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HCMV编码的dsRNA结合蛋白在抗机体RNA干扰中的作用
人巨细胞病毒(HCMV)是一种感染广泛的疱疹病毒家族中的一员,它对人群中的易感者尤其对免疫能力下降患者的危害已引起社会的广泛重视.RNA干扰(RNAi)是近年来发现存在于体内抵御病毒感染和基因损伤的一种重要的保护机制.而HCMV则可通过编码dsRNA结合蛋白(DRBPs),特异性结合dsRNA,阻断宿主细胞抗病毒的RNAi途径,保护病毒mRNA的表达,终达到逃避宿主细胞的抑制病毒转录的作用.
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人DNA聚合酶β基因靶向RNA干扰重组子克隆及序列分析
目的克隆用于人DNA聚合酶β(DNA polymerase beta,Polβ)基因靶向RNA干扰的双链RNA(double strand RNA,dsRNA)寡核苷酸绿色荧光蛋白C1载体重组子"pEGFP-C1-pU6-dsRNA",为进一步研究人Polβ基因在环境化学污染物所致的DNA损伤修复中的作用机制作准备.方法依据Genbank中人polβ基因的cDNA序列,运用dsRNA oligonucleotide designer设计出用于RNA干扰用的dsRNA寡核苷酸序列,并以化学方法合成之.通过重组DNA技术将合成好的dsRNA克隆到含人pU6启动子的pSIREN-RetroQ逆转录病毒载体上,以此重组子转化感受态E.coli DH5α,经氨卞青霉素筛选后进行扩增,并抽提质粒.运用EcoR Ⅰ和BglⅡ消化并回收"pU6-dsRNA"目的片段,再将"pU6-dsRNA"亚克隆到pEGFP-C1上,获"pEGFP-C1-pU6-dsRNA"重组子,并进行酶切鉴定和序列分析.结果经酶切鉴定发现,"pEGFP-C1-pU6-dsRNA"载体重组子处于预期条带位置,序列分析显示与所设计的目的片段序列完全相符.结论作者克隆了用于人Polβ基因靶向RNA干扰的dsRNA绿色荧光蛋白C1载体重组子"pEGFP-C1-pU6-dsRNA",为进一步研究Polβ基因功能作好了准备.
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湖北荆州地区A组轮状病毒G血清型分布情况调查
轮状病毒归属呼肠病毒科,系dsRNA病毒,基因组包含11个节段的dsRNA,分别编码6种结构蛋白和5种非结构蛋白.依抗原性不同区分病毒血清型称G型,至今已确定14种G血清型,其中10种可感染人,以G1-G4在人群中占优势[1-3].近年来世界各地有关轮状病毒G血清型的流行规律与以往有所变化,因此给疫苗的研制与使用带来新的挑战[4].国内对轮状病毒分子流行病学的资料多来自北方地区,湖北荆州地区尚未报道.本实验就湖北荆州地区腹泻儿童轮状病毒感染株G血清学的分子流行病学作研究,为国内轮状病毒的预防提供理论依据.
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RNA病毒阻断RIG-I样受体识别dsRNA机制研究进展
RIG-I样受体(RIG-I-like receptors,RLRs)是一类重要的模式识别受体,其在机体抵抗病毒感染过程中发挥着至关重要的作用.RLRs通过级联放大效应,诱导Ⅰ型干扰素的表达,激活干扰素通路,终发挥抗病毒效应.而病毒为了自身长期的生存和繁殖,在长期的进化和演化过程中,不断的与机体免疫系统进行着抗衡和斗争,由此演化出了一系列的拮抗策略.RLRs主要识别5'端带有三磷酸基团的RNA(包括单链和双链RNA)和双链RNA,其在启动免疫应答过程中可以通过与病毒RNA结合而得以激活,然后招募下游分子,激活整个通路的信号转导.病毒为了阻断RLRs对病毒RNA的识别,拮抗RLRs通路的激活,进化出了非常精细的对抗策略,主要分为:躲避、伪装和攻击三种策略.了解清楚病毒拮抗RLRs抗病毒的分子机制对于研制新的抗病毒药物及发展新的抗病毒策略具有深远意义.本文主要对RNA病毒阻断RLRs识别dsRNA机制的研究进展进行综述.希望为研究不同RNA病毒拮抗RLRs分子机制提供一定的参考和依据.
