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柚皮苷抑制小鼠气囊模型中PMMA颗粒诱导的骨溶解
目的:采用小鼠气囊模型评价柚皮苷对聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethylmethacrylate,PMMA)诱发的破骨细胞性骨溶解的作用.方法:选取48只雌性8～10周龄Balb/c小鼠纳入研究,采用背部注入空气法在其中的32只小鼠中建立气囊模型,植入同种系小鼠颅骨(颅骨源自其余的16只小鼠).实验共分为4组(150 mg/kg柚皮苷治疗组、30 mg/kg柚皮苷治疗组、PBS空白对照组、DMSO载体对照组),每组8只动物.对两个柚皮苷治疗组和DMSO载体对照组的小鼠使用PMMA颗粒刺激,每组8只相应浓度进行处理,颗粒刺激第7天收集囊膜和囊内植入骨进行抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色、Ca2+释放以及改良Masson染色病理分析进行评价,观察柚皮苷的治疗作用.结果:与DMSO载体组相比,柚皮苷治疗组降低了TRAP阳性细胞浸润的数量,差异有统计学意义(P＜0.01);其中150 mg/kg浓度优于30 mg/kg浓度(8.90±1.75 vs 15.23±1.86).在气囊模型骨吸收冲洗液中,柚皮苷能降低钙的释放,特别是150 mg/kg浓度组更为明显(P＜0.05).改良的Masson染色显示柚皮苷可减少PMMA刺激所致的骨胶原的丢失,但150 mg/kg浓度组作用大于30 mg/kg浓度组.大体及病理切片显示两种浓度的柚皮苷显著降低PMMA刺激所致的炎性反应,表现为气囊厚度的减低和炎性细胞浸润数量的减少.结论:柚皮苷抑制PMMA诱导的破骨细胞形成,有效缓解PMMA诱发的炎性反应以及随后发生的急性骨吸收.
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柚皮苷抑制PMMA颗粒诱导的破骨细胞形成及骨溶解
目的 从体外和体内实验2个方面评价柚皮苷对聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)诱发的破骨细胞性骨溶解的作用.方法 培养破骨细胞前体细胞RAW264.7,使用PMMA颗粒刺激细胞,观察柚皮苷的治疗作用.检测抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、Ca2+释放实验以及TRAP、组织蛋白酶(CPK)、NF-κB的基因表达.采用小鼠膝关节置钉模型评价柚皮苷对PMMA诱发骨吸收的作用,对实验标本采用生物力学拔出试验进行评价.结果 柚皮苷可以有效地抑制破骨细胞的形成并下调骨吸收基因标记物的表达,剂量为10 μg/ml时表现出对TRAP活性的大抑制作用.在颗粒刺激培养液中柚皮苷降低了钙的释放.柚皮苷缓解了膝关节置钉模型中PMMA颗粒刺激所造成的长期的骨吸收,表现为骨体积分数的增加和大钉拔出力的增加.300 mg/kg的灌胃剂量可达到好的疗效.结论 柚皮苷抑制PMMA诱导的破骨细胞形成,降低PMMA颗粒刺激的钙释放.在观察慢性骨吸收的长期模型中,柚皮苷也有效抑制PMMA诱发的骨吸收,并保留了置入物的稳定性.
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黑皮质素受体在破骨细胞形成中的作用
目的 观察由Raw264.7细胞诱导破骨细胞形成过程中黑皮质素受体(MCR)的作用.方法 用α-促黑素(α- MSH)及其类似物SHU9119、PT141、THIQ分别处理体外培养的Raw 264.7细胞,并依此分为对照组、α-MSH组、SHU9119组、PT141组、THIQ组和α-MSH加SHU9119组.培养6天后,经抗酒石酸酸性磷酸酶染色后,观察并计数各组破骨细胞形成数目.RT-PCR法测定Raw 264.7细胞表达的MCR种类.结果 在Raw 264.7细胞诱导破骨细胞过程中,α-MSH呈剂依赖性的增加了破骨细胞形成.SHU9119组、PT141组及α-MSH加SHU9119组均显著增加了破骨细胞形成数目(P＜0.05)；但THIQ处理组对破骨细胞形成无统计学意义(P＞0.05).Raw 264.7细胞表达5种MCR.结论 MCR激动剂能显著增加破骨细胞形成数目,可能主要通过结合MCR1和/或MCR5促进破骨细胞形成.
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RANKL在成釉细胞瘤骨吸收机制中的作用
目的:检测RANKL在成釉细胞瘤(ameloblastoma,AM)组织中的表达情况及探讨RANKL在AM骨吸收机制中的作用.方法:通过免疫组化方法检测RANKL在AM组织中的表达情况;通过建立AM细胞/新生大鼠骨细胞共培养体系,观察AM细胞诱导破骨细胞形成的活性,再以OPG(RANKL的抑制剂)进行干预,观察OPG对AM细胞诱导破骨细胞形成活性的影响.结果:RANKL在AM组织中有恒定的表达;AM细胞能够诱导新生大鼠骨细胞分化为成熟的破骨细胞,但此活性可被OPG明显抑制.结论:AM细胞诱导破骨细胞形成可能是AM骨吸收过程中局部破骨细胞形成的重要来源和机制,而RANKL在此过程中发挥重要作用.
