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人DNA聚合酶β基因靶向RNA干扰重组子克隆及序列分析
目的克隆用于人DNA聚合酶β(DNA polymerase beta,Polβ)基因靶向RNA干扰的双链RNA(double strand RNA,dsRNA)寡核苷酸绿色荧光蛋白C1载体重组子"pEGFP-C1-pU6-dsRNA",为进一步研究人Polβ基因在环境化学污染物所致的DNA损伤修复中的作用机制作准备.方法依据Genbank中人polβ基因的cDNA序列,运用dsRNA oligonucleotide designer设计出用于RNA干扰用的dsRNA寡核苷酸序列,并以化学方法合成之.通过重组DNA技术将合成好的dsRNA克隆到含人pU6启动子的pSIREN-RetroQ逆转录病毒载体上,以此重组子转化感受态E.coli DH5α,经氨卞青霉素筛选后进行扩增,并抽提质粒.运用EcoR Ⅰ和BglⅡ消化并回收"pU6-dsRNA"目的片段,再将"pU6-dsRNA"亚克隆到pEGFP-C1上,获"pEGFP-C1-pU6-dsRNA"重组子,并进行酶切鉴定和序列分析.结果经酶切鉴定发现,"pEGFP-C1-pU6-dsRNA"载体重组子处于预期条带位置,序列分析显示与所设计的目的片段序列完全相符.结论作者克隆了用于人Polβ基因靶向RNA干扰的dsRNA绿色荧光蛋白C1载体重组子"pEGFP-C1-pU6-dsRNA",为进一步研究Polβ基因功能作好了准备.
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DNA聚合酶β与遗传不稳定性研究现状
DNA聚合酶β(polβ)是碱基切除修复系统(BER)中的核心成分,在DNA损伤修复及维持基因组稳定性和完整性中起着重要的作用.由于其缺乏3'～5'的校读功能,pol β在DNA合成中复制保真度较低,有关pol β在遗传不稳定性中的作用规律及其在肿瘤发生中的作用机制研究结果不尽一致.本文对pol β的结构与功能、pol β与基因组遗传不稳定性,以及pol β在肿瘤细胞组织中异常表达和突变的研究现状进行概述.
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针灸对环磷酰胺小鼠骨髓细胞DNA切除修复蛋白DNA聚合酶β的调节作用
目的:通过对骨髓细胞DNA切除修复蛋白——DNA聚合酶β(POLβ)进行定性及定量观察以及对该蛋白mRNA转录的测定,探讨针灸改善化疗后骨髓抑制,提升白细胞的分子生物学机制.方法:选用清洁级雄性昆明种小鼠224只,随机分为正常组、模型组、针刺组、艾灸组,每组56只.用环磷酰胺(CTX)造成骨髓抑制模型.针刺组、艾灸组选取“大椎”“膈俞”“肾俞”“足三里”,分别进行针刺、艾灸,正常组、模型组每日陪同针刺组和艾灸组抓取、固定,不做任何治疗.各组分别于2-7d用免疫组化法、Western Blot法、Real-time PCR法观察骨髓细胞POLβ表达的动态变化.结果:针刺和艾灸可以明显上调CTX模型小鼠骨髓细胞DNA修复蛋白POL β的表达,促进骨髓细胞DNA损伤的碱基切除修复,从而减轻烷化剂CTX造成的骨髓抑制,提升白细胞.结论:针灸可以促进骨髓细胞DNA的碱基切除修复,保护骨髓造血细胞因化学药物引起的损伤,是针灸改善化疗后骨髓抑制,保护造血功能,提升白细胞的重要机制之一.
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互隔交链孢酚增加NIH3T3细胞中DNA聚合酶β表达
目的 研究互隔交链孢酚(AOH)对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中DNA聚合酶β(DNA PoLβ)表达的影响.方法 采用半定量RT-PCR、细胞免疫化学和Western blot方法检测细胞中DNA POLβ mRNA和蛋白的表达.结果 与对照组相比,AOH可以引起NIH3T3细胞中DNA POLβ基因的mRNA水平和蛋白水平表达增高(并呈一定的剂量效应关系)(P0.05).结论 AOH可以引起NIH3T3细胞中DNA POLβ基因表达增高,可能有助于细胞应对AOH引起的DNA损伤.