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家蚕质多角体病毒(BmCPV)基因组dsRNA片段V的全序列测定
质多角体病毒属于呼肠孤病毒科质多角体病毒属,代表种为家蚕质多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV).质多角体病毒粒子为正二十面体,直径约60nm～80nm,正二十面体的十二个顶点均有管状突起.
关键词： 家蚕质多角体病毒(BmCPV) dsRNA RT-PCR 序列测定 -
转录后水平的基因沉默--RNA干涉
RNA干涉(RNA interference,RNAi)是1998年首次在秀丽线虫中发现并证明属于转录后水平的基因沉默(PTGS)机制.它利用双链RNA(dsRNA)特异性地降解相应序列的mRNA成为siRNA,从而特异性地阻断相应基因的表达,广泛存在于从真菌到植物、从无脊椎动物到哺乳动物的各种生物中.本文介绍了基因沉默的机理、RNA干涉的分子机制及技术应用等方面的进展,RNA干涉在后基因组时代的基因功能研究和药物开发中将具有广阔的发展前景.
关键词： PTGS RNA干涉 dsRNA 短干涉RNA(siRNA) -
应用RNA干扰技术对旋毛虫Ts87基因功能的初步研究
为研究旋毛虫Ts87基因的功能,通过RNA干扰途径抑制目的基因的表达.针对Ts87基因序列设计并合成特异性dsRNA、siRNA,通过浸泡方式分别将dsRNA、siRNA导入肌幼虫体内,利用实时荧光定量PCR分析Ts87基因及旋毛虫管家基因GAPDH的表达.此外,测定RNA干扰作用下的肌幼虫体外存活率的变化.根据实时荧光定量P(=R结果,dsRNA及siRNA均能有效抑制Ts87基因mRNA的表达.此外,两种RNA能够在一定程度上降低肌幼虫体外存活率.实验表明,RNA干扰技术能够有效抑制旋毛虫功能基因Ts87表达,从而为研究旋毛虫基因的功能提供一种新的有效途径.
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RNA干扰号慢性疼痛的基因治疗
RNA干扰(RNA interference,BNAi)是1998年Fire等[1]首次发现并命名的,是由双链RNA(dsRNA)分子在细胞内特异性诱导与之同源mRNA降解或翻译抑制,导致基因沉默的现象,是一种典型的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS).RNAi主要的功能特点是其可以调节和关闭基因的表达,进而调控细胞的各种高级生命活动.RNAi技术已经成为模式生物、基因功能、基因治疗等研究领域中有力的工具,本文仅就RNAi在慢性疼痛研究中的进展作-介绍.
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弓形虫表面抗原SAG3基因表达干扰体系的建立
目的 建立弓形虫SAG3基因RNAi体系,为近一步研究SAG3的功能奠定基础. 方法 以弓形虫SAG3基因3′-UTR区及CDS区为靶目标体外转录合成dsRNAs,通过电转法化将其分别导入弓形虫速殖子体内,用转染后的弓形虫感染 SMMC7721细胞,半定量RT-PCR分析鉴定RNAi效果. 结果 分别于转染12、24和48 h后,RT-PCR检测SAG3基因 mRNA,显示dsRNA转染组SAG3 mRNA水平明显低于未转染dsRNA的空白对照组和阴性对照组.其中以电压0.4 kV,时间延迟为9 ms的3′UTR dsRNA转染组效果好.转染12 h后,即有较明显的干扰效果.转染24 h后,干扰效果为显著. 结论 筛选出了可以有效抑制弓形虫SAG3基因的dsRNA序列,初步确定了RNAi发生及持续时间,为进一步研究SAG3基因功能奠定了基础.
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应用dsRNA介导的RNAi对烟曲霉菌生命必须基因的研究
目的 初步探讨应用RNAi研究烟曲霉菌必须基因的方法.方法 液氮研磨烟曲霉菌,提取总mRNA,用含T7启动子序列的特异引物进行RT-PCR,扩增出两端含T7启动子序列的nudC基因,以此为模版使用MEGAscriptTM RNAi Kit体外转录合成dsRNA,用合成的dsRNA电转化烟曲霉菌后,观察烟曲霉菌表型变化,对转化菌进行RT-PCR,分析mRNA变化.结果 电转化后,转化菌的nudC基因mRNA水平降低,与18srRNA的比值为0.50±0.07,显著低于零对照1.09±0.06和无关对照1.10±0.09(F=9.38,P＜0.05);烟曲霉菌生长受到抑制,类似基因敲除的表型.结论应用dsRNA介导的RNA能沉默烟曲霉菌靶基因,产生类似基因敲除的表型,为研究靶基因功能,识别烟曲霉菌生命必须基因,寻找新的抗菌药物作用靶位奠定了良好的基础.