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促黑素对破骨细胞形成的影响
以核因子κB受体活化因子配体(RANKL)和促黑素(α-MSH)孵育Raw264.7细胞6d,经抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞形成的数目,并检测酸性磷酸酶活性.RT-PCR检测Raw264.7细胞5种黑皮质素受体(MCR)的表达.结果显示,与RANKL组相比较,RANKL+α-MSH组显著增加了破骨细胞的形成数量(P＜0.05),呈剂量依赖性,单独应用α-MSH组未见破骨细胞形成.RANKL组和RANKL+α-MSH组的酸性磷酸酶活性显著高于对照组和α-MSH组(P＜0.05),但前2组之间差异无统计学意义(P＞0.05);RT-PCR结果显示Raw264.7细胞5种MCR均表达.结果提示,α-MSH可能通过RANK信号通路促进破骨细胞形成.
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PPARγ激动剂对T细胞增殖及破骨细胞形成的影响
目的:观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ,PPARγ)激动剂15d-PGJ2对小鼠T细胞增殖、T细胞分泌的细胞因子表达及破骨样细胞形成的影响,并探讨其可能的作用机制.方法:体外分离伴放线放线杆菌(A.actinomycetetemcomitans,Aa)免疫的BALB/c小鼠颈部淋巴细胞,提取T细胞进行体外扩增,分别加人浓度为0、1×10(-8)、1×10(-7),1×10(-6),1×10(-5)mol/L的15d-PGJ2进行干预.培养3d后,(3)H-Tdr掺入法测定T细胞的增殖反应;ELISA法测定细胞上清中核因子-κB受体活化因子配体((receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)、TNF-α和IL-10的表达水平;取扩增的T细胞上清与RAW 264.7细胞共同培养后,抗酒石酸酸性磷酸酶染色(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)测定破骨样细胞的形成.采用SPSS 11.0软件包对数据进行统计学分析.结果:以1×10(-5)mol/L 15d-PGJ2处理的小鼠T细胞3d后,与对照组相比,T细胞增殖显著受抑;上清中RANKL、TNF-α的表达水平下降,IL-10无显著变化;TRAP染色阳性细胞数减少,具有统计学意义(P<0.05),且呈浓度依赖性.结论:PPARγ激动剂15d-PGJ2可抑制T细胞增殖,减少炎性因子分泌,降低破骨样细胞的形成,提示PPARγ配体在抑制T细胞诱导的骨吸收方面发挥积极作用.
关键词： 过氧化物酶体增殖物激活受体γ 细胞因子 破骨细胞形成 伴放线放线杆菌 T淋巴细胞 -
抗RANKL多克隆抗体抑制T细胞介导的破骨细胞形成的体外研究
目的:探讨抗核因子-KB受体活化冈子配体(RANKL)多克隆抗体对T细胞介导的破骨细胞形成的影响.方法:制备兔抗鼠RANKL多克隆抗体,使用不同浓度的抗体(1、5及10μg/mL),观察小鼠重组RANKL诱导的破骨细胞形成,显微镜下计数抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性多核细胞数/孔;体外分离、纯化、扩增大鼠的颈T淋巴细胞,给予不同浓度的兔抗鼠RANKI.特异性抗体进行干预,取其上清和T细胞,分别与RAW 264.7细胞共同培养,TRAP法测定T细胞介导的破骨细胞形成,显微镜下计数TRAP(+)多核细胞数/孔:ELISA测定细胞上清中的可溶性RANKL浓度(sRANKL,pg/mL).实验结果采用SPSS 11.5软件包进行统计学分析.结果:兔抗鼠RANKI,抗体既可减少RANKL诱导的TRAP(+)多核细胞数,也可减少T细胞介导的TRAP(+)多核细胞数,5μg/mL及10μg/mL抗体组差异显著(P<0.05),且呈浓度依赖性;上清中检出 sRANKL的浓度与不加抗体对照组相比明显降低,具有统计学意义(P<0.05).结论:抗RANKL特异性抗体可通过减少sRANKL的表达水平,直接阻断RANKL与核因子-KB受体活化因子(RANK)的结合,降低T细胞介导的破骨样细胞吸收.
