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单纯疱疹病毒Ⅱ型G蛋白免疫优势肽段在杆状病毒表达系统的表达及其反应原性
目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)糖蛋白G(gG-2)免疫优势片段gG321-580进行表达,纯化并评价其反应原性,以探索HSV-2免疫诊断试剂的研制.方法 提取HSV-2 DNA作为模板,PCR扩增gG321-580基因,克隆至pFastBac HTC载体中,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达His-gG321-580融合蛋白,SDS-PAGE和Western-blotting鉴定表达产物,NTA-Ni2+纯化后间接ELISA评价其反应原性.结果 HSV-2 gG321-580在昆虫细胞Sf9中得到特异性表达,纯化后的重组gG321-580蛋白对HSV-2阳性血清抗体有较好的抗原性和特异性.结论 gG321-580蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中成功表达,表达产物表现出良好的反应原性,为发展HSV-2免疫诊断试剂奠定了基础.
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单纯疱疹病毒1型特异性表位的串联表达及免疫性质的研究
目的: 串联重组表达单纯疱疹病毒1型(HSV-1)特异性表位,以获得具有抗原反应性能用于HSV-1鉴别诊断的抗原. 方法: 采用DNA重组技术将HSV-1特异性表位gG112-127进行串联,获得不同倍数重复串联的基因片段.将含有不同重复倍数的基因片段与表达载体连接,转化至宿主细胞JM109,异丙基-硫代-β-D-半乳糖苷诱导,SDS-PAGE分析其表达,Western 印迹分析其抗原反应性. 结果: 获得了4×、8×、16×、32×重复串联的阳性重组子.其中8×重组子在JM109细菌中得到了17.5%的表达,其表达产物主要以包涵体形式存在.Western 印迹显示此重组蛋白能与HSV-1抗血清发生抗原抗体反应,而不与HSV-2抗血清发生抗原抗体反应.结论: HSV-1-gG112-127重组蛋白可作为HSV-1特异性检测的抗原来鉴别诊断HSV-1和HSV-2的感染.
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2型单纯疱疹病毒糖蛋白G基因片段的表达及其抗原性分析
目的 获得单纯疱疹病毒2型(HSV-2)糖蛋白G(gG2)免疫优势片段gG321-580并初步研究其抗原性.方法 PCR扩增gG321-580基因,利用Bac-to-Bac表达系统表达gG321-580His融合蛋白,Western blot和间接ELISA鉴定蛋白活性.结果 在Sf9细胞中成功表达HSV-2 gG321-580His蛋白,gG321-580His能与小鼠抗HSV-2 gG2单抗结合,在60 KDa附近出现特异性结合条带,ELISA分析初步证实gG321-580His能够与HSV-2阳性血清反应,而不与HSV-1阳性血清和正常人血清反应.结论 gG321-580His蛋白获得成功表达,ELISA检测显示其具有良好的抗原性,为研究以gG321-580蛋白作为靶区域的HSV-2型特异性诊断试剂盒打下实验基础.
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伪狂犬病病毒糖蛋白G基因的结构分析及其原核表达
利用PCR技术扩增了伪狂犬病毒湖北株(PRV HB)糖蛋白G(gG)基因,进行了序列测定和分析.结果显示扩增和测序片段长1804bp,G+C含量68.78%.gG基因ORF长1500bp,编码500个氨基酸组成的多肽.与PRV Rice 株gG基因比较,两者核苷酸及推导的氨基酸序列同源性分别为98%、84.1%.320～380位之间的氨基酸序列存在较大差异.根据序列分析结果,选取gG基因长短不同的两个片段分别克隆到原核表达载体pET28a(+)进行表达.经SDS-PAGE和Dot-ELISA分析证实,表达出分子量大小分别约为55kD和63kD的特异性gG多肽,这为深入阐明PRV gG基因结构与功能及研制gG-ELISA诊断试剂盒奠定了基础.
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HSV-1重组糖蛋白G的表达、纯化及活性鉴定
目的 对构建的pGEX-4T- 1/gG-1重组质粒进行诱导表达,并纯化、鉴定表达的目的蛋白.方法 用佳诱导条件对重组质粒进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳检测验证后,对存在于超声离心后上清液中的融合蛋白用亲和层析技术进行纯化,并用ELISA间接法对纯化的GST/gG-1融合蛋白进行灵敏性和特异性等生物活性的初步鉴定.结果目的蛋白经诱导后表达于上清中,初步鉴定纯化的目的蛋白保留了天然蛋白原有的生物活性.结论 GST/gG-1融合蛋 白的获得,为研制以重组蛋白代替传统的全病毒作为检测抗原的新型HSV-1型特异性免疫学检测试剂盒奠定了基础.
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单纯疱疹病毒2型糖蛋白G的表达、纯化及鉴定
目的 对pGEX-4T- 1/gG-2重组质粒进行诱导表达,并纯化、鉴定表达的目的蛋白.方法 用佳诱导条件对重组质粒进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳检测验证后,对存在于超声离心上清液中的融合蛋白用亲和层析技术进行纯化,并用ELISA间接法对纯化的GST/gG-2融合蛋白的灵敏性和特异性等生物活性进行鉴定.结果 目的蛋白经诱导后表达于上清中,经鉴定纯化的目的蛋白保留了天然蛋白原有的生物活性.结论 GST/gG-2融合蛋白的获得,为研制以重组蛋白代替传统的全病毒作为检测抗原的新型HSV-2型特异性免疫学检测试剂盒奠定了基础.
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单纯疱疹病毒1型糖蛋白G表达载体的构建及鉴定
[目的]构建gG-1强抗原决定簇集中区对应基因的重组原核表达载体,并对其进行鉴定.[方法]利用DNAstar 软件分析gG-1强抗原决定簇的集中区,PCR 扩增相应基因片段,将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-4T-1/gG-1,并对其进行双酶切和 DNA 测序鉴定.[结果]成功构建了pGEX-4T-1/gG-1重组原核表达载体,且目的基因片段与GenBank中已公布序列一致性较高,阅读框架正确.[结论]pGEX-4T-1/gG-1重组原核表达载体的成功构建,为研制HSV-1型特异性基因工程诊断试剂奠定了基础.