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DNA聚合酶β基因在鼻咽癌中的突变
目的探讨鼻咽癌中DNA聚合酶β(DNA polymeraseβ, polβ)的变异情况.方法采用RT-PCR法(逆转录-DNA聚合酶链反应)、PCR-SSCP(聚合酶链-单链构象多态性分析)、DNA序列分析法对26例鼻咽癌组织及癌旁组织标本进行polβ基因突变研究.结果在26例癌旁组织标本中polβ无突变;26例鼻咽癌组织标本中存在polβ基因变异的有8例,突变率为30.8%.polβ基因变异的鼻咽癌标本测序结果显示:核苷酸序列有多种形式的改变.结论在鼻咽癌中存在多种形式的polβ突变,导致氨基酸序列、二级空间结构的改变.这些突变可能在肿瘤的发生过程中起重要作用.
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DNA聚合酶β过表达对食管癌EC9706细胞的影响
目的:观察过表达的DNA聚合酶β对食管癌EC9706细胞系的影响.方法:运用PCR方法,从质粒pcDNA3.1-polβ中扩增出野生型和突变型的DNA聚合酶β基因,作为目的片段,定向克隆至pEGFP-C3真核绿色荧光蛋白表达载体,获得野生型和突变型的重组真核表达载体pEGFP-C3-polβ.分别将野生型和突变型的pEGFP-C3-polβ转染EC9706细胞,荧光显微镜观察其定位,绘制生长曲线,测定细胞周期.结果:DNA序列分析证实了重组载体中的DNA聚合酶β序列正确,荧光显微镜结果显示野生型的DNA聚合酶β表达以细胞核为主,突变型的DNA聚合酶β则表达在整个细胞中,明显与野生型的DNA聚合酶β的核定位不同.而且,野生型的细胞生长较对照组缓慢(P＜0.05),野生型的还能抑制EC9706细胞的生长和使S期细胞减少(22.11±0.12 vs 44.86±0.03,P＜0.05),而突变型的则不能促进EC9706细胞的生长,S期细胞增殖不明显(P＞0.05).结论:过表达的野生型食管癌DNA聚合酶β可以降低EC9706细胞的增殖.
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子宫颈癌组织中DNA聚合酶β基因突变的研究
目的研究宫颈癌组织中是否存在DNA聚合酶β(POLB)基因的突变.方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术、聚合酶链-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)-DNA序列分析法对34例宫颈癌组织进行POLB基因突变的调查.结果宫颈癌组织中存在POLB基因突变,且基因突变率与癌组织的病理分级有关,G1、G2、G3宫颈癌组织中POLB基因突变率分别为9例中1例,29%(4/14)、73%(8/11),除G1与G2比较,差异无显著性外(P>0.05),余两比较,差异均有极显著性(P<0.005).测序结果表明,POLB基因的第660位核苷酸由A变为G,其氨基酸的第182位由精氨酸(Arg)变为甘氨酸(Gly).结论宫颈癌组织中存在POLB基因突变现象,可能与宫颈癌的发生、发展相关.
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人胃癌组织中DNA聚合酶β基因突变的研究
目的 研究胃癌组织中DNA聚合酶β基因(polβ)的突变情况.方法 利用RT-PCR、SSCP和序列分析对32例胃癌及癌旁组织标本中polβ基因进行检测.结果 32例胃癌组织标本中有7例SSCP异常,突变率为21.9%;而对应的32例癌旁组织PCR-SSCP结果中未见异常.在低分化胃癌中的突变率高达50.0%(6/12),而在中、高度分化胃癌中的突变率却仅为5.0%(1/20),经统计学分析,差异有显著性(P＜0.05).测序分析了7例SSCP异常中的3例,其突变分别为196位A→G,268位A→G,790位A→T;测序分析了1例PCR-SSCP无异常的癌旁组织标本,其序列无突变.结论 胃癌组织存在polβ基因突变;该基因突变可能与胃癌的发生、发展相关.
