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NIH3T3细胞核内过表达的M-CSF对细胞运动的影响
目的 构建M-CSF细胞核内定位表达载体pCMV/M-CSF,探讨核内M-CSF对NIH3T3细胞运动的影响.方法 采用PCR的方法扩增人M-CSF活性片段,将其插入核内真核表达载体pCMV/myc/nuc,构建重组体pCMV/M-CSF,经脂质体介导转染NIH3T3细胞,G418筛选后,用免疫细胞化学及Western blot鉴定其在真核细胞中的表达及定位分布,用细胞划痕实验测定M-CSF进入细胞核后对细胞运动能力的影响.结果 限制性双酶切及DNA测序分析结果显示插入pCMV/M-CSF的片段为1400bp左右,与预期M-CSF分子大小相当.Western blot结果显示转染pCMV/M-CSF的NIH3T3细胞能稳定表达M-CSF蛋白;免疫细胞化学结果显示表达的M-CSF定位于NIH3T3细胞核.细胞划痕实验显示转染pCMV/M-CSF的NIH3T3细胞有较强的运动能力.结论 成功构建M-CSF核内定位表达载体pCMV/M-CSF,核内M-CSF可加强NIH3T3细胞运动.
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核内M-CSF对NIH3T3细胞内微丝的影响
目的 建立M-CSF核内稳定表达的NIH3T3细胞系,探讨核内M-CSF对细胞骨架的影响.方法 经脂质体介导核内定位表达重组体pCMV/M-CSF转染NIH3T3细胞,G418筛选后,用Rt-PCR、免疫细胞化学鉴定其在真核细胞中的表达及定位分布,用考马斯亮蓝染色细胞微丝测定M-CSF进入细胞核后对细胞骨架的影响.结果 RT-PCR结果显示转染pCMV/M-CSF的NIH3T3细胞能稳定表达M-CSF mRNA;免疫细胞化学结果显示表达的M-CSF定位于NIH3T3细胞核.考马斯亮蓝染色结果显示转染pCMV/M-CSF的NIH3T3细胞内微丝数量减少,排列紊乱.结论 核内M-CSF可引起NIH3T3细胞内微丝数量减少,排列紊乱.
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碳酸化羟基磷灰石支架及其细胞因子复合物修复鼠胫骨缺损的实验研究
目的：通过动物实验检测碳酸化羟基磷灰石支架材料（carbonated hydroxyapatite，CAP）的骨传导性和生物吸收性。并探讨骨形成蛋白-2（rhBMP-2）、重组人巨噬细胞集落刺激因子（rhM-CSF）对CAP成骨特性和生物吸收的影响。方法：选取45只雄性SD大鼠，制备双侧胫骨临界性骨缺损模型，以复合骨形成蛋白-2（rhBMP-2）的碳酸化羟基磷灰石支架材料、复合重组人巨噬细胞集落刺激因子（rhM-CSF）的碳酸化羟基磷灰石支架材料、单纯的碳酸化羟基磷灰石支架材料作为实验组，羟基磷灰石（hydroxyapatite，HAP）作为对照组，植入大鼠胫骨缺损处，并设立空白对照组。术后2、4和8周，通过组织学观察对比新骨形成和材料吸收降解情况。结果：实验组和对照组材料均能完全充填骨缺损，材料界面与骨组织结合紧密，显示了良好的生物相容性和成骨性能。随着植入时间的延长，实验组材料可逐渐降解并被新生骨爬行替代，而对照组未见显著降解和新生骨替代。rhM-CSF能够促进碳酸化羟基磷灰石材料的降解，与CAP组、CAP/rhBMP-2复合物组比较，差异有统计学意义。结论：CAP具有出色的骨传导性和生物吸收性，是一种良好的骨再生移植物。且该支架材料的成骨性和生物降解能够被成骨及破骨细胞因子所调控。
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局麻和全麻对病人血清IL-6、IL-8和M-CSF水平影响的初步探讨
目的:探讨了局麻和全身麻醉对手术病人血清IL-6、IL-8和M-CSF水平的影响.方法:根据不同的麻醉方法将68例胃部手术病人分为硬膜外麻醉组(A组)和静吸复合全麻组(B组),每组34例.在麻醉诱导前、手术切皮和手术开始后1h抽取静脉血3ml,分别测定血清IL-6、IL-8和M-CSF浓度.结果:A组血清IL-6、IL-8和M-CSF含量在切皮和术中1h与术前比较有显著性差异(P＜0.05);B组血清IL-6、IL-8和M-CSF含量无显著性差异(P＞0.05);在切皮和术中1h,B组IL-6、IL-8和M-CSF含量比A组含量低(P＜0.05).结论:静吸复合麻醉能明显降低IL-6、IL-8和M-CSF浓度,有一定的临床实用价值.
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巨噬细胞集落刺激因子对破骨细胞生物作用的实验研究
目的探讨在实验条件下巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)在骨代谢过程中对破骨细胞的生物作用.方法用不同浓度的M-CSF和活化核因子κB的受体配体(RANKL)与鼠骨髓细胞培养,在加入或不加入牛骨片的情况下诱导产生破骨细胞.分别用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法和骨小坑染色法检测TRAP阳性的破骨细胞量及破骨细胞功能.结果在一定范围内,M-CSF在RANKL存在的条件下诱导TRAP阳性破骨细胞成熟,并随M-CSF剂量的增加TRAP阳性细胞数明显增加(r=0.7504,P＜0.01);且骨小坑数量也与M-CSF剂量呈明显正相关(r=0.9365,P≤0.0001).缺乏M-CSF或RANKL均不能诱导TRAP阳性的破骨细胞产生(P=0.0191).结论破骨细胞的增殖、分化及成熟是由M-CSF和RANKL共同调节的.M-CSF是破骨细胞代谢过程中的关键因子,具有促进破骨细胞对骨吸收的作用.M-CSF对骨代谢的主要作用之一是上调破骨系统.
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巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)融合EGFP真核表达载体的构建及表达
目的构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF,并鉴定其在小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞能否正确表达.方法PCR扩增M-CSF基因,定向克隆入带有EGFP报告基因的真核表达载体,构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF,脂质体介导将pEGFP-M-CSF转染入NIH3T3细胞,以一步法RT-PCR检测其在NIH3T3细胞中的表达情况.结果双酶切及测序鉴定证明成功构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF,并在NIH3T3细胞中成功地表达了融合荧光蛋白,RT-PCR检测结果显示RT-PCR扩增产物与M-CSF目的基因片段大小相符,确实源于重组质粒转录后的mRNA.结论真核表达重组体pEGFP-M-CSF的成功构建及在体外真核细胞中有效表达,为进一步研究M-CSF在真核细胞中的信号调控奠定了一定的实验基础.
