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应用dsRNA介导的RNAi对烟曲霉菌生命必须基因的研究
目的 初步探讨应用RNAi研究烟曲霉菌必须基因的方法.方法 液氮研磨烟曲霉菌,提取总mRNA,用含T7启动子序列的特异引物进行RT-PCR,扩增出两端含T7启动子序列的nudC基因,以此为模版使用MEGAscriptTM RNAi Kit体外转录合成dsRNA,用合成的dsRNA电转化烟曲霉菌后,观察烟曲霉菌表型变化,对转化菌进行RT-PCR,分析mRNA变化.结果 电转化后,转化菌的nudC基因mRNA水平降低,与18srRNA的比值为0.50±0.07,显著低于零对照1.09±0.06和无关对照1.10±0.09(F=9.38,P＜0.05);烟曲霉菌生长受到抑制,类似基因敲除的表型.结论应用dsRNA介导的RNA能沉默烟曲霉菌靶基因,产生类似基因敲除的表型,为研究靶基因功能,识别烟曲霉菌生命必须基因,寻找新的抗菌药物作用靶位奠定了良好的基础.
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MPO及TNF-α在小鼠侵袭性肺曲霉病中的作用
烟曲霉菌是自然界广泛存在的腐生致病菌,易导致免疫力低下患者发生严重且致死性的侵袭性肺曲霉病(IPA).通过建立小鼠侵袭IPA模型,探讨髓过氧化物酶(MPO)及TNF-α在侵袭IPA中的作用,为阐明IPA的发病机制提供资料.
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烟曲霉菌对唑类抗真菌药的耐药机制研究进展
唑类抗真菌药是曲霉病处理中一种为常用的药物,而曲霉病主要是由烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)感染引起的.越来越多的报道发现A.曲霉株(A.fumigatus isolates)具有唑类抗真菌药耐药性,这是曲霉病治疗中一个巨大的挑战.A.曲霉唑类抗真菌药耐药株(ARAF)在侵袭性曲霉病患者中具有非常高的致死率,这对临床微生物学者如何及时诊断耐药性和提出合适的干预策略等方面提出极大的挑战.ARAF耐药株既存在cyp51A突变型又存在cyp51A非突变型,而且cyp51A非突变型在唑类抗真菌药耐药中占有的比重越来越高,为临床的诊断和治疗提出了更高的挑战.本综述总结了目前A.曲霉唑类抗真菌药耐药株在全球各国的发病情况及其耐药机制研究的新进展.
关键词： 烟曲霉病 烟曲霉菌 cyp51A基因突变 耐药机制 -
Dectin-1和TLR2/TLR3/TLR4受体在免疫缺陷小鼠侵袭性肺曲霉菌病的表达
目的：本研究利用小鼠动物模型，探讨烟曲霉感染免疫缺陷小鼠TLR2/TLR3/TLR4对树突状细胞植物血凝素-1（Dectin-1）表达的影响。通过检测TLRs和CLRs受体在不同免疫状态下的表达，揭示介导侵袭性肺曲霉菌病（IPA）肺损伤的关键受体。方法小鼠随机分成四组，A组为正常对照组；B组为环磷酰胺免疫抑制＋未接种烟曲霉菌；C组正常状态小鼠＋烟曲霉菌接种；D组为IPA感染组，免疫抑制＋烟曲霉菌接种。采用real-time PCR方法进行小鼠肺组织各个时相点的TLR2、TLR3、TLR4、Dectin-1和β-actin mRNA的表达，检测受体间的相互表达调控。结果正常状态感染组（C组N＋AF），TLR4/TLR2、Dectin-1 mRNA比正常对照组表达上调；IPA模型组（D组CP＋AF），Dectin-1和TLR4、TLR2 mRNA比正常状态感染组表达下调；但TLR3 mRNA 48 h、72 h表达没有明显不同（P＞0.05）。病理切片模型组小鼠72 h可见较严重的出血和充血；96 h时肺内有菌丝，肺泡间隔增宽，支气管壁破坏。正常状态感染烟曲霉小鼠72 h可见充血，肺泡弹性纤维破坏。结论成功建立了小鼠IPA动物模型，Dectin-1受体表达下调可能是环磷酰胺免疫抑制引起IPA的机制之一。Dectin-1的表达可能是建立在TLR2/TLR4对烟曲霉早期识别的基础上，TLR3可能起协同作用。
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侵袭性肺曲霉菌病小鼠动物模型建立的实验研究
