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  • 慢病毒介导的RNA干扰技术应用于抑制黑色素瘤细胞转移的特异性研究

    作者:徐薇;杨超;鲁巧云;张帆;宁四清;李兆元

    目的 应用慢病毒介导的RNA干扰技术,对该技术能特异性的抑制黑色素瘤细胞转移进行研究.方法 以人巢蛋白(Human nestin)的信使RNA编码序列作为干扰靶点,把慢病毒基因PLL3.7作为质粒载体,人巢蛋白的“短发夹”RNA(shRNA)表达质粒和阴性对照shRNA表达质粒(不包含所有已知信使RNA),分别感染黑色素瘤细胞株UACC903细胞并流式分选获得高纯度的巢蛋白干扰或对照组细胞.用划痕法检测评估各组黑色素瘤细胞迁移能力.结果 巢蛋白下调的UACC903细胞侵袭能力和迁移能力均下降(P<0.05).结论 慢病毒介导的RNA能有效地沉默巢蛋白基因的表达,从而能特异性的抑制黑色素瘤细胞迁移.

  • 微小RNA及RNA干扰技术在胃癌治疗中的应用进展

    作者:丁俊杰;魏鹤松;王笑天;常子雨;杨磊;朱丽华

    微小RNA(miRNA),广泛存在于真核生物中的一类长度约21ˉ25nt的非编码调控单链小分子RNA,可以对细胞的增殖、分化和凋亡等过程起到调控作用,在胃癌的发生发展过程中起到了相当于促癌基因和抑癌基因的作用.随着阻抑基因表达研究的发展,RNA干扰(RNAi)技术被提出,即向细胞中导入双链RNA,通过其与内源性RNA特异地结合,阻碍特定基因的翻译或转录,进而抑制基因的表达.逐渐深入分子机制研究的背景下,各种肿瘤研究中已经开始应用RNA干扰技术,尤其是胃癌治疗中,其应用前景十分广阔.

  • RNAi技术与基因治疗

    作者:信吉伟;王晓洪

    RNA干扰(RNAi)是由特定双链RNA(dsRNA)引发的转录后基因沉默,广泛存于在真菌、植物和动物中.RNAi技术是近年来迅速发展起来的高效、特异、易操作的基因阻断技术,在基因治疗中有广阔的应用前景,并将极大地促进基因治疗的发展.

  • RNA干扰技术新进展

    作者:王世瑶;刘燕鹰;穆荣;栗占国

    20世纪90年代初,科学家在矮牵牛花中导入与花青素合成有关的查尔酮合成酶基因,原以为转基冈的牵牛花会变得更鲜艳,结果却发现一些花反而变成白色,这种现象引起人们的高度关注,之后的研究将这种过度表达内源基因而引发的基因沉默称为共阻遏.

  • RNAi技术对改善小鼠呼吸道合胞病毒感染后气道炎症的研究

    作者:李娜;夏天;周燕明;崔玉霞

    目的 探讨小鼠呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染后气道的炎症反应以及采用小分子RNA技术(smallinterference RNA,siRNA)治疗对气道炎症的改善作用。方法 采用针对RSV -M2基因的特异性siRNA滴鼻治疗RSV感染的RALB/c鼠,通过显微镜观察支气管肺泡灌洗液(BALF)白细胞计数及ELASA方法检测BALF中细胞因子IFN-γ、IL-12和IL-10水平的变化情况。结果 RSV感染后,BALF白细胞总数显著增加,分类以淋巴细胞为主;细胞因子IFN-γ、IL-12和IL-10水平升高;siRNA治疗后,白细胞总数、淋巴细胞、百分数随着siRNA浓度的增加而下降。IFN-Y、IL-12和IL-10水平随着siRNA浓度的增加而下降,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 RSV感染小鼠后,气道发生炎症反应;siRNA技术能够减轻RSV感染后的气道炎症反应。

  • RNA干扰技术在急性脊髓损伤早期治疗中的应用

    作者:罗武;张春强

    RNA干扰(RNA interference, RNAi)是通过正反义RNA片段形成的双链RNA(double - stranded RNA, dsRNA)特异性地抑制靶基因转录后的表达,引起基因表达沉默的一种现象[1].

