首页 > 文献资料
-
β-catenin基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位
目的 构建β-eatenin真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 提取工具细胞NIH3T3的mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增β-catenin基因cDNA全长,并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中.进一步将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞NIH3T3细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.后利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-β-catenin在NIH3T3细胞内的定位.结果 β-catenin基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为2346 bp,并测序成功.Western blot检测到了GFP-β-catenin融合蛋白表达,分子量约为115kDa.pEGFP-p-catenin在工具细胞NIH3T3细胞中主要定位于细胞膜和细胞质.结论 成功构建了β-catenin基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-β-catenin蛋白在NIH3T3细胞中主要定位于细胞膜和细胞质.
关键词： β-catenin基因 质粒构建 NIH3T3细胞 基因表达与定位 -
hLMO3基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位
目的 构建hLMO3真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO3基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hLMO3在HEK293细胞内的定位.结果 hLMO3基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP中,酶切鉴定片段为440 bp;Western blot检测到融合蛋白在HEK293细胞表达,分子量约为42kDa,pEGFP-LMO3在人HEK293细胞中主要定位于细胞核内.结论 成功构建了hLMO3基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-LMO3蛋白在HEK293细胞中主要定位于细胞核内.
-
hLMO1编码基因重组质粒的构建及蛋白的表达和定位
目的 构建hLMO1真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO1基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞---HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hLMO1在HEK293细胞内的定位.结果 hLMO1基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP中,酶切鉴定片段为471 bp.Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为45 kDa.pEGFR-LMO1在人HEK293细胞核与细胞质均有表达.结论 成功构建了hLMO1基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-LMO1蛋白定位于HEK293细胞的细胞质和细胞核内.
-
天使综合征致病基因UBE3a在大鼠神经元细胞中的克隆和表达检测
目的:调取并构建含有人UBE3a基因全长cDNA的真核表达载体pEGFP-UBE3a,采用磷酸钙转染方法将构建的重组质粒在神经元细胞中表达并观察EGFP-UBE3a蛋白的亚细胞定位.方法:采用PCR技术从人胎脑组织cDNA文库中扩增UBE3a基因的ORF片段并进行酶切构建pEGFP-UBE3a的真核表达重组质粒.用磷酸钙转染方法将重组质粒转染入体外培养的神经元细胞,分别在体外培养8天和14天时通过倒置荧光显微镜观察重组蛋白的表达和定位情况.结果:PCR扩增获得人胎脑组织cDNA文库中UBE3a cDNA全长2559 bp,构建真核表达重组质粒pEGFP-UBE3a成功,经DNA测序与GenBank中的人UBE3a cDNA序列一致.经倒置荧光显微镜观察重组质粒的表达情况,结果显示转染重组质粒的细胞中有高水平的EGFP-UBE3a蛋白表达,且UBE3a在早期神经元的细胞质和细胞核中广泛表达,并弥散在轴突和树突,而在成熟神经元细胞核中的表达明显富集.结论:本实验成功构建了pEGFP-UBE3a真核表达质粒,EGFP-UBE3a蛋白在体外培养的神经元细胞中能够有效表达,且随着神经元的成熟逐步向核内富集,为进一步研究UBE3a基因在天使综合征发生发展中的作用奠定了基础.