目的：建立免疫抑制小鼠侵袭性肺曲霉菌病（IPA）动物模型，为阐明IPA的发病机制和临床治疗提供基础研究。方法用环磷酰胺造成小鼠免疫抑制，双侧鼻孔滴入烟曲霉菌孢子，分别于24 h、48 h、72 h、96 h不同时间点处死小鼠，通过肺组织病理、肺组织真菌培养确定侵袭性肺曲霉菌病模型是否构建成功。结果 IPA 模型组的组织培养可见烟曲霉菌，病理切片模型组小鼠72 h时可见较严重的出血和充血；96 h时肺内有菌丝，肺泡间隔增宽，组织坏死。正常状态感染烟曲霉小鼠72 h可见充血，肺泡弹性纤维被破坏；96 h仅表现为炎症和出血，未见菌丝。结论成功建立了小鼠IPA动物模型，为研究侵袭性曲霉菌病的发病机制、早期诊断和防治奠定了基础。
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检测烟曲霉菌GM抗原生物素-亲和素-夹心酶联免疫吸附试验法的建立
本研究用重组烟曲霉半乳糖甘露聚糖(AFMP1),制备免疫血清,建立一种以生物素-亲和素(BA)系统为基础的夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法,快速检测烟曲霉GM抗原[1].
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从胸水和脑脊液中分离出烟曲霉菌一例
我们从一例患者的胸水和脑脊液中同时培养分离出烟曲霉菌(aspergillus fumigatus ),报告如下.
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健康人血清中烟曲霉菌特异性IgG水平及其意义
我们通过检测健康人群和变应性曲霉哮喘患者特异性抗烟曲霉IgG水平,探讨烟曲霉特异性IgG的血清学检查在临床诊断和鉴别诊断中的价值.
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右心感染性心内膜炎伴多发肺栓塞一例
患者男，71岁。因间断发热伴咳嗽10月余，于2000年5月5日入院。患者于1999年6月起无诱因出现发热，体温40℃，伴寒战，咳嗽，咳白痰，无胸痛、呼吸困难和咯血。抗感染治疗后体温3日内降至正常，停药后体温，症状同前。1999年7月胸片(图1)，8月CT(图2)示：左肺下部，中上部多发斑片浸润影。9月行纤维支气管镜检查未见异常，多次痰找结核菌及瘤细胞均阴性。2000年4月胸片(图3)、 CT(图4)示：左肺少许炎性病变，右肺门旁及下肺斑片浸润影。起病后无双下肢肿痛。既往否认结核，心脏病病史，无外伤手术史。吸烟40年，10支/d。查体：T 37℃，P66次/min，R 16次/min，BP 110/70 mm Hg (1 mm Hg =0.133 kPa)，浅表淋巴结未及，双肺未闻及干湿音。心率66次/min，律齐，未闻及杂音。双下肢无肿痛，无杵状指，诊断：肺部游走性阴影原因待查。入院后体温正常，无咳嗽、咳痰及其他不适，未予特殊治疗。血象正常，动脉血气：二氧化碳分压：30mm Hg ，氧分压：87mm Hg ，肺泡-动脉氧分压差：28 mm Hg 。烟曲霉菌皮试阴性。心电图：大致正常。超声心动图示：三尖瓣赘生物可能性大，右房右室增大，肺动脉高压。
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烟曲霉暴露对支气管哮喘大鼠气道黏蛋白MUC2表达的影响
目的 研究烟曲霉暴露对支气管哮喘(简称哮喘)大鼠气道黏蛋白MUC2表达的影响.方法 70只雄性Wistar大鼠随机数字表法分为7组(每组10只):慢性哮喘(A)组、慢性哮喘+烟曲霉孢子吸入1周(B)组、3周(C)组和5周(D)组、慢性哮喘+生理盐水吸入(E)组、卵清白蛋白(OVA)致敏生理盐水激发(F)组和OVA致敏生理盐水激发+烟曲霉孢子吸入(G)组.测定各组大鼠的基础气道阻力和气道阻力变化率,ELISA法测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-13水平,RT-PCR法检测肺组织MUC2 mRNA水平,免疫组织化学染色测定气道上皮细胞MUC2表达强度.