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PERK-eIF2α-ATF4信号通路参与调控磷酸三钙磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解
目的 探讨蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)-真核细胞起始因子2α(eIF2α)-活化转录因子4(ATF4)介导的内质网应激通路在磷酸三钙(TCP)磨损颗粒诱导假体周围骨溶解中的作用.方法 取雄性ICR小鼠30只,随机分为3组:假手术组(sham,n=10)、TCP磨损颗粒组(模型组,n=10)和salubrinal干预组(SAL,n=10).采用TCP磨损颗粒诱导小鼠颅骨溶解模型,于术后第2天颅顶局部注射SAL(1 mg/kg),每隔2d1次,持续干预2周.实验结束后处死动物取颅骨和外周血.Western blotting法检测TCP磨损颗粒植入部位周围骨组织中内质网应激分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)表达水平及PERK-eIF2α-ATF4信号通路的活化情况;HE染色和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察SAL对假体周围骨溶解和破骨细胞形成的影响;Real-time PCR检测SAL对破骨细胞活化相关基因抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和c-fos的mRNA水平;ELISA法检测SAL对血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和前列腺素E2(PGE2)水平的影响.结果 TCP磨损颗粒可诱导假体周围骨组织发生内质网应激反应,同时激活PERK-eIF2α-ATF4信号通路,表现为TCP磨损颗粒组小鼠颅骨组织中内质网应激通路蛋白GRP78、CHOP和磷酸化PERK(p-PERK)、磷酸化eIF2α(p-eIF2α)和ATF4蛋白表达均显著上调,而PERK和eIF2α蛋白明显下调(P＜0.05);而颅顶局部注射eIF2α特异性抑制剂SAL可明显阻止TCP磨损颗粒诱导假体周围破骨细胞形成和骨溶解,减少TRAP、MMP-9和cathepsin K的mRNA水平(P＜0.05);同时抑制TNF-α、PGE2和IL4β等炎症因子的产生(P＜0.05).结论 PERK-eIF2α-ATF4介导的内质网应激通路参与调控TCP磨损颗粒诱导的小鼠颅骨溶解;抑制该信号通路可减轻TCP磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解和关节松动.
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破骨细胞骨吸收上清液对成骨活动影响的实验研究
目的 研究破骨细胞骨吸收活动中的分泌产物对成骨细胞增殖、分化及成骨功能的影响,以了解活化的破骨细胞在体外对成骨细胞的影响.方法 诱导小鼠RAW264.7细胞为破骨细胞,用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色和破骨细胞特异性基因检测鉴定.破骨细胞与牛骨磨片共培养,甲苯胺蓝染色.收集共培养上清液作用于小鼠MC3T3-E1细胞,用甲基噻唑基四唑法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法、酶联免疫吸附测定法、茜素红染色及反转录聚合酶链反应检测细胞的增殖、骨钙素水平、矿化及成骨特征基因的表达.结果 TRAP 染色、破骨细胞特异性基因检测及甲苯胺蓝染色表明RAW264.7细胞可分化为具有骨吸收能力的破骨细胞；破骨细胞骨吸收上清液作用后,MC3T3-E1细胞增殖受抑制(A值在0.062±0.004和0.405±0.033之间,P＜0.05)；骨钙素水平增高[第10天上清液组的骨钙素质量浓度为(2.965±0.047) μg/L],钙化结节增多,碱性磷酸酶和Runt相关转录因子2的转录增强.结论 RAW264.7破骨细胞骨吸收上清液具有抑制成骨样细胞增殖、促进分化和钙化成骨的作用.
