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煤烟提取物致癌作用机制的研究
目的从煤烟对细胞膜理化特性的影响,对DNA的损伤,诱导原癌基因表达方面研究其致癌作用机制.方法利用1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)和N-3芘-马来酰亚胺(N-3P-M)分别标记NIH3T3细胞膜脂和膜蛋白,不同剂量的煤烟作用后,通过其荧光偏振度的改变确定膜理化特性的变化;利用溴化乙锭(EB)作荧光探针,通过DNA-EB结合物荧光强度的变化确定基因组DNA损伤程度;利用地高辛标记的c-myc癌基因作探针,运用斑点杂交的方法,检测c-myc基因的表达情况.结果不同剂量的煤烟作用后,能够引起膜脂流动性升高,膜蛋白运动度无显著变化,能够引起DNA的断裂损伤及c-myc基因的高表达,且上述变化皆与剂量密切相关.结论煤烟的诱变性与其对细胞膜、DNA及原癌基因的表达的影响密切相关.
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四物汤及其单药对血虚证小鼠造血的改善作用及其机制初探
目的:研究四物汤及各单药对γ射线照射致血虚小鼠造血系统的影响,探讨四物汤补血作用的机理及配伍机制.方法:采用3.5Gy60Coγ射线全身一次照射制作小鼠血虚证模型,进行外周血象检测及造血祖细胞集落培养;MTT法检测四物汤及各单药诱生Peyer's Patch细胞、NIH3T3细胞上清的活性.结果:①血虚小鼠骨髓中的CFU-GM、BFU-E、CFU-E、CFU-mix较正常组明显减少,四物汤及各单药对模型组造血祖细胞集落增殖的作用强度不同,四物汤为明显.②四物汤及各单药能够诱导Peyer's Patch产生细胞因子刺激骨髓细胞的增殖.③四物汤、当归、白芍诱生NIH3T3细胞上清能显著促进NFS-60细胞的增殖.结论:四物汤及各单药对血虚小鼠造血系统的作用机制,可能通过刺激Peyer's Patch细胞、成纤维细胞或产生造血生长因子,或与造血因子协同作用,促进骨髓干祖细胞增殖分化来实现的;四物汤及各单药作用的靶点和强度不同,符合中药复方组方的规律.
关键词： 四物汤 补血 配伍机理 Peyer's Patch细胞 NIH3T3细胞 -
大蒜素对NIH3T3细胞增殖及胶原合成的影响
目的 研究大蒜素对NIH3T3细胞生长增殖和Ⅰ型胶原合成的影响,探讨其抗纤维化作用机理.方法 大蒜素加入NIH3T3细胞培养液,以丹参为对照药物,测定H3-thymidine DNA掺入量;碱消化法检测细胞培养液中羟脯氨酸含量,荧光免疫染色方法检测NIH3T3细胞Ⅰ型胶原蛋白的表达.结果 大蒜素在0.2-5 μg/mL剂量范围内剂量依赖的抑制NIH3T3细胞生长和增殖;药物作用后,细胞培养液中的羟脯氨酸含量减少,Ⅰ型胶原蛋白的表达减少.结论 大蒜素对NIH3T3细胞生长增殖有抑制作用,减少细胞胶原的合成,减少Ⅰ型胶原的表达,可能具有抗纤维化作用.
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互隔交链孢酚增加NIH3T3细胞中DNA聚合酶β表达
目的 研究互隔交链孢酚(AOH)对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中DNA聚合酶β(DNA PoLβ)表达的影响.方法 采用半定量RT-PCR、细胞免疫化学和Western blot方法检测细胞中DNA POLβ mRNA和蛋白的表达.结果 与对照组相比,AOH可以引起NIH3T3细胞中DNA POLβ基因的mRNA水平和蛋白水平表达增高(并呈一定的剂量效应关系)(P0.05).结论 AOH可以引起NIH3T3细胞中DNA POLβ基因表达增高,可能有助于细胞应对AOH引起的DNA损伤.