结果 D组大鼠基础气道阻力为(1.06±0.28) cm H2O·ml-1·s-1、气道阻力变化率为(85.69±5.68)%、BALF中IL-13为(197±34) mg/L、肺组织MUC2 mRNA/β-actin mRNA为(3.0±0.6)、气道上皮细胞MUC2表达强度(A值)为(871±70)均高于A组[(0.52±0.13) cm H2O·ml-1·s-1、(31.62±3.62)%、(54±9) mg/L、(1.8±0.4)、(202±36)]、B组[(0.54±0.14) cm H2O·ml-1·s-1、(35.90±2.62)%、(96±16) mg/L、(1.9±0.3)、(258±48)]、C组[(0.89±0.22) cm H2O·ml-1·s-1、(60.91±4.26)%、(136±22) mg/L、(2.3±0.5)、(546±54)]和E组[(60.91±4.26) cm H2O·ml-1·s-1、(31.64±3.47)%、(37±8) mg/L、(1.7±0.4)、(188±39)](P＜0.01或P＜0.05);A组高于F组[(0.33±0.08) cm H2O·ml-1·s-1、(16.85±3.62)%、(23±6) mg/L、(0.5±0.2)、(87±18)]和G组[(0.34±0.12) cm H2O·ml-1·s-1、(16.52±3.34)%、(25±6) mg/L、(0.5±0.1)、(88±15)](P＜0.01或P＜0.05);大鼠肺组织MUC2 mRNA/β-actin mRNA和气道上皮细胞MUC2表达强度(A值)均与BALF中IL-13水平正相关(r=0.648,P＜0.05;r=0.676,P＜0.05),与气道阻力变化率正相关(r=0.644,P＜0.05;r=0.584,P＜0.05).结论 慢性烟曲霉暴露可上调哮喘大鼠气道黏蛋白MUC2基因表达,气道黏液分泌增多,黏稠度和黏滞度增加,导致气道反应性增高.
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耐伊曲康唑烟曲霉菌对泊沙康唑的敏感性分析
目的 测定耐伊曲康唑烟曲霉菌对泊沙康唑的敏感性,探讨cyp51A基因突变对其敏感性的影响,提高对耐伊曲康唑烟曲霉菌的认识.方法 选择2012年2月-2013年12月3株耐伊曲康唑烟曲霉菌,参照欧洲抗菌药物敏感试验委员会(EUCAST)E.DEF 9.2方法,测定其对白沙康唑的低抑菌浓度(MIC),进行烟曲霉菌cyp51A基因提取、扩增、测序,将所得序列同GenBank中烟曲霉菌标准株AF.338659的cyp51A序列进行比对,查看有无突变序列.结果 3株耐伊曲康唑烟曲霉菌对泊沙康唑的MIC分别为0.03、0.06、0.03 mg/L,均判定为对泊沙康唑敏感;其均存在cyp51A基因突变,突变位点分别为M220I、TR/L98H和TR/L98H.结论 泊沙康唑对耐伊曲康唑烟曲霉菌在体外表现为较好的敏感性,且其敏感性与烟曲霉菌cyp51A基因突变无明显相关.
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应用直接重组酶聚合酶扩增技术快速检测烟曲霉菌
目的 通过建立重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)直接检测标准烟曲霉菌株的方法,探讨其无需样本前处理的可行性.方法 针对标准烟曲霉核酸序列保守区域设计RPA扩增引物,使用100、10-1、10-2、10-3、10-4、l0-5麦氏浊度的标准烟曲霉菌液作为无样本前处理组进行直接RPA扩增;同时,分别采用柱式法、磁珠法、氯化苄法提取烟曲霉菌DNA作为样本前处理对照组并进行RPA扩增,后,应用2％琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析.结果 标准烟曲霉菌的100、10-1、10-2及10-3麦氏浊度均可于39℃30min内扩增出目的条带;三种提取方法结果分别为:柱氏法(13.8±0.83) ng/μl,磁珠法(11.5±2.25)ng/μl,氯化苄法(64.9±1.31)ng/μl,三种方法均能扩增出目的条带,其中氯化苄法产出率较高(64.9±1.31)ng/μl.结论 RPA可以扩增出未经前处理(核酸提取)的样本,具有快速简便的优点,为检测烟曲霉菌提供了一个有效的工具.