关键词： 破骨细胞 成骨细胞 骨钙素 抗酒石酸酸性磷酸酶染色 -
小白菊内酯对核因子κB受体活化因子配体诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响
目的：研究小白菊内酯对NF-κB受体活化因子配体（RANKL）诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响。方法以 RANKL 单独诱导小鼠单核巨噬细胞 RAW264.7细胞为对照组，分别采用不同浓度（0.5、1、2μmol/L）小白菊内酯联合RANKL诱导RAW264.7细胞分化培养。第3、5、7天采用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色法检测破骨细胞样细胞并计数； ELISA法检测第7天各组培养液上清中抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRAP5b）含量；实时（RT）-PCR检测第7天各组破骨细胞标志基因降钙素受体（CTR）和MMP-9的表达。使用SPSS 17.0统计学软件进行方差分析和t检验以比较组间差异。结果不同的培养条件下RANKL均能诱导RAW264.7细胞分化为成熟的破骨细胞。与同期对照组比较，诱导第3、5、7天，小白菊内酯各组破骨细胞数均明显减少；随小白菊内酯浓度的增大而破骨细胞数减少幅度更显著，0.5、1、2μmol/L各组第7天破骨细胞数较对照组分别下降为36.3%、40.8%、49.3%，细胞数差异有统计学意义（t=7.758，8.742，10.56；P<0.05）。各组第7天培养液中TRAP5b含量变化与细胞计数结果相符（P<0.05）。 TRAP阳性破骨细胞的CTR、MMP-9表达量随着小白菊内酯浓度增加而减少，2μmol/L小白菊内酯组低，与对照组比较小白菊内酯0.5、1、2μmol/L各组差异均有统计学意义（P<0.05）。结论小白菊内酯对RANKL诱导下RAW264.7细胞向破骨细胞的分化具有抑制作用，且抑制作用具有剂量依赖性。
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抗RANKL多克隆抗体抑制T细胞介导的破骨细胞形成的体外研究
目的:探讨抗核因子-KB受体活化冈子配体(RANKL)多克隆抗体对T细胞介导的破骨细胞形成的影响.方法:制备兔抗鼠RANKL多克隆抗体,使用不同浓度的抗体(1、5及10μg/mL),观察小鼠重组RANKL诱导的破骨细胞形成,显微镜下计数抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性多核细胞数/孔;体外分离、纯化、扩增大鼠的颈T淋巴细胞,给予不同浓度的兔抗鼠RANKI.特异性抗体进行干预,取其上清和T细胞,分别与RAW 264.7细胞共同培养,TRAP法测定T细胞介导的破骨细胞形成,显微镜下计数TRAP(+)多核细胞数/孔:ELISA测定细胞上清中的可溶性RANKL浓度(sRANKL,pg/mL).实验结果采用SPSS 11.5软件包进行统计学分析.结果:兔抗鼠RANKI,抗体既可减少RANKL诱导的TRAP(+)多核细胞数,也可减少T细胞介导的TRAP(+)多核细胞数,5μg/mL及10μg/mL抗体组差异显著(P<0.05),且呈浓度依赖性;上清中检出 sRANKL的浓度与不加抗体对照组相比明显降低,具有统计学意义(P<0.05).结论:抗RANKL特异性抗体可通过减少sRANKL的表达水平,直接阻断RANKL与核因子-KB受体活化因子(RANK)的结合,降低T细胞介导的破骨样细胞吸收.
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巨噬细胞集落刺激因子对破骨细胞生物作用的实验研究
目的探讨在实验条件下巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)在骨代谢过程中对破骨细胞的生物作用.方法用不同浓度的M-CSF和活化核因子κB的受体配体(RANKL)与鼠骨髓细胞培养,在加入或不加入牛骨片的情况下诱导产生破骨细胞.分别用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法和骨小坑染色法检测TRAP阳性的破骨细胞量及破骨细胞功能.结果在一定范围内,M-CSF在RANKL存在的条件下诱导TRAP阳性破骨细胞成熟,并随M-CSF剂量的增加TRAP阳性细胞数明显增加(r=0.7504,P＜0.01);且骨小坑数量也与M-CSF剂量呈明显正相关(r=0.9365,P≤0.0001).缺乏M-CSF或RANKL均不能诱导TRAP阳性的破骨细胞产生(P=0.0191).结论破骨细胞的增殖、分化及成熟是由M-CSF和RANKL共同调节的.M-CSF是破骨细胞代谢过程中的关键因子,具有促进破骨细胞对骨吸收的作用.M-CSF对骨代谢的主要作用之一是上调破骨系统.