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两种不同培养体系培养人角朊细胞的特征
目的对比有饲养层的有血清培养体系(feeder layer,serum-containing medium,FSCM)和无血清培养体系(serum free medium, SFM)培养人角朊细胞(keratinocyte,KC)的特征.方法以两种不同培养体系培养人KC,比较24 h细胞贴壁数、完全汇合时间和终分化形式.结果 KC在两种不同培养体系中的形态、24 h细胞贴壁数和完全汇合时间无统计学差异.FSCM体系能促使角朊细胞发生终末分化;SFM体系内角朊细胞增殖较FSCM体系快,但未发生终末分化.结论有饲养层的有血清培养体系培养人角朊细胞形成复层膜片,适合临床应用;无血清培养体系培养人角朊细胞形成单层细胞,适合KC生物学性征的实验研究.
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白藜芦醇对NIH3T3细胞Shh信号通路的影响
目的 探讨白藜芦醇对NIH3T3细胞Shh信号通路的影响.方法 实验分为对照组和白藜芦醇组.白藜芦醇处理NIH3T3细胞24 h.CCK-8法测定细胞活力,免疫荧光法检测初级纤毛蛋白(Ac-tu)、Smo和Gli-1的表达,Western blotting法检测Shh、Ptc、Smo、Gli-1蛋白的表达.结果 1.0.5和1μmol/L白藜芦醇组(0.679±0.047,0.774±0.054)细胞活力分别较对照组(0.585±0.039)明显增强(P＜0.05),其中以1μmol/L白藜芦醇组强.之后随白藜芦醇浓度(10、20、40、80 μmol/L)的增高,细胞活力逐渐降低(0.428±0.043,0.395±0.031,0.373±0.017,0.361±0.016),且均较对照组明显减弱(P＜0.05),而0.1μmol/L(0.602 ±0.065)和5μmol/L组(0.556±0.041)细胞活力与对照组比较差异无显著性(P＞0.05).2.NIH3T3细胞表达Ac-tu、Shh、Ptc-1、Smo、Gli-1从蛋白,有l根初级纤毛,Smo和Gli-1蛋白位于细胞质.白藜芦醇处理24 h时,Gli-1从细胞质进入细胞核,Smo从细胞质进入初级纤毛,且Shh(0.756±0.659比0.441±0.769,P＜0.05)、Ptc-1(0.655±0.347比0.351±0.026,P ＜0.05)、Smo(0.779±0.064比0.451±0.035,P＜0.05)和Gli-1(0.856±0.044比0.560±0.058,P＜0.05)蛋白表达较对照组高.结论 白藜芦醇可能通过激活Shh信号通路增强NIH3T3细胞的活力.
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ERK1/2信号途径与弓形虫侵入细胞及胞内增殖关系的研究
目的:探讨阻断细胞外蛋白调节激酶(ERK1/2)信号途径对弓形虫速殖子侵入宿主细胞及在胞内增殖的影响.方法:姬氏染色法检测ERK1/2途径不同时间及不同剂量的抑制剂U0126或PD98059作用下宿主细胞感染弓形虫速殖子的百分率,根据细胞感染率和感染细胞内虫荷量分析ERK1/2途径抑制剂对速殖子在细胞中增殖的影响.结果:速殖子在细胞培养系统中以1、10和100/μmol/L U0126或PD98059作用3h、6h和9h后,前者细胞培养孔中的细胞感染率分别较对照组平均下降34.62%(P<0.01),53.55%(P<0.01)和67.76%(P<0.01),后者分别较对照组平均下降22.67%(P<0.01)、52.21%(P<0.01)和58.99%(P<0.01);感染细胞感染速殖子率与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论:阻断ERK1/2途径的不同信号位点对弓形虫速殖子侵入宿主细胞影响不同,ERKl/2途径在速殖子侵入宿主细胞起主要作用,但对侵入后的增殖无明显影响.
