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戊二醛-癸甲溴铵复合消毒剂对伪狂犬病病毒的灭活作用研究
目的 研究戊二醛-癸甲溴铵复合消毒剂对伪狂犬病病毒(PRV)的灭活作用.方法 采用悬液定量方法和细胞培养法,观察戊二醛-癸甲溴铵复合消毒剂对伪狂犬病病毒灭活效果.结果 体外细胞消毒剂试验,中和产物对细胞生长繁殖无显著影响的消毒剂浓度为125 mg/L;消毒剂浓度为125 mg/L时,PRV(TCID50=10-8.1/0.1 ml)杀灭条件为室温30 min.结论 戊二醛-癸甲溴铵复合消毒剂对伪狂犬病病毒有很好的灭杀作用,选择有效的杀菌、杀毒剂量、作用时间是保证消毒效果的关键.
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从伪狂犬病病毒中删除Cre/LoxP介导的报告基因
根据pEGFP-C1序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出两端各含一个同向LoxP位点的GFP表达盒,克隆于转移载体pSKLR获得pSKLR-G-LoxP.通过经典同源重组方法,得到表达GFP的TK基因缺失伪狂犬病毒重组毒株S03109.该重组病毒在转染了pOG231(表达Cre重组酶)的293T细胞上连续传代,筛选得到重组病毒株S0419.荧光显微镜观察、Western blot及PCR检测结果表明,S03109感染细胞后持续表达GFP,而S0419不表达GFP.PCR 证实S0419为含单个LoxP位点的TK基因缺失病毒,并且在细胞培养上遗传稳定,测序结果(GenBank登录号AY822465)表明,在Cre重组酶的作用下,两个同向LoxP序列之间的GFP表达盒被正确除去.对BALB/c小鼠的半数致死量(LD50)及免疫保护实验结果表明,S03109和S0419对BALB/c小鼠的LD50值均大于3×105PFU,免疫BALB/c小鼠,攻毒后平均存活率分别为67.5%与70%.以上结果表明,利用Cre/LoxP位点特异性重组系统,成功去除了插入重组伪狂犬病病毒基因组中的GFP报告基因.
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伪狂犬病病毒湖北株糖蛋白gD基因的克隆及序列测定
伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)是多种家畜和野生动物发生伪狂犬病的病原体.该疾病对畜牧业,特别是对养猪业的危害较为严重,两周龄内仔猪致死率可高达100%,成年猪可发生呼吸系统感染症,康复猪可潜伏感染,终生带毒,给世界各国养猪业造成巨大经济损失[1].阐明PRV与宿主的相互关系,研制安全有效的PRV基因工程疫苗成为目前研究的热点.
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检测伪狂犬病的PCR方法的建立及其在临床诊断中的应用
根据文献,通过计算机分析设计并合成了1对用于扩增伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gB基因281bp片段的引物,上游引物(P1)位于gB基因的1827～1851位,下游引物(P2)位于gB基因的2083～2107位.以PRV闽A株细胞培养毒为模板,筛选佳反应条件和试剂工作浓度,建立了检测PRV的PCR方法.应用该方法对保存的16株伪狂犬病强弱毒株的细胞培养液进行基因扩增,均获得了281bp的特异性目的DNA片段.可是,对正常细胞与其它6种引起猪病毒性疫病相关病毒进行检测,结果均为阴性,没有出现交叉反应.对扩增产物测序,结果序列与文献报道一致,证明PCR扩增产物和方法的特异性.对PRV闽A株细胞毒提取物DNA进行检测,其低检出量为15.8pg.用病毒分离、双抗体夹心ELISA和PCR等3种方法检测1994～2000年期间送检的临床样品和保存的PRV毒种,对所获得的结果进行χ2分析,证明PCR检出率明显高于前2种方法.对1999～2001年期间广东、福建、海南等省的76个大中型猪场送检的348份病料进行检测,检出阳性病料68份,病料阳性率为19.54%;检出阳性猪场27个,猪场阳性率为35.53%.对27个阳性猪场分析发现,种猪场阳性率为7.41%(2/27),商品猪场阳性率为92.59%(25/27).PRV在自然发病猪体内分布较广,脑、肾、肺、脾、肝、淋巴结均有PRV的存在,PRV检出率高的组织为脑,其检出率为5/5,依次为肾12/15、肺9/16、脾10/20、肝7/18、淋巴结4/11等.实验结果表明,所建立的PCR技术可用于伪狂犬病的快速诊断和流行病学调查.