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RNA干扰人胃癌BGC-823细胞中DNA聚合酶β基因表达的初步研究
目的 研究RNA干扰DNA聚合酶β(polβ)基因对人胃癌BGC-823细胞生物学行为的影响.方法 针对DNA polβ基因序列构建小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,用脂质体介导转染人胃癌BGC-823细胞,G418筛选出稳定细胞株;采用荧光定量PCR和Western blot测定各组细胞的DNA polB mRNA和蛋白表达水平;用流式细胞术和裸鼠体内成瘤检测各组细胞的增殖情况.结果 成功构建了针对polβ基因的siRNA表达载体.转染pol β靶向siRNA的BGC-823细胞,其polβmRNA和蛋白表达水平均明显降低,且载体pRNAT-U6.l-sipoβ2(抑制程度83%)的沉默抑制作用强于载体pRNAT-U6.l-sipolβl(抑制程度56%);与无关siRNA对照组、空载体对照组和空白对照组相比,转染pRNAT-U6.1-sipellM的细胞G0/G1期比例显著升高,S期比例及细胞增殖速度显著下降(P<0.05);转染pRNAT-U6.l-sipolβ2的细胞C0/C1期比例显著降低,S期比例及细胞增殖率显著升高(P<0.05).结论 靶向DNA polβ的siRNA可以显著抑制polβ的表达;polβ的高表达和近乎完全抑制的超低水平表达都不利于维持细胞的生理状态;通过siRNA将BGC-823细胞中polβ表达沉默到合适的低水平,可能对肿瘤的生长起到抑制作用.
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突变型DNA聚合酶β碱基切除修复活性的分析
目的 分析162位Val→Als突变型DNA聚合酶β(DNA polymerase β,polβ)碱基切除修复活性的变化,为探讨修复基因DNA聚合酶β突变在肿瘤发生发展中的作用积累实验依据.方法 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)分别诱导含有野生型和162位Val→Ala突变型DNA聚合酶β表达载体(pQE80L-Wpolβ和pQE80L-Mpolβ)的大肠杆菌DH5α;通过镍柱亲和层析法纯化蛋白,复性后蛋白定;退火合成含有单碱基缺失的DNA底物,与纯化的野生型和突变型DNA聚合酶β蛋白进行BER修复试验.结果 通过诱导、纯化得到38kd野生型和突变型DNA聚合酶β蛋白;在BER实验中,野生型DNA聚合酶β能够在DNA底物的酶切位点处将其完全切开,而突变型DNA聚合酶β仅部分将其切开.结论 162位Val→Ala突变型DNA聚合酶β碱基切除修复能力显著减弱,提示肿瘤发生发展与polβ基因修复活性降低密切相关.
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人食管癌组织中DNA聚合酶β基因突变的研究
目的研究人食管癌组织中DNA 聚合酶β(POLB)基因的突变情况.方法利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、单链构象多态性(SSCP)和序列分析对30例人食管癌标本组织中DNA聚合酶β基因进行了检测.利用DNASIS、OMIGA等软件分析测序数据.结果手术切除浸润癌组30例食管癌标本中有13例POLB发生变异,突变率为43.3%(13/30);而癌旁对照29例正常,仅1例异常.早期原位癌组 14标本中有5例POLB发生变异,突变率为35.7%(5/14);另外,在1例食管鳞状上皮增生中也发现有POLB变异发生.在7例癌组织中存在相同58 bp(177位到234位)的基因片段缺失;共有8种点突变形式:(1)375位A→G(Ile→Val),(2)454位 T→C(Phe→Ser),(3)462位G→T(Glu→终止码),(4)466位G→A(Gly→Glu),(5)613位A→T(Lys→Ile),(6)648位G→C(Gly→Arg),(7)660位A→G(Arg→Gly)(8)670位A→G(Glu→Gly).结论本研究首次在食管癌中发现POLB基因突变;该酶基因突变可能与食管癌的发生、发展相关.