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RevTet-On系统调控血小板生成素基因表达的研究
本研究应用RevTet-On基因表达系统,通过四环素衍生物强力霉素(doxcycline,Dox)调控血小板生成素(TPO)基因在NIH3T3细胞中的表达.首先应用基因重组技术构建含TPO基因的重组质粒pRevTRE/TPO,然后将RevTet-On基因调控系统的pRevTet-On和pRevTRE/TPO分别转染PT67细胞,从而包装RevTet-On和RevTRE/TPO重组逆转录病毒,同时将此两种病毒感染NIH3T3细胞,建立整合入RevTet-On和RevTRE/TPO逆转录病毒的阳性细胞株(RevTet-On3T3/TPO).通过Dox调节TPO基因在此细胞株中表达,培养基中加入2 mg/L Dox或不加Dox,然后用RT-PCR,Western印迹和ELISA方法检测TPO基因表达情况.结果发现,RevTet-On3T3/TPO当培养基中不加Dox时用RT-PCR和Western印迹检测未见TPO表达,用ELISA检测表达TPO量低;在培养基中加入Dox时,RT-PCR和Western印迹检测可见TPO表达,且TPO表达量高,为不加Dox时的91倍.本实验表明,通过建立逆转录病毒整合的NIH3T3细胞株,利用四环素及其衍生物Dox调节TPO基因的表达,为TPO基因治疗的进行提供了有用的工具.
关键词： RevTet-On系统 血小板生成素 基因表达 NIH3T3细胞 -
慢病毒介导的人Bax基因和人肝细胞生长因子基因在小鼠胚胎成纤维细胞中的共表达
目的 构建绿色荧光蛋白标记的人Bax基因(hBax)和人肝细胞生长因子基因(hHGF)双基因共表达的重组慢病毒.证实已包装成功的慢病毒能感染正常细胞并表达目的 蛋白.方法 通过重叠PCR技术构建attB1-K-hBAX/T2A/eGFP/P2A/hHGF-attB2基因片段,利用gateway technology构建慢病毒载体质粒pLV.EX2d.null-EF1A>hBAX/T2A/eGFP/P2A/hHGF和阴性对照质粒pLV.EX2d.null-EF1A>eGFP并测序,上述两种质粒分别与辅助质粒共转染293FT细胞包装病毒,荧光显微镜检测病毒滴度.实验分为实验组(感染了共表达Bax和HGF的慢病毒)、阴性对照组(仅感染了表达绿色荧光的慢病毒)和空白组(未作任何处理的正常NIH3T3细胞)三组,RT-PCR和Western blot检测染毒后各组细胞Bax和HGF的表达.结果经鉴定慢病毒载体质粒构建正确,荧光显微镜检测hBax和hHGF共表达慢病毒滴度为7.8×107 TU/ml,仅表达绿色荧光蛋白的阴性病毒滴度为9×107 TU/ml.将包装成功的慢病毒感染NIH3T3细胞48 h后,RT-PCR和Western blot结果显示实验组与其他两组相比,Bax和HGF的表达明显上调(P<0.05).结论 标记增强型绿色荧光蛋白的表达hBax和hHGF双基因慢病毒构建成功并获得高滴度的病毒感染液.通过慢病毒感染途径成功将HGF和Bax基因导入NIH3T3细胞并表达蛋白,为进一步研究Bax和HGF双基因共表达的重组慢病毒对血管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的影响奠定了基础.