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伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区在大肠杆菌中的表达与gE乳胶凝集鉴别诊断方法的建立
将伪狂犬病病毒(PRV)Ea株gE基因主要抗原表位区段融合到原核表达载体pET28b的T7启动子下游,构建成原核表达质粒,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot印迹分析,证实gE基因主要抗原表位区在大肠杆菌中获得了表达,表达产物具有抗原性,分子量为38kD,位于包涵体中.包涵体经变性、复性处理,复性产物致敏乳胶,并对抗原致敏浓度、致敏时间、致敏温度进行优化,建立了gE乳胶凝集试验(gE-LAT).该方法不仅能显著区分gE基因缺失疫苗免疫猪血清和野毒感染猪血清,而且具有简便、快速等优点.检测临床360份猪血清,阳性率为57.78%(208/360),比国外阻断gE-ELISA的58.06%(209/360)略低,阳性符合率为94.86%(203/214),总符合率为96.94%(349/360),两种检测方法结果差异不显著(P＞0.05).
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伪狂犬病病毒Ea株诱导牛肾细胞凋亡及核基质蛋白的变化
目的研究伪狂犬病病毒(PrV)是否具有诱导组织培养细胞发生细胞凋亡的功能及探讨凋亡细胞核基质蛋白表达的变化.方法利用锥虫蓝(台盼蓝)染色绘制PrV在不同细胞上的增殖曲线;荧光染色观察凋亡细胞核的形态特征;琼脂糖凝胶电泳分析细胞染色体DNA的片段化;高分辨率双向电泳分析细胞凋亡前后核基质蛋白的表达差异. 结果膜通透性的DNA特异性结合染料Hoechst 33342染色显示,PrV感染后36 h,牛肾(MDBK)细胞核染色质开始固缩、凝聚,细胞核碎裂;DNA提取及琼脂糖凝胶电泳分析表明,细胞染色体DNA发生片段化,形成"DNA梯状"条带(DNA ladder);尽管PrV可以诱导MDBK细胞发生细胞凋亡,但不能诱导IBRS-2,BHK-21及PK-15细胞发生凋亡.MDBK细胞发生凋亡前后核基质蛋白的表达发生改变,存在表达上调、下调、诱导表达及表达遏制等情况.结论PrV诱导细胞发生细胞凋亡是其致细胞死亡的形式之一,间接反映了PrV与宿主细胞间复杂的相互作用.细胞凋亡前后核基质蛋白表达存在的差异说明PrV致MDBK细胞发生凋亡是自身基因产物或诱导或抑制宿主细胞基因表达的结果.
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人感染伪狂犬病病毒(猪疱疹病毒1型)研究进展
伪狂犬病病毒感染家猪后可引起死亡或影响其生长繁殖的急性传染病,对养猪业影响巨大.2018年以来,有研究者在基因水平上明确了人感染伪狂犬病病毒病例的存在,证明了该病毒对人类的致病性.本文将对已报道的人感染伪狂犬病病毒病例进行阐释、说明和归纳,并对其可能的致病机制进行介绍.
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狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定
目的:构建狂犬病病毒( Rabies virus,RV) SRV9株糖蛋白(Glycoprotein)基因的重组伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV),并进行鉴定.方法:将SRV9株糖蛋白基因表达盒和报告基因Lac Z表达盒克隆至转移载体p8AA中,构建转移质粒p8AA-LacZ-G,与PRV Bartha-K61株基因组共转染BHK-21细胞,待细胞发生病变后,收集病毒液,进行多轮蓝色噬斑筛选,获得重组病毒rPRV-LacZ-G,对其进行电镜观察、PCR及Western blot鉴定,并测定重组病毒的滴度.结果:酶切及测序鉴定证实,转移质粒p8AA-LacZ-G构建正确；电镜观察显示,重组病毒rPRV-LacZ-G呈典型的PRV特征结构；PCR分析显示可见RV 1 790 bp的特异性条带；Western blot显示,重组病毒可与SRV9株糖蛋白单抗发生反应,形成特异条带；经测定,重组病毒的滴度为106.25 TCID50/ml.较Bartha-K61亲本株的滴度(107 TCID50/ml)下降.结论:成功构建了RV SRV9株糖蛋白基凶重组PRV rPRV-LacZ-G,为其应用于兽用狂犬病疫苗的开发奠定了基础.