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DNA聚合酶β表达水平对苯代谢物氢醌致细胞凋亡及线粒体膜电位的影响
目的 探讨DNA聚合酶β(DNA polymerase beta,polβ)对氢醌(HQ)所致细胞凋亡的影响及其可能的分子机制.方法 以polβ野生型(polβ+/+)、polβ缺陷型(polβ-/-)及polβ高表达型(polβoe)小鼠胚胎成纤维细胞为研究对象,以不同浓度的HQ溶液染毒后,采用流式细胞术分别检测HQ对细胞凋亡和线粒体膜电位( △Ψm)的影响,试剂盒法测定细胞内活性氧(ROS)和羟自由基(·OH)含量;化学发光法分析细胞内超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力.结果 与对照组相比,各染毒组凋亡细胞率和△Ψm降低的细胞比例明显增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).与polβ+/+细胞比较,20.00、40.00、80.00 μmol/L染毒组polβ-/-细胞凋亡率明显增高,10.00、20.00、40.00、80.00μmol/L染毒组polβ oe细胞凋亡率明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).与polβ+/+细胞(20.60％±0.57％、37.95％+0.64％、44.50％±1.27％、57.55％+1.06％)比较,10.00、20.00、40.00、80.00 μmol/L染毒组polβ-/-细胞△Ψm降低的细胞比例(33.60％±1.55％ 、46.05％±1.77％、52.75％±2.05％、75.20％±0.56％)明显增高,polβ oe细胞△Ψm降低的细胞比例(16.05％±1.20％、29.80％±1.21％、35.15％±1.06％、53.80％±0.85％)明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).与polβ+/+细胞比较,各染毒组polβ-/-细胞产生的荧光强度明显增高,polβ oe细胞的荧光强度明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).与polβ+/+细胞相比,20.00、40.00 μmol/L染毒组polβ-/-细胞内·OH含量明显增高,polβ oe细胞内·OH含量明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05).在相同浓度HQ染毒剂量下,polβ-/-细胞内SOD和GSH-Px消耗快,polβ oe细胞内的SOD和GSH-Px消耗速度缓慢.结论 HQ可诱导细胞产生ROS,降低△Ψm,从而介导凋亡的发生;polβ可以帮助细胞对抗ROS的产生,降低线粒体发生去极化的几率,从而对HQ介导的凋亡起到一定的保护作用.
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食管癌突变型DNA聚合酶β对EC9706细胞影响的初步研究
目的:建立过量表达食管癌突变型(点突变型和缺失突变型)DNA聚合酶β(DNA Polymerase β,polβ)的EC9706细胞系,并观察其生物学特性的变化.方法:根据GenBank DNA polβ的cDNA序列设计引物,运用PCR方法,从质粒pcDNA3.1-polβ中扩增出点突变和缺失突变型的DNA polβ基因,作为目的片段,定向克隆至pEGFP-N3真核绿色荧光蛋白表达载体,获得点突变和缺失突变型的重组真核表达载体pEGFP-N3-polβ.采用脂质体转染的方法,将两种突变型的pEGFP-N3-polβ转染EC9706细胞系,荧光倒置显微镜观察其细胞定位,绘制生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期.结果:成功构建了点突变型和缺失突变型pEGFP-N3一polβ重组真核表达载体,荧光倒置显微镜结果显示缺失突变型的DNA polβ表达以细胞胞浆为主,点突变型以细胞胞核为主,而且缺失突变型的细胞生长较对照组明显减慢(P<0.05),点突变型与对照组相比则无明显差异(P>0.05);缺失突变型的DNA polβ还可使EC9706细胞的S期细胞明显减少(P<0.05),而点突变型轻度减少(P<0.05).结论:成功建立了稳定高表达人点突变型和缺失突变型DNA polβ的EC9706细胞系,外源点突变型和缺失突变型DNA polβ在食管癌EC9706细胞表达后可以改变其生物学特性,对研究食管癌的发病机制具有重要意义.
