首页 > 文献资料
-
从伪狂犬病病毒中删除Cre/LoxP介导的报告基因
根据pEGFP-C1序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出两端各含一个同向LoxP位点的GFP表达盒,克隆于转移载体pSKLR获得pSKLR-G-LoxP.通过经典同源重组方法,得到表达GFP的TK基因缺失伪狂犬病毒重组毒株S03109.该重组病毒在转染了pOG231(表达Cre重组酶)的293T细胞上连续传代,筛选得到重组病毒株S0419.荧光显微镜观察、Western blot及PCR检测结果表明,S03109感染细胞后持续表达GFP,而S0419不表达GFP.PCR 证实S0419为含单个LoxP位点的TK基因缺失病毒,并且在细胞培养上遗传稳定,测序结果(GenBank登录号AY822465)表明,在Cre重组酶的作用下,两个同向LoxP序列之间的GFP表达盒被正确除去.对BALB/c小鼠的半数致死量(LD50)及免疫保护实验结果表明,S03109和S0419对BALB/c小鼠的LD50值均大于3×105PFU,免疫BALB/c小鼠,攻毒后平均存活率分别为67.5%与70%.以上结果表明,利用Cre/LoxP位点特异性重组系统,成功去除了插入重组伪狂犬病病毒基因组中的GFP报告基因.
-
质粒载体系统介导的人肿瘤细胞RNA干扰作用
目的研究质粒载体介导的肿瘤细胞RNA干扰效果.方法构建以H1 RNA为启动子的针对GFP基因不同序列片段的RNAi质粒pLasRiGFP1/2/3.将其与pcdna3.1EGFP共转染HEK293、Hela和SPCA1细胞或单独转染SPCA1-GFP,用倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪分析GFP表达.结果 pLasRiGFP1、pLasRiGFP2和pLasRiGFP3在HEK293中对GFP表达的抑制率分别为97.5%、97%和89%,Hela细胞中为83%、90%和90%,SPCA1细胞中为65%、55%和40%.pLasRiGFP1与pLasRiGFP2在SPCA1-GFP细胞对GFP的抑制率分别为53%和58%.RNAi作用在48～96 h强,并随RNAi质粒增加抑制效果呈增强趋势,但到达一定量后作用趋势平缓.结论 H1 RNA为启动子的RNAi质粒能有效介导肿瘤细胞RNAi,其作用存在剂量和时间效应,受靶序列、细胞类型等因素的影响.
-
Ad-vcam-1-gfP重组腺病毒转染人脐血源基质细胞的实验研究
本研究探讨血管细胞黏附分子(vcam-1)修饰的人脐血源基质细胞(human umbilical cord blood derived strom cells,CBDSC)在造血调控中的作用.采用DNA重组技术,将目的基因vcam-1克隆至含有报告基因gfp的穿梭质粒;在BJ5183细胞中与pAdeasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体转染人脐血源基质细胞并进行鉴定.结果表明:vcam-1基因与pAdTrack-CMV载体成功连接,经Not Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切后电泳可见2个大小约为9kb和2 kb左右条带,经PCR法扩增后电泳可见1个600 bp左右条带,证明pAdTrack-CMV-vcam-1重组质粒构建成功.pAdTrack-CMV-vcam-1质粒与pAdeasy-1质粒同源重组后,产物经PAC Ⅰ酶切后电泳可观察到2个大小约为31 kb、4 kb左右条带,与预期结果相符.腺病毒载体转染人脐血源基质细胞后免疫化学、RT-PCR、荧光显微镜等方法均检测到目的基因vcam-1的表达.结论:构建ad-vcam-1-gfp重组腺病毒载体可成功转染人脐血源基质细胞并使其vcam-1表达增高.