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pH值、辛酸钠浓度和灭活时间对病毒灭活效果的影响
目的 探讨pH值、辛酸钠浓度和灭活时间对辛酸钠用于人免疫球蛋白制品中加入的脂包膜指示病毒灭活效果的影响.方法 向不同pH值和不同辛酸钠浓度的人免疫球蛋白制品中加入指示病毒伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus,PRV),于30℃水浴条件下作用不同时间后,采用细胞病变法测定残余病毒滴度,对不出现病变的细胞盲传3代.探讨pH值、辛酸钠浓度和灭活时间对辛酸钠灭活PRV效果的影响.结果 在酸性pH值(4.6±0.2)条件下,当辛酸钠浓度在7～ 13 mmol/L时,均能在5 min以内灭活PRV≥7.00 LgTCID5o/0.1 ml.在中性pH值(7.4±0.2)条件下,13 mmol/L辛酸钠能瞬时灭活PRV≥7.00 LgTCID50/0.1 ml,而7、9和11 mmol/L浓度的辛酸钠能灭活PRV 2.8、0.43和3.2 LgTCID50/0.1 ml,均不能瞬时完全灭活病毒,但继续灭活至5 min,可灭活PRV≥7.00 LgTCID50/0.1 ml.灭活后不出现病变的细胞盲传3代未出现细胞病变.结论 辛酸钠可有效灭活加入人免疫球蛋白制品中的脂包膜指示病毒PRV;且酸性pH值条件下,辛酸钠的灭活效果优于pH值中性条件;辛酸钠对指示病毒的作用是灭活而非抑制.
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猪伪狂犬病病毒PCR检测方法的初步建立
目的 建立猪伪狂犬病病毒(PrV)的PCR检测方法 .方法 根据PrV gB基因序列,应用primer 5.0软件自行设计、合成一对引物进行PCR反应,优化反应条件,建立检测 PrV的PCR方法 ,并应用于临床样品的检测.结果 以PrV上海株细胞培养物DNA为模板,扩增出263 bp的特异性条带,对扩增产物进行克隆测序和BLAST在线比对,与 GenBank中PrV的gB序列一致.对临床样品进行PCR检测,与病毒分离结果 一致.结论 所建立的PCR方法 敏感、特异,可用于实验用猪伪狂犬病病毒的快速检测.
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猪伪狂犬病毒Jiangxi-FZ株的分离鉴定及其重要毒力基因分子特征
目的 研究伪狂犬病病毒(PRV)新流行毒株重要毒力基因的分子特征.方法 本研究从江西省某规模化猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织中分离到1株病毒,通过PCR鉴定、病毒分离培养、细胞免疫荧光及易感动物试验证实该病毒为PRV野毒株并命名为PRV Jiangxi-FZ株.并对其重要毒力基因TK、gB、gC、gD及gE的分子特征和遗传进化关系进行分析.结果 Jiangxi-FZ株与其他PRV参考毒株的TK、gB、gC、gD及gE基因在核苷酸和氨基酸水平均具有很高的保守性,尤其是与2012年分离的2株PRV变异株的同源性较高.但在高度保守的基础上,仍存在一些差异,且部分差异具有特征性.遗传进化树分析结果显示,PRV Jiangxi-FZ株与2012年国内不同省份分离的PRV变异株亲缘关系较近,而与Becker等欧美洲毒株亲缘关系相对较远.结论 Jiangxi-FZ株具有当前PRV流行毒株的代表性,属近年来流行的PRV变异毒株.
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猪流感诊断技术研究进展
猪流感(swine influenza,SI)是由猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)引起的猪的一种急性、热性和高度传染性呼吸道疾病,不仅引起病猪高热、食欲减退、咳嗽、流产及出栏时间延迟等,而且极易引起猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒、猪伪狂犬病病毒和传染性胸膜肺炎放线杆菌等病原的继发或混合感染[1],对养猪业危害极大.更重要的是,猪呼吸道上皮细胞表面同时存在人流感病毒受体SA-α-2,6Gal和禽流感病毒(AIV)受体SA- α-2,3Gal, 这样猪既可感染人流感病毒又可感染AIV,从而成为人-禽流感病毒重组的理想"混合器"[2].Ito等证实AIV连续在猪体内传代,可产生人流感病毒样特性[2].因此,关于流感病毒在猪群中流行状况的资料可对人群中新的流感毒株的监测提供重要的预警信息.
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伪狂犬病病毒ul24基因表达蛋白的胞内定位研究
根据GenBank已发表的PrV ul24基因序列(NC006151),设计并合成一对引物,PCR扩增出ul24基因编码区,克隆于pEGFP-N1载体,得到重组质粒pUL24-GFP.酶切鉴定,测序及Western Blot验证重组质粒.ul24基因序列测定结果已提交GenBank,登录号DQ226544.Western blot分析结果表明UL24-GFP融合蛋白为45KD.将pUL24-GFP转染真核细胞,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞内定位,结果表明UL24-GFP融合蛋白定位于细胞核.