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IkB激酶β和DNA聚合酶β易感基因位点与中国汉族人群系统性红斑狼疮的相关性研究
目的 分析IkB激酶β(IKBKB)rs12676482,rs2272733和DNA聚合酶β(POLB)rs3136717,rs3136744基因单核苷酸多态性(SNPs)与中国汉族人群SLE遗传易感性的关系,探讨这些位点与SLE的相关性.方法 采用PCR-连接酶检测反应(LDR)技术对908例SLE患者和961名健康对照进行基因分型,结合SLE实验室及临床表现,分析该位点与疾病及临床表型的相关性.分型结果用PLINK1.07软件进行统计分析,所选SNP位点等位基因频率和基因型频率进行x2检验,3种遗传模型(加性模型、显性模型和隐性模型)基因型频率应用Logistic回归进行分析.结果 rs12676482在对照组中AA、AG、GG基因型频率和A、G等位基因频率分别为0.9％(8/938)、15.7％(147/938)、83.4％ (783/938)、8.7％(163/1 876)、91.3％(1 713/1 876),SLE组中为1.4％(12/888)、15.6％(139/888)、83.0％ (737/888)、9.2％(163/1 776)、90.2％(1613/1 776),2组基因型频率和等位基因频率差异均无统计学意义(P＞0.05);rs2272733在对照组中TT、TC、CC基因型频率和T、C等位基因频率分别为1.1％(10/938)、16.7％(157/938)、82.2％(771/938)、9.4％(177/1 876)、90.6％(1 699/1 876),SLE组中为1.4％(12/888)、16.3％(145/888)、82.3％(731/888)、9.5％(169/1 776)、90.5％(1 607/1 776),2组基因型频率和等位基因频率差异均无统计学意义(P＞0.05);rs3136717在对照组中CC、CT、TT基因型频率和C、T等位基因频率分别为1.1％(10/938)、16.7％(157/938)、82.2％(771/938)、9.4％(177/1 876)、90.6％(1 699/1 876),SLE组中为1.4％(12/888)、16.7％(148/888)、82.0％(728/888)、9.7％(172/1 776)、90.3％(1 604/1 776),2组基因型频率和等位基因频率差异均无统计学意义(P＞0.05);rs3136744在对照组中CC、CA、AA基因型频率和C、A等位基因频率分别为0.6％(6/938)、13.6％(128/938)、85.7％(804/938)、7.4％(140/1 876)、92.6％(1 736/1 876),SLE组中为1.0％(9/888)、14.4％(128/888)、84.6％ (751/888)、8.2％(146/1 776)、91.8％(1 630/1 776),2组基因型频率和等位基因频率差异均无统计学意义(P＞0.05).加性模型、显性模型及隐性模型下分析显示2组间差异均无统计学意义(P＞0.05).将SLE患者按血清学指标及临床表现分型,评估疾病活动度,未发现上述位点与临床指标之间相关(P＞0.05).结论 rs12676482,rs2272733(IKBKB)和rs3136717,rs3136744(POLB)位点多态性与中国汉族人群SLE易感性不相关.
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前列腺癌特异突变DNA聚合酶β真核表达载体构建及鉴定
目的 构建前列腺癌(PCa)特异突变DNA聚合酶β(polβ)真核表达载体.方法 提取有特异DNA polβ突变的PCa组织的总RNA,通用引物逆转录成cDNA;用设计带有接头的DNA polβ全基因引物,PCR扩增PCa组织中呈现的突变型DNA polβ全基因;构建T-A克隆并进行重组体的筛选鉴定;亚克隆入表达载体pcDNA3.1并进行重组体的筛选和鉴定.结果 PCa特异突变DNA polβ基因扩增选择出P4(MI-polβ)和P5(M2-polβ)两个标本,构建重组有特定突变位点的polβ目的 基因的pcDNA3.1真核表达载体,经PCR扩增获得2个阳性集落.结论 经鉴定成功构建2例PCa特异突变DNA polβ真核表达载体(pcDNA3.1-M1 and peDNA3.1-M2).
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胃癌中DNA 聚合酶β的突变及与幽门螺杆菌感染的关系
目的:研究胃癌组织中DNA聚合酶β基因(polβ)的突变情况及与幽门螺杆菌感染的关系.方法:提取总RNA反转录合成cDNA,经PCR扩增后以SSCP检测其变异情况.用PCR方法检测胃癌及癌旁组织标本中幽门螺杆菌的感染情况.结果:32例胃癌组织标本中有7例polβ-SSCP异常,突变率为21.9%;而对应的32例癌旁组织PCR-SSCP结果中未见异常.H.Pylori-DNA阳性的15例,H.Pylori-DNA阳性率为46.9%(15/32);对应癌旁组织的检测结果与胃癌组织完全一致.polβ SSCP阳性的标本H. Pylori-DNA也阳性.结论:胃癌组织存在polβ基因突变;这种基因突变可能与胃癌的发生、发展相关.幽门螺杆菌的感染与胃癌组织polβ突变可能存在一定的相关关系.