关键词： 重组酶聚合酶扩增技术 烟曲霉菌 DNA提取 快速检测 -
烟曲霉菌引起肺部严重感染1例分析
1 临床资料患者,男,30岁,农民.于2个月前无明显诱因出现乏力、纳差,腹胀及右上腹部隐痛,同时伴有巩膜黄染、尿色茶黄等症状,当时检验肝功能异常,乙肝标志物阳性,诊断为"乙肝",在当地县医院经"中西医"对症治疗无效.为进一步诊治于2002年2月20日转入我院.查体:慢性病容,全身皮肤及巩膜重度黄染,肝掌、蜘蛛痣阳性.心肺(-).肝区叩击痛(+),腹水症(++).血像:BPC 39×109/L,HB 128 g/L,WBC 11.3×109/L,N 0.81,L 0.10,M 0.09.生化:ALT 179U/L,AST 179U/L,TBIL 137.5μmol/L,DBIL 139.0μmol/L.PT 28.3 s.B超示:肝弥漫性损害,胆囊炎,大量腹水.门诊以慢性(重型)乙型病毒性肝炎收入传染科.入院后无菌抽取腹水作细菌培养,结果阴性.第5天患者出现咳嗽及痰中带血,随给予头孢塞肟、阿米卡星、氧氟沙星药物等进行抗炎治疗,但效果不理想,患者呼吸道症状逐渐加重.
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烟曲霉菌致曲霉性肺炎1例
近年来随着医院感染菌种的不断变迁、大量抗生素的广泛应用,全身性曲霉菌感染呈显著增高趋势,而由气管镜刷片培养检出烟曲霉菌引起的曲霉性肺炎更为少见.我院在2003年1月份由支气管镜刷片检出1例烟曲霉引起的曲霉性肺炎,现报道如下.
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胸腔积液培养检出烟曲霉菌1例
随着临床广谱抗菌药物、激素、免疫抑制剂的大量应用,骨髓和器官移植以及介入性治疗的开展,侵袭性曲霉菌病逐渐增多,同时侵袭性曲霉菌病也越来越引起重视.现将我院患者胸腔积液中分离出1例烟曲霉菌报道如下.
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抗烟曲霉单克隆抗体用于侵袭性烟曲霉感染病原学检测的实验研究
目的 探讨自行研制的抗烟曲霉单克隆抗体在兔侵袭性烟曲霉感染动物模型中的应用.方法 建立兔侵袭性烟曲霉感染动物模型;用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测兔血清中烟曲霉抗原;以免疫酶组织化学方法检测兔肺、肝、脾、肾组织中烟曲霉抗原.结果 血清中烟曲霉抗原检测:接种烟曲霉抗原后24、48、72、96 h,血清中烟曲霉抗原检测阳性;免疫酶组织化学检测:接种后96 h,肺、肝、脾、肾组织免疫酶组织化学染色均为阳性.结论 抗烟曲霉单克隆抗体在侵袭性烟曲霉感染的病原学诊断中有较大的应用前景.
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烟曲霉菌临床分离株生物膜形成能力与基因分型研究
目的：探讨烟曲霉菌临床分离株生物膜（BF）形成能力与基因型的关系，了解医院侵袭性烟曲霉菌感染的流行趋势，为医院烟曲霉菌及其BF相关感染的防治提供分子流行病学依据。方法收集2012年10月－2014年2月由医院各临床科室送检标本中分离的42株烟曲霉菌，96孔板法体外构建BF，结晶紫染色法测定BF形成能力，扫描电镜（SEM）观察并证实BF形成，对所有受试菌株进行随机扩增多态性DNA（RAPD）分型及聚类分析，比较菌株的同源性及不同基因型BF形成能力的差异。结果受试的42株烟曲霉菌中34株形成BF，占81．0％；RAPD方法可将全部受试菌株分为7个基因型：Ⅰ～Ⅶ，其中Ⅱ型17株占40．5％，为优势菌株；Ⅰ型2株、Ⅲ型7株、Ⅳ型7株、Ⅴ型2株、Ⅵ型6株、Ⅶ型1株；不同基因型菌株的BF形成能力不同（P＜0．05），其中Ⅵ型BF形成能力较强，Ⅳ型较弱。结论大多数烟曲霉菌临床分离株具有BF形成能力，不同基因型的烟曲霉菌株BF形成能力存在差异，院内侵袭性烟曲霉菌感染主要由Ⅱ型克隆株水平传播引起；建立医院烟曲霉菌BF形成能力检测和RAPD基因分型体系，对预防控制烟曲霉菌感染具有重要意义。