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骨形态发生蛋白4重组腺病毒的构建及其对NIH3T3细胞成骨分化作用的研究
目的:构建骨形态发生蛋白4(BMP4)重组腺病毒,探讨其对NIH3T3成纤维细胞向成骨方向分化的影响.方法:将BMP4基因克隆连接到载体pAdTrack-CMV中,在细菌BJ5183中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组,得到BMP4重组腺病毒基因组,通过转染HEK293细胞包装出重组腺病毒.利用BMP4重组腺病毒转染NIH3T3细胞,采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和western-blot检测BMP4在细胞中的mRNA和蛋白表达.Gomori改良钙钴法检测BMP4重组腺病毒转染后的NIH3T3细胞碱性磷酸酶表达;von kossa染色检测BMP4重组腺病毒转染后NIH3T3细胞的成骨分化情况.结果:获得了BMP4转移质粒pAdTrack-BMP4和BMP4重组腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒.BMP4在转染后的NIH3T3细胞中得到表达,表达的BMP4蛋白具有生物学活性.转染后的NIH3T3细胞碱性磷酸酶表达增加.BMP4促进了NIH3T3细胞向成骨方向分化,形成钙结节.结论:本实验成功构建了BMP4重组腺病毒;BMP4重组腺病毒可促进NIH3T3细胞向成骨方向分化.
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特异性抗肝癌单味中草药提取物的高通量筛选
目的：利用高通量筛选分析技术评价单味中草药提取物对肝癌细胞及成纤维细胞的作用，以期获得具有特异性抗肝癌作用的中草药提取物。方法将242种常用单味中草药分别应用石油醚、乙醇或水进行提取，共获得554个中草药提取物。采用MTT来评价提取物对人肝癌细胞Bel7402和小鼠成纤维细胞NIH3T3存活的作用。结果提取物对人肝癌细胞Bel7402及成纤维细胞NIH3T3生长抑制作用>50%的样品分别占总样品数的7.4%和14.8%，对2种细胞抑制率同时>50%的样品占总数的4.4%，对Bel7402抑制率为对NIH3T3抑制率2倍以上且对Bel7402抑制率>50%的样品占总样品数的1.6%。复筛结果显示，防己乙醇提取物（DF173）对肝癌细胞的细胞毒作用特异性较好，具有良好的量效关系。DF173对Bel7402细胞毒作用IC50为8.27 mg·L-1，对NIH3T3的细胞毒作用IC50为19.48 mg·L-1。结论肿瘤细胞联合正常成纤维细胞筛选评价中草药提取物特异性抗肿瘤作用，有利于发现高效、低毒抗肿瘤中草药提取物。
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氯化钆对PKC的激活可促进成纤维细胞NIH3T3的存活及细胞周期的推进
本研究以氯化钆为代表性含稀土元素的化合物,对其在小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中对蛋白激酶C家族蛋白的激活进行了研究.利用活细胞成像和共聚焦激光扫描技术可以观察到,在血清饥饿的条件下,50 μM的氯化钆可以通过增强细胞粘附和细胞骨架重组促进细胞存活.使用蛋白质印迹技术发现蛋白激酶C家族蛋白在氯化钆作用不同时间后可以发生磷酸化,表明蛋白激酶C被激活.此外,双吲哚马来酰亚胺(bisindolylmaleimide,一种PKCpan的抑制剂)可以有效降低PKCpan磷酸化的水平(βIISer660),同时也可以降低氯化钆引起的ERK的激活.以上结果表明,氯化钆激活的蛋白激酶C可以通过介导MAPK/ERK信号通路的激活,继而推动细胞周期和细胞存活.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3与端粒酶活性
目的研究丙型肝炎病毒非结构区3(HCV NS3)蛋白对端粒酶活性的影响,以探讨HCV NS3蛋白在HCV致癌中的作用.方法利用HCV NS3真核细胞表达质粒pRcHCNS3-5＇(表达HCV NS3 N端多肽)和pRcHCNS3-3＇(表达HCV NS3 C端多肽)转染NIH3T3细胞;采用S-P免疫组化方法检测转染的NIH3T3细胞中HCV NS3蛋白表达,并通过端粒酶活性原位检测法、TRAP-PCR和端粒酶PCR ELISA技术分别检测转染前后NIH3T3细胞端粒酶活性的变化.结果 HCV NS3表达质粒pRcHCNS3-5＇或pRcHCNS3-3＇转染的NIH3T3细胞均表达HCV NS3蛋白,HCV NS3蛋白阳性信号均位于细胞浆中,并以前者表达的阳性信号为强;质粒pRcHCNS3-5＇转染的NIH3T3细胞端粒酶活性强(P<0.01),质粒pRcHCNS3-3＇转染的细胞次之(P<0.05),空白质粒pRcCMV转染细胞和未转染NIH3T3细胞弱(P<0.05);HCV NS3蛋白的表达水平和端粒酶活性强度之间具有显著相关性(P<0.01);采用端粒酶活性原位检测方法和端粒酶PCR ELISA技术检测结果具有较好的一致性.结论 HCV NS3蛋白可能是通过内源性机制激活细胞端粒酶导致宿主细胞恶性转化; HCV NS3蛋白 N端多肽对宿主细胞端粒酶的激活作用强于C端多肽;进一步证实端粒酶活性原位检测法是一种适合于病理形态与功能研究的有效技术.