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siRNA沉默DNA聚合酶β基因对胃癌BGC—823细胞增殖的影响
目的:观察siRNA沉默DNA聚合酶β(DNA polymerase β,pol β)基因后对胃癌BGC-823细胞增殖的影响.方法:用实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative PCR,RFQ-PCR)和Western印迹法检测先前构建好的转染不同siRNA载体的各组细胞中pol β mRNA和蛋白质表达水平,用FCM法和裸鼠体内成瘤实验检测各组细胞的增殖情况.结果:转染pol β靶向siRNA的BGC-823细胞中pol β mRNA和蛋白质表达水平均明显降低,且siRNA载体pRNAT-U6.1-sipolβ2(抑制程度83%)的沉默抑制作用强于siRNA载体pRNAT-U6.1-sipolβ1(抑制程度56%);与无关siRNA对照组、空载体对照组和空白对照组相比,转染pRNAT-U6.1-sipolβ1组细胞的S期比例及细胞增殖速度明显下降,而转染pRNAT-U6.1-sipolβ2组细胞的S期比例以及细胞增殖则明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:DNA pol β高表达和近乎完全抑制的超低水平表达都不利于维持细胞的生理状态;BGC-823细胞中pol β表达通过siRNA沉默到合适的低水平,对肿瘤的生长可以起到抑制作用.
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全反式维甲酸对人食管癌细胞增殖及DNA聚合酶β表达的影响
目的研究全反式维甲酸对人食管癌细胞诱导分化作用.方法在体外细胞培养的基础上,观察细胞形态学的变化,细胞增殖动力学的变化.采用MTT比色法测定细胞增殖抑制率,免疫组化和western blot 方法检测DNA聚合酶β(polβ)蛋白表达.结果经全反式维甲酸处理后,人食管癌Eca109细胞的细胞形态趋向良性分化,细胞增殖指数明显降低.polβ表达降低.结论全反式维甲酸对人食管癌Eca109细胞有诱导分化作用,其机理可能是抑制polβ的表达,改变细胞的形态结构和生物学特性,促进癌细胞的分化趋向正常.
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DNA聚合酶β表达对食管癌放疗敏感性及预后的影响
[目的]探讨DNA聚合酶β表达对食管癌放疗敏感性的影响及预后评估.[方法]收集85例食管癌患者,根据DNA聚合酶β(DNA polβ)的表达水平随机分为高表达常规分割组、高表达超分割组、低表达常规分割组和低表达超分割四组.常规分割:2Gy/f,总量56～64Gy/28～32次,超分割:1.3 Gy/f,2f/d,总量56～62Gy/43～48次.治疗中及治疗后随访,观察急性反应、晚期反应以及近期疗效、局控率及1、3年生存率.[结果]四组之间放疗晚期反应肺纤维化及食管狭窄差别无统计学意义(P=0.887、0.711);近期疗效差异无统计学意义(P=0.862);急性反应放射性气管炎、放射性食管炎差异有意义(P=0.049、0.031),超分割两组显著高于常规分割组;1、3年局部控制率及生存率两组差异明显(P=0.028、0.036、0.040、0.014).[结论]超分割放疗加重急性反应,DNA polβ表达不同对放疗敏感性有影响,低表达组超分割放疗预后相对较好.
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DNA聚合酶β与肿瘤发生的关系
DNA聚合酶β(polymerase β,Pol β)是人体内主要的碱基切除修复聚合酶,该酶在其结构进化过程中相当保守,说明它在生命活动功能中起着重要作用.自从重组全DNA技术克隆出了DNA聚合酶β的cDNA以后,它的生物学功能越来越受到人们的关注,被称为生物进化过程的"看家酶".DNA聚合酶β在人类肿瘤中突变的表达情况为深入研究肿瘤的分子机制提供了1个崭新的领域.