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应用RNA干扰技术对旋毛虫蛋白酶体β7亚基基因功能的研究
目的 研究旋毛虫蛋白酶体β7亚基(T.spiralis proteasome subunit beta type-7,Tspst)的基因功能.方法 通过浸泡法将Tspst特异性的dsRNA(dsRNA-Tspst)导入旋毛虫肌幼虫体内,应用Real-time PCR和Western blot检测经dsRNA-Tspst浸泡处理后幼虫Tspst基因的转录和表达水平.体外培养观察Tspst基因沉默对幼虫存活的影响.将dsRNA浸泡后的幼虫经口接种小鼠,观察Tspst基因沉默对幼虫发育、存活及雌成虫生殖力的影响.结果 Real-time PCR和Western blot检测显示,旋毛虫幼虫经40 ng/μl dsRNA浸泡处理后Tspst基因的转录和表达分别下降71.87％和61.9％ (P＜0.05).dsRNA浸泡处理组、Lip2000和PBS对照组幼虫的死亡率分别是33.4％、35％和35.4％(x2=0.118,P＞0.05).将dsRNA浸泡的幼虫接种小鼠后6d,肠道成虫与35d肌幼虫的减虫率分别为26.51％和38.34％.dsRNA浸泡处理组、Lip2000和PBS对照组幼虫感染小鼠收集的雌虫体外培养72 h新生幼虫产量分别是53.26±3.99、50.80±3.08和53.70±2.57条(P＞0.05).结论 dsRNA可明显抑制Tspst基因的表达及幼虫在小鼠体内的发育和存活.
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RNA干扰p53对肝细胞癌SK-Hep-1细胞细胞周期的影响
背景与目的:肝细胞癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一,p53又是重要的抑癌基因,而RNA干扰(RNA interference,RNAi)不仅是一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段,而且有可能在肿瘤基因治疗方面提供新的途径.因此,我们将外源性p53双链小RNA(small double stranded RNA,dsRNA)瞬时转染肝癌SK-Hep-1细胞系,观察其对肝癌细胞P53和P21蛋白表达及细胞周期的影响.方法:合成的p53 dsRNA和EGFP dsRNA,分别以200 ng和400ng的p53 dsRNA用脂质体转染法转染SK-Hep-1细胞,同时设0.9%NaCl空白对照和EG-FP及EGFP+EGFP dsRNA阳性对照组,每组3个复孔,分别在转染24h和48h时用流式细胞仪进行细胞周期检测,对转染p53 dsRNA 48h后应用Western Blot检测P53和P21蛋白的表达,初步探讨p53的dsRNA干扰对肝癌细胞影响的机制.结果:SK-Hep-1细胞在转染200ng p53dsRNA后G0-G1期细胞明显减少,24h时与空白对照相比减少了52.53%,与转染同剂量EG-FP+EGFPdsRNA的阳性对照组相比也减少了50.29%(P＜0.05);S期细胞明显增多,24h时与空白对照相比增加了146.8%,与转染同剂量EGFP+EGFP dsRNA的阳性对照组相比增加了128.62%(P＜0.05);G2-M期细胞也明显增多,24h时与空白对照相比增加了30.56%(P＜0.05),与转染同剂量EGFP+EGFP dsRNA的阳性对照组相比增加了21.63%(P＞0.05).转染400ng p53 dsRNA的SK-Hep-1细胞周期变化也基本相同.转染200ng和400ng p53 dsRNA的SK-Hep-1细胞在48h时,没有检测到P53蛋白的表达,而部分抑制P21蛋白的表达.结论:p53 dsRNA可明显抑制SK-Hep-1细胞P53和部分抑制P21蛋白的表达,并明显促进SK-Hep-1细胞的增殖,其促进细胞增殖作用可能与其抑制细胞P53和部分抑制P21蛋白的表达有关.