-
以双质粒逆病毒载体系统快速建立梯度过表达hMTA1稳转单克隆细胞系的方法
目的 利用逆病毒表达载体快速构建梯度过表达人MTA1稳转单克隆细胞系.方法 利用噬菌斑原位杂交筛选人肺噬菌体文库,以阳性克隆为模板,RT-PCR获得人MTA1完整CDS序列.以逆病毒表达载体pMX为基础,经过多次酶切连接,构建逆病毒表达载体pMX-MTA1-flag-IRES-EGFP.将构建好的逆病毒载体系统,转染293-gag/pol细胞,包装出含该表达载体的逆病毒颗粒.以含病毒上清多次感染HCT116细胞,获得稳定转染MTA1的HCT116多克隆细胞系.将该多克隆细胞系按合适比例稀释后接种至10cm大皿,获得大量单克隆细胞系,以GFP为筛选标志,筛选不同荧光强度的单细胞克隆进行扩增并分析MTA1与GFP表达水平的线性关系.结果 测序结果显示成功克隆出人MTA1表达序列.免疫荧光、Western Blot结果证实成功构建出梯度过表达MTA1的稳转细胞系.相关性验证结果显示构建的非融合载体MTA1与GFP的表达呈明显的线性相关,相关系数r=0.932,P＜0.01.结论 利用逆病毒表达系统,快速成功构建并筛选出MTA1与GFP非融合梯度过表达稳转单克隆细胞系,为MTA1基因功能研究提供了良好模型.该逆转录病毒平台可用于快速建立其他基因的稳转单克隆细胞系.
-
鸡α-珠蛋白基因5′端MAR调控GFP基因在COS7细胞中表达的研究
目的 研究鸡α-珠蛋白基因5'端核基质结合区(matrix association region,MAR)的基因表达调控作用.方法 采用PCR方法扩增鸡α-珠蛋白基因5'端1 600 bp长度的MAR,并将该MAR连接在pCMV/GFP载体CMV启动子上游和GFP报告基因下游,构建含2个MAR的真核表达载体pGFP/2MAR.采用Lipofectimine脂质体介导法转染COS7细胞,用荧光显微镜和流式细胞术对荧光表达进行观察、定量.结果 荧光显微镜观察pGFP/2MAR在转染48 h后荧光表达量明显高于pCMV/GFP的荧光表达量;流式细胞仪分析表明,在COS7细胞中pCMV/GFP和pGFP/2MAR的荧光表达量分别为17.9%和33.6%.结论 该MAR确实能提高GFP在真核细胞中的表达量.
关键词： PCR 鸡α-珠蛋白基因5'端MAR pGFP/2MAR GFP 流式细胞仪 -
绿色荧光蛋白转基因小鼠模型的建立及胚胎冷冻保种
目的 建立绿色荧光蛋白转基因小鼠模型,并采取胚胎冷冻的方法进行保种.方法 通过原核显微注射法,把线性化、纯化后的外源基因pEGFP注射入BDF1小鼠受精卵中,胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠.经鉴定对有表达的转基因鼠进行胚胎冷冻保种.结果 移植注射胚胎385枚给30只假孕小鼠共出生了306只后代鼠,经PCR和southern blot检测得到5只阳性小鼠.F2代转基因鼠胚胎冷冻240枚胚胎.结论 通过显微注射法使外源基因pEGFP在小鼠基因组中得到整合,建立了转pEGFP的转基因小鼠模型.
-
真核表达载体pEGFP-N1-kin17的构建及其在Zmpste24-/-小鼠胚胎成纤维细胞内的表达
目的：构建人kin17基因真核表达载体pEGFP-N1-kin17，将载体转染至野生型及Zmpste24基因缺失的小鼠胚胎成纤维上皮细胞，荧光显微镜观察kin17蛋白表达情况。方法用高保真DNA 聚合酶，从pCMV-kin17载体中扩增获取人kin17 cDNA编码序列，将其克隆至pEGFP-N1载体中，经酶切、连接、转化后，挑取阳性克隆进行菌液进行PCR、菌液质粒双酶切及测序鉴定；将成功构建的GFP-kin17表达载体转染Zmpste24-/- MEFs，荧光显微镜观察kin17蛋白的核定位情况。结果 pEGFP-N1-kin17转化细菌克隆测序结果完全正确；将载体转入MEFs后，可以通过荧光显微镜观察到kin17蛋白的表达。结论成功构建GFP融合的kin17真核表达载体，该载体为kin17蛋白的研究提供工具。本实验中载体pEGFP-N1-kin17在野生型和Zmpste24-/- MEFs中均成功表达。
-
L-plastin启动子调控下的肿瘤细胞特异性表达载体的构建及活性分析
目的:构建肿瘤细胞特异性表达载体pcDNA3.1PLN-GFP及鉴定活性.方法:用2.4kb的L-plastin启动子,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告蛋白,通过分子克隆技术,构建真核表达载体pcDNA3.1PLN-GFP,用脂质体介导法转染肿瘤细胞和成纤维细胞后,流式细胞术(FACS)分析载体的肿瘤细胞特异性和活性.结果:仅在表达内源性L-plastin的肿瘤细胞和转化的293细胞中有GFP的表达,发光细胞比率较高,而且L-plastin启动子的活性与CMV启动子活性相当,而在其它细胞中没有检测到GFP的表达.结论:我们构建的pcDNA3.1PLN-GFP是一肿瘤特异性的高效表达载体.