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正、反义基质金属蛋白酶组织抑制因子-1基因对小鼠成纤维细胞表达细胞外基质的影响
目的观察正、反义基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)基因对小鼠成纤维细胞生物学行为的影响.方法应用正、反义人金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)逆转录病毒表达载体转染NIH3T3细胞,观察其对NIH3T3细胞增殖的影响,Northern blot检测细胞Ⅳ胶原(α1)、MMP-2、MMP-9、TIMP-1 mRNA的表达,酶谱法分析细胞培养液中MMP-2、MMP-9的蛋白表达ELISA测定细胞培养液中FN、I、Ⅲ、Ⅳ型胶原的含量.结果正义转染组显示出促细胞生长作用(P＜0.01);反义转染组显示抑制细胞生长作用(P＜0.01);TIMP-1 mRNA在各组均有表达,反义转染组表达明显减弱.正义转染组细胞培养液中FN及I、Ⅲ、Ⅳ型胶原含量明显增高(P＜0.01),MMP-2,MMP-9含量降低;而反义转染组FN及I、Ⅲ、Ⅳ型胶原含量明显降低(P＜0.01),MMP-2,MMP-9含量增高.结论正义TIMP-1促进NIH3T3细胞的增殖,反义TIMP-1则抑制NIH3T3细胞的增殖;反义TIMP-1通过抑制细胞TIMP-1的表达而促进小鼠成纤维细胞的FN及I、Ⅲ、Ⅳ型胶原降解.
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金属硫蛋白与细胞耐寒力的关系
目的 观察不同金属硫蛋白(MT)表达的水平与细胞耐寒力的关系.方法 将质粒pBAcNeo-MTⅡA转染NIH3T3细胞,检测其在不同温度下的存活力.结果 各细胞克隆的存活力随着温度的下降而下降,如细胞克隆Sneo(相对荧光强度1.3%)0 ℃时的吸光度(A值)较37 ℃时下降了0.529,但MT表达上调可提高细胞对低温的耐受性,MT含量越高对低温的耐受性越大,细胞克隆SMT1(29.4%)0 ℃时的A值较细胞克隆Sneo高约0.160,二者在统计学上差异有显著意义.细胞形态学上也得到了充分证实.结论 MT表达上调对细胞耐寒力的提高有一定的积极作用.
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iASPP真核表达载体的构建及其对NIH3T3细胞增殖的影响
目的:构建iASPP真核表达载体,稳定转染小鼠成纤维细胞(NIH3T3)并检测其表达,观察其对NIH3T3细胞增殖的影响.方法:设计引物以源克隆PCMV-iASPP为模板PCR扩增其中的CDS区,亚克隆入FLAG-pcDNA3.0,将该重组质粒转化DH5α感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆,经酶切、测序鉴定后,用脂质体介导转染NIH3T3细胞,G418加压筛选28 d,RT-PCR、Western blotting检测基因、蛋白表达;MTT法观察细胞增殖能力.结果:重组质粒鉴定正确,筛选所得阳性克隆中可以检测到iASPP基因的转录和表达,且该iASPP阳性表达细胞株增殖能力明显增强.结论:成功构建iASPP真核表达载体并成功构建稳定表达iASPP的NIH3T3细胞株,证明该基因的稳定表达在体外能显著增强NIH3T3细胞增殖能力.