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槲皮苷抑制RANKL诱导的破骨细胞形成及骨吸收
[目的]探讨槲皮苷对核因子κB受体激动剂配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL)诱导的破骨细胞形成及骨吸收功能的影响.[方法]通过CCK-8法观察不同浓度槲皮苷(0～800μmol/L)干预不同时间(48 h、96 h)对RAW 264.7细胞的生存影响,确定合适的体外用药浓度;利用体外RANKL诱导RAW 264.7细胞形成破骨细胞体系,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色计数评价槲皮苷(200、400 μmol/L)对破骨细胞形成和生存的影响;通过骨片吸收实验对骨凹陷和骨吸收面积统计分析评价槲皮苷(200、400 μmol/L)3 d内对成熟破骨细胞骨吸收功能的影响;采用实时定量(Real-Time) PCR技术,检测槲皮苷(200、400μmol/L)对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因NFATc1、TRAP和c-fos表达水平的影响.[结果]细胞生存实验发现槲皮苷干预96 h后,槲皮苷(0～800 μmol/L)对RAW 264.7细胞4d内生存未发现显著影响;通过TRAP染色发现200、400.μmol/L槲皮苷能显著抑制体外RANKL诱导的破骨细胞形成;通过骨片吸收实验发现200、400 μmol/L槲皮苷3d内能显著降低骨吸收面积,提示其抑制成熟破骨细胞骨吸收功能;同时,槲皮苷能呈剂量依赖性抑制RANKL诱导活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT) c1、TRAP和c-fos基因表达.[结论]槲皮苷通过抑制NFATc1,TRAP和c-fos的表达,来抑制体外RANKL诱导的破骨细胞形成和骨吸收功能,是一种潜在治疗骨质疏松药物.
关键词： 槲皮苷 Raw 264.7细胞 破骨细胞形成 破骨细胞骨吸收 骨质疏松 -
NF-κB信号通路介导的破骨细胞形成与功能调节的研究进展
破骨细胞是一种多核髓系细胞,由血液中循环的骨髓系前体细胞发生细胞质融合而形成.这些破骨前体细胞在受到破骨相关信号因子作用后聚集在骨表面,这些因子包括核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL),它是一种多功能细胞因子,与破骨细胞形成密切相关,广泛表达于骨和骨髓内的细胞中,包括嵌在钙化骨基质中的骨细胞、骨髓基质细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞等.骨组织改建持续存在于生长发育中的骨骼及成年人骨骼中,对机械性等刺激能够做出反应,并且能够清除损伤的、失去活力的骨组织微观病灶,这些微观病灶会随着破骨细胞形成的增多而增加.核因子κB受体活化因子(receptor activator of NF-κB,RANK)是RANKL的受体,二者发生结合可以激活破骨细胞、破骨前体细胞内的核因子kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路,继而贴附于骨表面的破骨细胞及破骨前体细胞,并在其胞膜特定褶皱端分泌氢离子、氯离子和胶原酶,在细胞膜褶皱端下形成盐酸并分泌组织蛋白酶K,分别发挥溶解骨组织矿物质和降解基质作用.破骨细胞沿骨表面移动,并且不断聚集以扩大吸收陷窝,直至骨吸收完成.然而,NF-κB信号通路在破骨细胞形成过程中具有双重调控作用,它既能促进破骨细胞的形成与活化,也能通过RANKL等细胞因子来抑制破骨细胞的形成[1].
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体外培养人牙囊细胞表达的OPG和RANKL对破骨细胞表型分化的影响
目的:建立人牙囊细胞(Human dental follicle cells,HDFCs)与人外周血单核细胞(Peripheral blood monocytos,PBMCs)共培养体系,研究体外培养人牙囊细胞表达的骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)和核心因子kappB受体激活剂(Receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL)对破骨细胞表型分化的影响.方法:取健康成人外周血分离出单核细胞,同时分离12-14岁青少年第三磨牙牙囊进行原代培养,建立两种细胞共同培养系统.实验分七组:A、单核细胞:B、单核细胞+牙囊细胞(接触);C、单核细胞+牙囊细胞(接触)+集落刺激因子-1(Colony stimulating factor-1,CSF-1)+甲状旁腺相关蛋白(Parathyroid hormone-related protein,PTHrP);D、单核细胞+牙囊细胞(不接触);E、单核细胞+RANKL+CSF-1;F、单核细胞+RANKL+CSF-1+牙囊细胞(不接触);G、单核细胞+RANKL+CSF-1+牙囊细胞(不接触)+anti-OPG.把每组细胞接种到预置玻片和牙本质片的24孔板中培养,观察细胞变化.培养第10天,取出玻片,进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,计数每组TRAP染色阳性细胞;第14天取出牙本质片,扫描电镜下观察骨陷窝形成情况.结果:B、F组可见少量破骨样细胞,A、D组无破骨样细胞,E组破骨样细胞分化显著,C、G组破骨样细胞较E组略少,但无显著性差别(P＞0.05),与其他各组差别显著(P＜0.05).结论:实验结果证实体外培养人牙囊细胞表达的RANKL和OPG分别对破骨细胞表型分化具有正向和负向调节作用.