关键词： 肿瘤特异性 L-plastin启动子 GFP 表达载体 -
绿色荧光蛋白体外转染兔骨髓基质干细胞
目的:观察以质粒为载体,经脂质体介导的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转染的骨髓间充质干细胞体外表达情况.方法:以质粒病毒为载体,PT 67细胞为包装细胞,介导绿色荧光蛋白转染新西兰大白兔,在相差显微镜和荧光显微镜下观察,流式细胞仪检测GFP的表达效率.结果:骨髓基质干细胞体外培养后贴壁、集落生长,连续传代培养生长良好.培养2 wk后骨髓基质干细胞表面CD 44抗原表达阳性.介导绿色荧光蛋白转染新西兰大白兔的骨髓基质干细胞,转染率可达30％左右.结论:骨髓基质干细胞容易获取、来源充足、可以大量扩增,可作为骨组织工程的种子细胞.GFP基因的导入不会影响骨髓间充质干细胞的活性和生物学特性.
-
乙醇和丙酮对绿色荧光蛋白强度作用的对比
Objective To find out a proper way to detect green fluorescent protein (GFP). Methods Kidneys, livers and femurs from GFP transgenic mice and C57BL/6J wild type mice were employed for in vivo study.The samples were dehydrated with alcohol and acetone individually before embedding, then frozen, paraffin and resin sections were made for the detection of GFP. C3 P12 cells which derived from calvaria bone cells of GFP transgenic mouse were used for the detection of GFP in vitro. Cells were exposed to alcohol, acetone and PBS after paraformaldehyde fixation. Laser scanning microscopy was employed for GFP detection. Results In frozen sections, both kidney and liver samples which exposed to 4% buffered paraformaldehyde fixation had strong GFP signals, while GFP signal disappeared completely in fresh frozen sections without fixation. Much stronger GFP intensity was found in acetone treated samples than in alcohol treated paraffin sections, but without apparent difference in GFP intensity in acetone and alcohol treated resin samples. Acetone and alcohol made no difference in fixed C3 cells in different time courses. Conclusion Acetone treated paraffin sections are preferable for GFP detection.
-
Mpl与绿色荧光蛋白融合基因的真核载体构建及表达
目的:探索Mpl与绿色荧光蛋白GFP基因共同转粢哺乳动物细胞NIH3T3的方法.方法:采用PCR方法将GFP基因与Mpl基因构建融合荧光蛋白的真核表达载体,用脂质体介导转染NIH3T3细胞和筛选稳定细胞系,使用荧光显微镜方法和Westernblotting检测转染效果.结果:利用PCR方法有效扩增了Mpl基因,构建了融合荧光蛋白的真核表达载体,序列分析表明所构建的含Mpl基因的质粒与设计相同,使用荧光显微镜方法和Western blotting检测Mpl融合绿色荧光蛋白表达载体成功转染NIH3T3细胞.结论:成功构建了Mpl荧光表达载体,融合基因可以在NIH3T3细胞中稳定表达,为进一步研究Mpl的生物学活性及其与hNUDC蛋白相互作用提供了重要的理论依据.
-
荧光蛋白在肿瘤示踪研究中的应用
1 荧光蛋白槪况目前在医学研究领域引用的荧光蛋白主要有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)与红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)两种.