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氨基多糖对RANKL诱导的RAW264.7向破骨细胞样细胞分化的抑制作用观察
目的 探讨氨基多糖(GAGs)对核因子KB受体活化因子配体(RANKL)诱导的RAW264.7向破骨细胞分化的影响.方法 采用RANKL单独诱导RAW264.7细胞(对照组),分别采用不同浓度肝素、高分子量透明质酸(HA)、硫酸软骨素(CS)C联合RANKL诱导RAW264.7分化(分别为肝素组、HA组、CSC组).细胞培养第3、5、7、8天采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色法(TRAP)检测破骨细胞样细胞并计数；ELISA法检测第8天各组培养液上清中抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b)含量.结果 与对照组比较,诱导第3、5、7、8天,破骨样细胞数均明显减少(P＜0.05)；其中肝素组随浓度的增大而减少(P＜0.05).第8天培养液中TRAP5b含量与细胞计数结果相符.结论 氨基多糖对RANKL诱导下RAW264.7向破骨细胞样细胞的分化具有抑制作用；肝素的作用具有剂量依赖性.
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CaMKⅡγ在破骨细胞分化中的表达规律
目的:研究钙离子/钙调蛋白依赖性激酶γ(CaMKⅡγ)在破骨细胞分化中的表达规律,以揭示其作用.方法:用50 ng/mL核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化,于诱导后第0,1,3,5天收获细胞,用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色评价破骨细胞生成情况,并用RT-PCR、Western印迹、免疫荧光细胞化学法检测CaMKⅡγ mRNA和蛋白表达.结果:多核破骨细胞在诱导后第3天开始出现,第5天达到多.分化第0,1,3,5天,CaMKⅡγ mRNA相对表达水平分别为(1.067±0.179),(1.840±0.070),(9.493±0.453)和(30.767±0.573);蛋白相对表达水平分别为(0.454±0.065),(0.613±0.021),(0.858±0.019)和(0.980±0.023);除第1天的蛋白相对水平外,其他时间点CaMKⅡγ mRNA和蛋白表达差异均有统计学意义,且呈时间依赖性增强(P＜0.01).免疫荧光细胞化学法检测也显示CaMKⅡγ蛋白表达在破骨细胞分化过程中逐步增加.结论:CaMKⅡγ表达随破骨细胞分化呈时间依赖性增加,提示其在破骨细胞分化中可能发挥关键调控作用.
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失神经支配对牙周组织中P物质及破骨细胞的影响
目的：探讨切断大鼠下牙槽神经后，牙周组织中P物质的表达变化及其对破骨细胞的影响。方法将30只雄性Wistar大鼠随机分为6组，每组5只，分为正常组（0d）和术后第3、7、14、21、28天组。在下颌孔处切断大鼠左侧下牙槽神经，分别在相应的观测时点取材，常规制备大鼠牙周组织石蜡切片，行免疫组织化学染色观察P物质的表达情况，同时行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色观察破骨细胞的分布，并对免疫组织化学染色的平均光密度值和破骨细胞计数进行统计分析。结果切断大鼠下牙槽神经后牙周组织中的P物质在第3天表现出明显的下降趋势，第7天达到低值，第21天恢复到正常水平；破骨细胞的变化趋势与P物质的变化具有一致性。结论切断大鼠下牙槽神经后，牙周组织中P物质与破骨细胞的变化呈正相关。P物质可能具有刺激并调节破骨细胞分化的作用，参与牙槽骨的代谢。
关键词： P物质 破骨细胞 抗酒石酸酸性磷酸酶染色 免疫组织化学 牙周组织