  • 高容量血液滤过对多器官功能障碍综合征犬内质网应激标志蛋白Caspase-12基因水平及表达的影响

    作者:马林;郭雯;刘新华;阿尔帕提·阿不力提步;隋晓露;努尔孜叶·阿布里克木;胡磊;周小佳;阿依古丽·那斯木

    目的 探讨高容量血液滤过(HVHF)治疗多脏器功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)对内质网应激相关性细胞凋亡及应激标志蛋白Caspase-12基因水平及表达的影响,并探讨高容量血液滤过(high volume hemofiltration,HVHF)治疗MODS的机制.方法 经二次打击建立犬MODS模型.分HVHF组和MODS组,于术前(T1)、内毒素注射完后Oh (T2)、6h (T3)、12h(T4)及24h(T5)留血标本.体内实验:应用荧光定量PCR法检测肝、肾及肺组织Caspase 12mRNA基因表达水平.体外实验:2组血清体外诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)建立内质网应激凋亡模型.测定siRNA干扰前后Caspase-12mRNA基因表达、蛋白表达及内皮细胞凋亡率.结果 体内实验:与MODS组相比,HVHF组肾、肺组织Caspase-12mRNA基因表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),而肝组织Caspase-12mRNA基因表达水平无明显差异(P>0.05).体外实验:干扰前与MODS组相比,HVHF组在T2-T5 HUVECs Caspase-12mRNA基因表达水平、Caspase-12蛋白表达水平及细胞凋亡率均明显降低,差异有统计学意义(P<0.01).干扰后2组HUVECs Caspase-12mRNA基因表达水平、Caspase-12蛋白表达水平及细胞凋亡率均较干扰前显著降低,差异有统计学意义(P<0.01). 结论 内质网应激凋亡信号通路在MODS演进过程中占重要地位,经过HVHF治疗后内质网应激(ERS)凋亡信号通路中的关键蛋白Caspase-12基因表达、Caspase-12蛋白表达水平及细胞凋亡率均明显下降,此作用有助于减轻机体细胞凋亡程度,有效地救治MODS.而RNA干扰(RNAi)技术有望成为治疗MODS新的治疗靶点.

  • 基因沉默多囊蛋白1和水通道蛋白2对多囊肾囊肿衬里上皮细胞增殖及基质分泌的影响

    作者:江德文;周姗姗;许艳芳;潘阳彬;李桂芬;付槟槟;万建新

    目的 观察沉默多囊蛋白1(PC-1)和水通道蛋白2(AQP-2)的表达对人常染色体显性遗传性多囊肾囊肿衬里上皮细胞(WT9-12)增殖和基质分泌的影响.方法 采用RNA干扰技术(RNAi)特异性抑制PC-1和AQP-2的表达,噻唑蓝法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测WT9-12细胞凋亡和周期的变化,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定分析细胞基质分泌的变化.结果 实验表明,下调细胞中PC-1的表达,在转染24、48、72和96 h后,对WT9-12细胞增殖的抑制率分别为12.55%,17.79%、24.69%和35.81%;而下调AQP-2表达,转染72和96 h后抑制率为6.77%和8.73%.流式细胞术检测发现下调PC-1可使细胞被阻滞在G0/G1期,并诱导细胞凋亡,而下调AQP-2表达对细胞周期和凋亡无明显的影响;ELISA检测发现沉默AQP-2的表达能抑制Ⅰ型胶原的分泌(5.53±1.72)比(9.04±2.83)μg/L,P<0.05].结论 应用RNAi可通过下调PC-1的表达抑制WT9-12细胞增殖,并诱导细胞凋亡;而下调细胞AQP-2的表达则可抑制细胞基质Ⅰ型胶原的分泌抑制肾囊肿的发生发展.