-
同基因造血干细胞移植延长同种异体小鼠皮肤移植物存活时间的实验研究
为了研究同基因造血干细胞移植诱导器官移植免疫耐受的可行性.建立小鼠异基因皮肤移植模型,术后2周给予FK506腹腔注射,3周起行全身照射及同基因骨髓移植,观察记录小鼠和移植物存活情况,以流式细胞检测受体GFP嵌合表达,混合淋巴细胞反应、迟发型超敏反应检测诱导耐受的特异性和效能.实验组小鼠移植物存活时间达(29.14±4.92)d,显著长于对照组(P＜0.05);GFP在BMT后4周、6周嵌合程度达到82%、91%;实验组MLR、DTH结果与对照组差异显著,提示诱导耐受具有高度特异性和高效性.同基因造血干细胞移植联合免疫抑制剂治疗可以有效诱导小鼠皮肤移植的免疫耐受.
-
流式细胞术结合G418筛选重组质粒稳定转染细胞
目的:探索优化重组质粒转染细胞后的筛选方法,以得到高纯度U937转染细胞.方法:选择带Neoг及GFP基因的质粒pRNAT U6.1/Neo.根据流式细胞仪可分选GFP阳性细胞这一特点,在质粒转染细胞后比较单用G418筛选与合并使用流式细胞仪分选后的筛选效果.结果:单用G418筛选时高筛选效率为72.0%;合并使用G418及流式细胞仪分选后的筛选效率均在90.0%以上.结论:合并使用G418及流式细胞仪分选是一种高效的筛选方法.
-
腺相关病毒载体介导外源基因导入人外周血干细胞的研究
目的:观察腺相关病毒载体介导外源基因导人人外周血干细胞的转染效率及表达.方法:本文采用腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体介导的基因转移方法,将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因和人多药耐药基因(multi-drug resitance,MDR1)导人人外周造血干/祖细胞,并对转染效率和转基因造血细胞的耐药性进行了初步研究.结果:rAAV/GFP感染CD34阳性细胞后,在荧光显微镜下观察,约30%细胞中可见绿色荧光.将rAAV/MDRI重组病毒感染CD34阳性细胞,经PCR和MTT法证实,导人MDR1基因的CD34阳性细胞对秋水仙素的耐药性与未导人MDR1基因的细胞有明显差异.结论:腺相关病毒载体能有效地将外源基因导入外周血CD34阳性细胞,并可在其中有效地表达.
-
Zeocin和GFP双筛选标记重组痘苗病毒载体的构建
目的 为研究重组痘苗病毒通用载体,构建融合Zeocin和GFP双筛选标记质粒pCB-ZeoGFP.方法 质粒LeGo-G/Zeo含有Zeo-GFP融合基因片段,通过PCR反应、BamHI酶切后连接替换空白质粒pCB的筛选基因gpt,通过菌落PCR,酶切图谱分析及测序分析鉴定重组质粒,构建成功后将其与野生型痘苗病毒进行位点特异性同源重组,经Zeocin药物筛选2代后,用流式细胞仪观察重组痘苗病毒GFP表达.结果 经菌落PCR,1号、5号和10号菌落中扩增出426 bp 的目的条带,与预期的大小完全一致,经酶切分析和DNA测序进一步验证了重组质粒pCB-Zeo-GFP;该质粒与野生型痘苗病毒同源重组,得到了重组的痘苗病毒；Zeocin 筛选2代后,病毒上清感染细胞,流式细胞分析7.18％的细胞中有CFP的表达,而阴性对照仅有1.43％；Zeocin 药物筛选5代后,通过激光共聚焦可在80％以上的细胞中观察带GFP;提取的重组痘苗基因组DNA也扩增出预期大小目的条带.结论 含Zeocin和GFP双筛选标记的新型重组痘苗病毒不仅具有可观察性且具有药物抗性,非常容易进行筛选鉴定.
-
高滴度逆转录病毒法转染Raw264.7细胞
[目的]建立一种高效稳定转染Raw264.7细胞外源基因的方法.[方法]应用含绿色荧光蛋白(GFP)基因的逆转录病毒载体转染GP2-293细胞,收集GP2-293细胞产生的重组病毒,通过低温超高速离心制成含目的基因的病毒浓缩液,再感染Raw264.7细胞,观察GFP在Raw264.7细胞内的表达情况.[结果]GFP在Raw264.7细胞内有较强的表达.[结论]高滴度逆转录病毒转染法,能够快速、稳定地将外源基因转染至Raw264.7细胞.