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喀什分离到新型双链RNA病毒
2005年7～8月在喀什地区采集蚊虫13,491只,50～100只/组进行研磨,取上清在C6/36和Vero细胞上进行病毒分离,获得24个对C6/36细胞致病变而对Vero细胞不致病变的病毒.24个病毒分离物的基因组核酸电泳显示相同的12节段双链RNA(double stranded R,NA,dsRNA)带型.以随机六聚体引物pd(N)6反转录制备病毒基因组cDNA,采用辽宁病毒(liaoning virus,LNV)第12基因片段特异性引物进行PCR扩增,PCR,产物进行核酸序列测定,序列BLAST比对显示与GenBank中已知LNV第12基因片段核酸序列同源性超过85%,证实24个病毒分离物均为LNV.核酸序列系统进化分析显示与LNV-NE9712进化关系更接近.
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RNA干扰在肝病治疗中的研究进展
RNA干扰(RNAi)是双链RNA(dsRNA)分子在mRNA水平关闭相应序列及基因的表达使其沉默的过程[1].RNAi主要的功能特色在于它可调节和关闭基因的表达,促使mRNA降解或阻止蛋白产物合成,进而调控细胞的各种高级生命活动,其抑制基因表达作用具有高效性和特异性[2].RNAi作为一种快捷方便的工具广泛用于高通量的研究基因功能、基因敲除、基因治疗和基因表达调控领域的研究.现对RNAi在肝病治疗中的新进展作一综述.
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RNAi的研究进展
RNAi是由双链RNA导入而引起的基因沉默现象,是近几年迅速发展起来的一种基因阻断技术.dsRNA经酶切成为siRNA(shorr interfering RNA),进一步形成RISC(RNA induced silencing complex),在siRNAs引导下切割靶mRNA.RNAi技术在基因研究,疾病的基因治疗等方面均有广阔前景.
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RNA干扰及其应用
RNA干扰(RNAi)现象是生物界的一种保守行为,能特异抑制同源基因的表达,具有抵抗病毒人侵和维持基因组稳定的作用,是生物体对病毒基因等外源核酸侵入的一种保护性反应.RNAi是由dsRNA诱导的多步骤反应,首先dsRNA被降解为21～25 nt的siRNA,siRNA再与对应的mRNA特异结合、降解,从而阻止mRNA的翻译.当病毒在宿主细胞内进行复制、增殖时,病毒RNA可被降解成长19～23 nt、具有5'磷酸和3'羟基及2个nt(dTdT或UU)3'外悬粘末端的siRNA,从而通过RNAi的作用抑制细胞内病毒的增殖.它的出现为生物学家提供了一种快速、简便的反向遗传学技术,在后基因组时代功能基因的研究中具有重要的应用前景,同时在人类基因治疗方面具有潜在的应用价值.
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RNA干扰技术及其在口腔肿瘤研究中的进展
RNA干扰(RNA interference,RNAi)首先由Fire等[1]提出,为双链RNA(double strand RNA,dsRNA)介导的细胞内序列特异性转录后基因沉默过程,是生物体在进化过程中,抵御病毒感染及由于重复序列和突变引起基因组不稳定性的保护机制.RNAi技术现已广泛应用于逆基因分析和基因治疗等领域,并日益成为口腔肿瘤患者分子病因和基因治疗研究的重要工具.
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RNAi技术及抗HBV治疗研究进展
RNA干扰(RNA interference , RNAi )是由21个～23个核苷酸组成的双链RNA(dsRNA)所引发的生物细胞内同源基因转录后沉默的现象,是生物体在进化过程中普遍存在的一种基因调控机制.利用RNAi技术的高效性和特异性抵御病毒感染及其它外源性核酸入侵的研究,已取得了很大进展,针对乙肝病毒感染这一全球性的健康问题,RNAi有着广泛的应用前景.
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基因组免疫系统
随着对RNAi现象及其功能的深入研究,揭示dsRNA/siRNA具靶向降解特异性mRNA、抑制相应基因表达作用,有抵抗病毒和转座子入侵基因组的重要功能,故被称为"基因组免疫系统".本文综述了该系统的发现、功能、作用机制和应用前景.
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RNA干涉
RNAi(RNA interference)即RNA干涉,是初在线虫Caenorhbditis elegans中发现的在双链RNA(dsRNA)的介导下特异性降解相应序列的mRNA的现象,属于转录后基因沉默(PTGS)机制,广泛存在于从真菌到植物,从果蝇等无脊椎动物到鼠等哺乳动物的多种生物中.RNAi是自然存在的生物抵抗病毒入侵、抑制转座子活动的一种防御性机制,对于生物体的基因调控和生长发育可能也有着重要的作用.由于其存在的广泛性以及抑制基因表达的特异性和高效性,RNAi已经在短短的几年时间里成为功能基因组研究中的有力工具.