  • RNAi抑制结肠癌细胞系DcR3的表达及对癌细胞生长的影响

    作者:王鲁平;杨善明;徐学明;陈健;杨光之;张鲁榕

    目的:观察抑制DcR3基因表达的人SW480结肠癌细胞其恶性表型的改变.方法:应用RNA干扰(RNAi)技术,构建小双链DNA,克隆入表达载体,转染进入SW480结肠癌细胞系(DeR3高表达细胞),在细胞内形成小干扰双链RNA;识别并降解DcR3 mRNA.筛选DcR3低表达转染癌细胞,观测其体外DcR3.SW480-RNAi转染细胞的增长率及凋亡表达.结果:与对照组相比,转染DcR3-RNAi(F1R1)的WS480细胞,DcR3 mRNA的表达明显降低,各组相比,加入DcR3-RNAi(F1R1)组的SW480细胞数量明显减少,而仅加入DcR3及对照组细胞数量明显增加.统计学处理差异显著(P<0.001).与对照组相比,经DcR3-RNAi处理组凋亡抗体Caspase3及PARP产物表达增加.结论:经转染的DcR3-RNAi-SW480结肠癌细胞其DcR3 mRNA表达降低.肿瘤细胞的生长数量减少,凋亡增加,有一定可探索性抗癌前景.

  • RNA干扰沉默信号转导及转录激活因子1与支气管哮喘

    作者:贾晓琴;熊瑛

    RNA干扰(RNA interfering,RNAi)是由双链RNA介导的序列特异性转录后的基因沉默现象,是生物界一种古老而进化上高度保守的基因表达调节机制.随着分子生物学理论与技术研究的不断深入,近几年利用RNAi技术特异性剔除或关闭特定基因表达而防治疾病成为医学界研究的热点.信号转导及转录激活因子1(signal transduction and activator of transcription-1, STAT1)是一种能被多种配体激活而使相关免疫应答基因表达的转录因子.STAT1的激活可诱发支气管哮喘气道的炎症和气道高反应性.利用RNAi技术沉默STAT1基因表达,阻止气道变应性炎症反应,对防治支气管哮喘的发生发展具有重要的临床意义.

  • RNA干扰技术阻抑热休克蛋白对瘢痕疙瘩生成的影响

    作者:金培生;陈俊杰;岑瑛;张爱君;陶常波;李雪扬

    目的 利用RNA干扰(RNAi)技术,通过热休克蛋白47重组质粒(HSP47 siRNA)和脂质体的混合液,对瘢痕疙瘩裸鼠动物模型的体内干预后,分析HSP47基因在瘢痕疙瘩生成中的作用.方法 构建裸鼠瘢痕疙瘩动物模型,于第16天腹腔麻醉后在实验组瘢痕疙瘩内注射质粒、脂质体混合液0.25 ml,对照组裸鼠腹腔注射磷酸缓冲液(PBS)0.25 ml,原笼饲养,7 d回收标本,分别做mRNA水平检测,胶原蛋白水平检测以及免疫组织化学检测.结果 实验组 HSP47 mRNA表达明显降低,且实验组总胶原含量,Ⅰ型胶原蛋白 mRNA表达与对照组比较也明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 利用RNAi技术,通过过HSP47 siRNA表达载体特异性沉默瘢痕疙瘩中HSP47基因表达后,瘢痕疙瘩中胶原蛋白的合成和分泌均能得到明显抑制,表明HSP47基因具有促进瘢痕疙瘩生成作用,为抑制瘢痕疙瘩提供新的靶点.

  • HDAC6小分子RNA对子宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制

    作者:秦海霞;任艳芳;杨君;华方方;梁武凤;陈友国;潘莹

    宫颈癌的发生位居女性肿瘤的第3位,每年全球范围大约有371 200例新病例被诊断,由于其高达51%的病死率而成为公众关注的健康问题[1].然而,目前对于宫颈癌的治疗主要是基于铂类药物为基础的化疗以及手术和放疗,这些治疗的效果十分有限[2].组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)6属于Ⅱ型HDAC家族,在所有的18个HDAC家族成员中,HDAC6具有独特的结构和生物学特性,即具有两个功能性的去乙酰化结构域和一个锌指基序,这两个功能性的去乙酯化结构域是HDAC6发挥生物学活性所必需的[3-4].目前,越来越多的研究显示,HDAC6与肿瘤的发生、发展关系密切,包括卵巢癌[5]、小儿急性髓细胞样白血病[6]、神经母细胞瘤[7]、胃癌和结肠癌[8]等.本研究利用RNA干扰技术探讨HDAC6表达下调对宫颈癌细胞系HeLa细胞增殖和细胞凋亡的影响,并初步探讨其相应的分子机制.