关键词： RAW264.7细胞 GFP pVSV-G 病毒 转染 -
基于GFP观察鼠伤寒沙门氏菌HilD介导ssrAB表达的初探
目的 以绿色荧光蛋白(GFP)标记的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,S.Typhi)为研究对象,秀丽隐杆线虫为模式生物,初步探究体内环境下HilD对ssrAB表达的调控作用.方法 通过基因工程技术分别构建携带gfp基因的亲本株S.Typhi(ssrAB-gfp+ pc DNA3.1)、hilD基因缺失株S.Typhi(ΔhilD+ ssrAB-gfp+pc DNA3.1)和hilD基因回补株S.Typhi(△hilD+ ssrAB-gfp+pcDNA3.1-hilD)标记菌.利用荧光显微技术,观察3株标记菌在饲喂感染秀丽隐杆线虫体内外的GFP表达状况及其定殖分布,并通过ImegJ软件进行荧光强度的比较.结果 成功构建的3株标记菌在秀丽隐杆线虫体内外均呈现绿色荧光,荧光强度为S.Typhi(ssrAB-gfp+ pc DNA3.1)高于S.Typhi(ΔhilD+ ssrAB-gfp+pc DNA3.1-hilD)和S.Typhi (ΔhilD+ ssr AB-gfp+ pc DNA3.1),S.Typhi(ΔhilD+ ssrAB-gfp+ pc DNA3.1-hilD)高于S.Typhi(ΔhilD+ ssrAB-gfp+ pcDNA3.1);3株标记菌在线虫体内主要定殖分布于口咽部和肠道中,荧光强度为口咽部较肠道高.结论 GFP在鼠伤寒沙门氏菌中得到稳定表达,感染秀丽隐杆线虫后同样获得GFP的稳定表达,且在线虫的口咽部和肠道具有良好的定殖分布,首次初步证明体内环境下HilD介导ssrAB表达,但并非为单一的调控作用.
-
GFP-Rv2626c融合蛋白表达载体的构建及表达纯化
目的 构建含Rv2626c基因的原核表达载体,获得GFP-Rv2626c融合蛋白,为今后开发鉴别结核感染的血清学诊断试剂打下基础.方法 以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,经PCR法扩增得到Rv2626c基因DNA 片段.将扩增片段克隆到pGM-T载体中测序,并进一步将Rv2626c亚克隆到pET28a-GFP中,构建原核重组表达载体pET28a-GFP-Rv2626c.将pET28a-GFP-Rv2626c转化E.coli BL21(DE3),用IPTG 诱导目的 基因表达,经SDS-PAGE和Western-blot 分析和纯化该表达产物.结果 经核苷酸序列测定和酶切鉴定,成功构建了重组质粒pET28a-GFP-Rv2626c.用IPTG诱导该质粒转化的E.coli BL21后,获得分子量约46kD的GFP-Rv2626c融合蛋白.经Ni-NTA Agarose试剂盒进行蛋白纯化,获得纯化的GFP-Rv2626c融合蛋白.结论 成功制备出重组GFP-Rv2626c融合蛋白,为开发鉴别结核感染的血清学诊断试剂打下了基础.
-
利用GFP/A549建立人NSCLC裸鼠原位种植转移模型
目的:利用人肺腺癌细胞株GFP/A549建立非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)转移模型.方法:将表达GFP的质粒pRNAT-U6.1/Neo转染人肺腺癌细胞A549,G418筛选获得稳定表达GFP细胞,对比转染前后细胞的生长活性和成瘤性.将转染后细胞原位种植裸鼠预定标准处死.HE染色和免疫组化检测转移灶的位置和数目.利用KODAK IS2000MM系统检测肿瘤播散情况.结果:获得了稳定表达GFP的转染后细胞;细胞的体外和体内生长未受转染的影响.裸鼠原位种植GFP/A549,利用KODAK IS2000MM确认4只有肝转移,9只有脑转移.HE染色、免疫组化确认4只有肝转移,11只有脑转移,与KODAK IS2000MM检测结果对比差异无统计学意义(P＞0.05).结论:GFP标记人肺腺癌细胞A549原位种植法能更简便的建立NSCLC转移模型;KODAK IS2000MM能够非侵入性和无创性检测肿瘤转移.
