EGScat1+2(二位点)并含四环素抗性基因的EGS重组质粒.常规CaCl2法将重组质粒导入临床分离对四环素敏感且耐氯霉素大肠埃希菌E4758菌株中,通过菌落PCR鉴定,并利用分光光度计A600检测阳性转化菌t-E4758在含不同浓度氯霉素LB液体及固体培养基中的生长情况.结果耐氯霉素的临床分离大肠埃希菌E4758菌株在浓度为35μg/ml,70 μg/ml,105μg/ml,170μg/ml的氯霉素LB培养皿中均生长良好,而导入EGScat1+2(二位点)的转化菌t-E4758在上述浓度时均不能生长,表明转化菌t-E4758恢复了对氯霉素的敏感性.结论EGS具有逆转临床耐药大肠埃希菌为敏感菌的能力.
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乙型肝炎病毒X基因转化人肝细胞QSG7701的体外观察
目的 观察HBV X基因多功能蛋白(HBx)的表达对QSG7701细胞生物学特征的影响及对其的转化作用.方法 采用脂质体法分别将重组质粒pCMV/X及真核表达质粒pRe/CMVZ稳定转染QSG7701细胞,分别获得pCMV X/QSG7701、pReCMV2/QSG7701,设未转染的QSG7701细胞为对照组.Western印迹检测细胞中HBx、c-Myc及Bel-2蛋白的表达,MTT比色法、流式细胞技术、软琼脂克隆形成率实验检测细胞的生物学活性.结果HBx高表达于pCMV X/QSG7701中.pCMV X/QSG7701中c-Mye蛋白的表达水平较其他两组高,Bcl-2蛋白在3组细胞中均有表达,但表达水平差异无统计学意义.在pCMV X/QSG7701、pRcCMV2/QSG7701及未转染的QSG7701 3组细胞中,pCMV X/QSG7701组s期细胞所占百分比较后两组明显增加[分别为(28.80±2.32)%、(15.50+2.64)%、(21.50±3.66)%,LSD 0.05=3.95%,LSD 0.01=5.47%,P<0.01],其G1期细胞所占百分比较后两组明显减少[分别为(62.30±3.85)%、(78.70±4.12)%、(78.105=4.45)%,LSD 0.05=5.63%,LSD 0.01-7.79%,P<0.01],其凋亡率明显高于后两组[分别为(14.90+11 01)%、(8.91±0.48)%、(4.03±0.47)%,LSD 0.05=0.94%,LSD 0.01=1.31%,P<0.01],其细胞株的倍增时间较后两组明显缩短(分别为14 h,29 h,38 h),其软琼脂克隆形成率明显高于后两组[分别为(19.83±1.96)%,(1.764±0.03)%,(1.33±0.18)%,LSD 0.05=1.53%,LSD 0.01=2.11%,P<0.01].结论 HBx能够在体外转化人源性非瘤性肝细胞QSG7701,使细胞具有恶性化生长的倾向.