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伪狂犬病病毒基因缺失疫苗制苗用毒种特性研究
本试验通过对PRV基因缺失株SA215(gE -/gI -/TK -)细胞培养特性、理化特性及形态发生过程进行研究,来确定gE、gI和TK基因缺失对病毒特性的影响.结果表明,基因缺失对该毒株在培养细胞的吸附和穿入过程没有影响,但与亲本株相比,表现为生长掩蔽期延长,增殖速度减缓,但能达到相似的增殖滴度,并且基因缺失对病毒的理化特性影响很小.形态发生过程观察结果表明,PRV SA215株在细胞培养上形态发生正常,能形成感染性病毒粒子,但在由核膜出芽和囊膜形成上受到一定程度的阻碍.本研究为疫苗研制和生产提供指导和依据.
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伪狂犬病病毒Ea株基因组UL区的克隆与序列分析
从伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA中扩增到3.76 kb的基因组片段,该片段包含UL31、UL32、UL33和UL34基因完整编码区,以及UL30和UL35基因部分序列.UL31、UL32、UL33和UL34基因G+C含量为69.5%~73.4%,偏向于使用富含GC特别是第三密码子位置上核苷酸是C或G的密码子,Ala、Leu、Arg的利用率高,占氨基酸残基总数的36.4%.PRV Ea株UL31和UL32基因与PRV Ka株核苷酸与氨基酸序列同源性都很高,在98%以上;而UL33和UL34基因与Ka株的氨基酸序列同源性较低,分别为95.7%和94.8%.UL31基因在疱疹病毒α-亚科所有成员之间都很保守,并且UL31基因与马疱疹病毒IV型同源程度高.UL32、UL33和UL34基因均与牛疱疹病毒I型同源程度高.UL31、UL32、UL33与UL34基因产物均有酪蛋白激酶2磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点,表明UL31、UL32、UL33、UL34蛋白质可能都是磷酸化蛋白质.
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伪狂犬病病毒糖蛋白G基因的结构分析及其原核表达
利用PCR技术扩增了伪狂犬病毒湖北株(PRV HB)糖蛋白G(gG)基因,进行了序列测定和分析.结果显示扩增和测序片段长1804bp,G+C含量68.78%.gG基因ORF长1500bp,编码500个氨基酸组成的多肽.与PRV Rice 株gG基因比较,两者核苷酸及推导的氨基酸序列同源性分别为98%、84.1%.320～380位之间的氨基酸序列存在较大差异.根据序列分析结果,选取gG基因长短不同的两个片段分别克隆到原核表达载体pET28a(+)进行表达.经SDS-PAGE和Dot-ELISA分析证实,表达出分子量大小分别约为55kD和63kD的特异性gG多肽,这为深入阐明PRV gG基因结构与功能及研制gG-ELISA诊断试剂盒奠定了基础.
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伪狂犬病病毒上海株gE和gI基因的克隆及缺失转移载体的构建
根据已发表的伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PRV)的gI和gE基因序列,设计两对引物用PCR方法扩增出PRV-SH gI和gE基因,将其克隆入pUC18载体中,获得了缺失部分gI基因的转移载体质粒,命名为pgEI.
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伪狂犬病病毒Ea株EP0基因的克隆序列分析及其在大肠杆菌中的表达
以伪狂犬病病毒Ea株（PRV-Ea）细胞感染物为模板，PCR 扩增出1.23?kb的EP0基因完整编码区片段，将该基因片段克隆到pBluescriptⅡsk+中并构建三个测序质粒，双脱氧末端终止法序列测定并同国外InFh株进行同源比较，发现PRV-Ea EP0基因存在多处点突变和一处缺失突变，但无插入突变和移码。进一步将该片段插入到原核表达载体pET-28a的His-Tag下游，构建的原核表达质粒pETEP0在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达，SDS-PAGE结果显示，表达的蛋白分子量为62?kD，并形成包涵体。Western印迹分析表明，该蛋白带能与Ea株野毒高免血清发生特异性反应，证实PRV-Ea EP0基因在BL21(DE3)中获得了正确表达，并且具有免疫学活性。为今后深入研究该基因的功能奠定了基础。
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伪狂犬病病毒Min-A株gE主要抗原表位基因的克隆与鉴定
目的:获得PRV gE主要抗原表位基因,构建PRV gE重组表达载体.方法:根据伪狂犬病病毒Min-A株gE基因序列,设计一对引物,采用PCR方法扩增PRV gE基因主要抗原表位区约642bp的片段,将产物克隆到PGEM-7Z载体中,测序正确后再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,提取质粒作限制性内切酶分析和序列测定.结果:限制性核酸内切酶酶切鉴定表明,扩增出了PRV gE主要抗原表位基因,测序结果经BLAST分析与GenBank中注册的序列完全一致.结论:成功克隆了PRV gE主要抗原表位基因的原核表达载体.