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镍冶炼烟尘处理的NIH3T3细胞对刀豆素A的凝集反应
为了检测镍冶炼烟尘处理的NIH3T3细胞的某些生物学特征，采用刀豆素A(Con A)凝集试验，分别用两份镍冶炼烟尘与小鼠NIH3T3细胞接触24小时，培养21天后观察与Con A的凝集反应。以N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)为阳性对 照，二氧化钛(TiO2)为阴性对照。结果表明，用镍冶炼烟尘和MNNG处理的细胞均与Con A发生了凝集，呈剂量-依赖关系。用TiO2处理的细胞凝集反应为阴性。镍冶炼烟尘处理的细胞与Con A发生凝集意味着该细胞的生物学特征发生了改变。这一变化提示两份受检样品可能存在致癌活性，应做进一步毒理学检测和评价。
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NIH3T3细胞核内过表达的M-CSF对细胞运动的影响
目的 构建M-CSF细胞核内定位表达载体pCMV/M-CSF,探讨核内M-CSF对NIH3T3细胞运动的影响.方法 采用PCR的方法扩增人M-CSF活性片段,将其插入核内真核表达载体pCMV/myc/nuc,构建重组体pCMV/M-CSF,经脂质体介导转染NIH3T3细胞,G418筛选后,用免疫细胞化学及Western blot鉴定其在真核细胞中的表达及定位分布,用细胞划痕实验测定M-CSF进入细胞核后对细胞运动能力的影响.结果 限制性双酶切及DNA测序分析结果显示插入pCMV/M-CSF的片段为1400bp左右,与预期M-CSF分子大小相当.Western blot结果显示转染pCMV/M-CSF的NIH3T3细胞能稳定表达M-CSF蛋白;免疫细胞化学结果显示表达的M-CSF定位于NIH3T3细胞核.细胞划痕实验显示转染pCMV/M-CSF的NIH3T3细胞有较强的运动能力.结论 成功构建M-CSF核内定位表达载体pCMV/M-CSF,核内M-CSF可加强NIH3T3细胞运动.
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核内M-CSF对NIH3T3细胞内微丝的影响
目的 建立M-CSF核内稳定表达的NIH3T3细胞系,探讨核内M-CSF对细胞骨架的影响.方法 经脂质体介导核内定位表达重组体pCMV/M-CSF转染NIH3T3细胞,G418筛选后,用Rt-PCR、免疫细胞化学鉴定其在真核细胞中的表达及定位分布,用考马斯亮蓝染色细胞微丝测定M-CSF进入细胞核后对细胞骨架的影响.结果 RT-PCR结果显示转染pCMV/M-CSF的NIH3T3细胞能稳定表达M-CSF mRNA;免疫细胞化学结果显示表达的M-CSF定位于NIH3T3细胞核.考马斯亮蓝染色结果显示转染pCMV/M-CSF的NIH3T3细胞内微丝数量减少,排列紊乱.结论 核内M-CSF可引起NIH3T3细胞内微丝数量减少,排列紊乱.
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β-catenin基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位
目的 构建β-eatenin真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 提取工具细胞NIH3T3的mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增β-catenin基因cDNA全长,并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中.进一步将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞NIH3T3细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.后利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-β-catenin在NIH3T3细胞内的定位.结果 β-catenin基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为2346 bp,并测序成功.Western blot检测到了GFP-β-catenin融合蛋白表达,分子量约为115kDa.pEGFP-p-catenin在工具细胞NIH3T3细胞中主要定位于细胞膜和细胞质.结论 成功构建了β-catenin基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-β-catenin蛋白在NIH3T3细胞中主要定位于细胞膜和细胞质.
关键词： β-catenin基因 质粒构建 NIH3T3细胞 基因表达与定位