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阿利新兰刚果红染色法在烟曲霉菌生物膜胞外多糖染色中的应用研究
目的：研究烟曲霉生物膜中胞外多糖染色的新方法，评价阿利新兰刚果红染色对烟曲霉胞外多糖染色的可靠性。方法将烟曲霉受试菌株的浓度为1×105孢子／m l的孢子悬液1ml ，加入到24孔的组织培养板中的无菌玻璃细胞爬片上，37℃孵育，分别在孵育的不同时间用阿利新兰刚果红复合染色染胞外多糖，在光镜下观察曲霉生物膜胞外多糖的变化，与电镜下观察到的生物膜胞外基质相比较。结果阿利新蓝刚果复合染色后光镜下观察发现，菌丝被染成蓝色，胞外多糖为深红色；第8小时孢子萌芽，第12小时菌丝延长，第16小时菌丝的周围开始出现深红色的胞外多糖，第20小时深红色的菌丝之间有深红色的胞外多糖，第24小时深红色的胞外多糖布满载体表面，第48小时菌丝基本完全被胞外多糖包裹；整个生长过程与扫描电镜观察生物膜变化的结果完全相符。结论用阿利新兰刚果红染色观察烟曲霉生物膜胞外多糖简单、可靠、重复性好，适用于临床检验和实验室研究。
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双重荧光定量聚合酶链反应检测烟曲霉菌与黑曲霉菌的临床应用
目的 建立检测烟曲霉菌和黑曲霉菌的双重荧光定量聚合酶链反应方法,探讨其临床应用价值,为快速准确地鉴定侵袭性曲霉菌寻求新的检测技术.方法 设计可扩增烟曲霉菌和黑曲霉菌18s RNA引物和探针,建立双重荧光定量聚合酶链反应体系并进行方法学评价；选取45例临床确诊的侵袭性真菌感染(IF)患者和20例阴性健康对照者的全血,应用本方法对以上两种真菌进行DNA检测；结果与常规鉴定方法比较,评估该方法的敏感性和特异性.结果 对于纯化后的烟曲霉菌和黑曲霉菌DNA,该方法的敏感性为1拷贝,特异性达到100％,批内和批间试验均显示了较好的重复性；临床标本检测结果显示,该方法与常规方法比较,敏感性和特异性均为100％.结论 应用双重荧光定量聚合酶链反应方法同时检测烟曲霉菌和黑曲霉菌具有良好的敏感性、特异性和重复性,与常规鉴定方法结果相符,有利于烟曲霉菌和黑曲霉菌感染的早期快速诊断和实现对进展期感染者的动态监测.
关键词： 双重荧光定量聚合酶链反应 烟曲霉菌 黑曲霉菌 -
真菌不同接触方式对自然杀伤细胞表面受体表达的影响
目的 本研究通过Transwell隔离培养体系探讨烟曲霉菌、白色念珠菌的不同菌体形态及不同接触方式对脐血来源细胞因子诱导自然杀伤(NK)细胞表面受体表达的影响,揭示NK细胞抗真菌与抗肿瘤作用机制的异同.方法 利用聚碳酯膜孔径0.4μm的Transwell隔离培养系统,将实验组分为直接混合培养组(即直接接触组)和隔离组(即间接接触组)；将NK细胞与真菌(烟曲霉菌孢子或菌丝、白色念珠菌孢子或菌丝)、K562细胞按10:1比例进行直接混合和隔离培养,每组3个重复孔；培养6h后通过流式细胞仪检测各组NK细胞胞膜受体NKG2D、TLR2及CD94/NKG2A的表达.结果 烟曲霉菌、白色念珠菌的孢子和菌丝的直接接触作用均可上调NK细胞表面受体TLR2的表达(P值均＜0.05),但间接接触作用对TLR2的表达无影响(P值均＞0.05),真菌的直接、间接接触作用对NKG2D、CD94/NKG2A的表达均无影响(P值均＞0.05)；与K562细胞的直接接触可上调NK细胞表面受体NKG2D的表达(P值＜0.05),但对TLR2、CD94/NKG2A的表达无影响(P值均＞0.05).结论 真菌可以直接接触作用的方式通过上调TLR2的表达激活NK细胞,这与肿瘤细胞激活NK细胞的方式不同；真菌及肿瘤细胞的刺激均对NK细胞胞膜受体CD94/NKG2A的表达无影响.