  • 应用RNA干扰技术研究AKT和ERK2基因对子宫内膜癌细胞自噬活性的影响

    作者:魏清;万小云

    自噬是真核细胞蛋白质降解的主要途径,参与调控细胞的生长.研究发现,自噬活性的变化与恶性肿瘤的发生、发展有关[1-2],子宫内膜癌细胞的自噬活性明显减弱[3].另有报道,在子宫内膜癌中存在AKT和ERK2基因的高表达[4].迄今,有关AKT和ERK2基因对子宫内膜癌细胞自噬活性是否具有调节作用仍然不清楚.

  • MED19基因对体内胃癌细胞增殖抑制作用机制的探讨

    作者:丁相福;王婷婷;许崴崴;袁伟杰;徐广甍;魏士雄

    目的 探讨MED19基因靶向RNA干扰重组慢病毒载体对体内胃癌组织抑制的机制.方法 对3组(control组、negative组及shRNA组)完成胃癌成瘤实验的裸鼠离体的胃癌组织SGC-7901细胞分别采用实时聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)法检测胃癌组织细胞中MED19基因的沉默效率,研究MED19基因沉默在胃癌SGC-7901细胞成瘤小鼠胃癌组织细胞增殖中的作用,采用噻唑蓝(MTT)法检测MED19基因沉默对小鼠胃癌组织细胞增殖的影响,并用流式细胞术检测MED19基因沉默后对胃癌组织细胞增殖周期的影响.结果 shRNA组裸鼠胃癌组织SGC7901细胞中MED19蛋白的表达水平低于negative组和control组(P﹤0.05);与control组和negative组相比,shRNA组裸鼠胃癌组织SGC-7901细胞的增殖能力在第3~5天降低(P﹤0.05);shRNA组胃癌组织SGC-7901细胞的G1期细胞所占比例高于control组和negative组(P﹤0.05).结论 MED19基因靶向RNA干扰重组慢病毒载体对胃癌SGC-7901细胞成瘤小鼠胃癌组织细胞的增殖和细胞周期均有明显影响.

  • siRNA靶向沉默COX-2对宫颈癌细胞VEGF、EGFR表达的影响

    作者:陈杰;王莉;王俊岭;王慧

    目的 探讨siRNA靶向沉默环氧合酶-2(COX-2)基因对宫颈癌HeLa细胞血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)表达的影响.方法 以人宫颈癌HeLa细胞为研究对象,采用COX-2 siRNA转染HeLa细胞作为转染组,以未转染的HeLa细胞作为空白对照组,以阴性对照siRNA转染HeLa细胞作为阴性对照组.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测COX-2、VEGF、EGFR基因的表达水平,蛋白质印迹法(Western blot)检测COX-2、VEGF、EGFR蛋白的表达水平,MTT法检测细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,Tran-swell小室检测细胞的迁移和侵袭能力.结果 RT-PCR结果显示,转染组的COX-2、VEGF、EGFR基因表达水平均低于空白对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05).Western blot结果显示,转染组的COX-2、VEGF、EGFR蛋白表达水平均低于空白对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05).MTT检测结果显示,转染组的细胞增殖抑制率高于空白对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05).流式细胞仪检测结果显示,转染组的细胞凋亡率高于空白对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05).Transwell小室检测结果显示,转染组的细胞穿透率低于空白对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05).结论siRNA靶向沉默COX-2基因能够抑制HeLa细胞中VEGF和EGFR的基因及蛋白表达水平,促进HeLa细胞凋亡,抑制HeLa细胞增殖,降低HeLa细胞的迁移及侵袭能力.

  • DcR3-RNAi对人SW-480结肠癌细胞系恶性表型的影响

    作者:王鲁平;陈健;杨光之;杨善明;徐学明;张鲁榕

    目的:观察研究抑制DcR3基因表达的人SW480结肠癌细胞其恶性表型的改变.方法:应用RNA干扰(RNAi)技术,构建小双链DNA,克隆入表达载体,转染进入SW480结肠癌细胞系(DcR3高表达细胞),在细胞内形成小干扰双链RNA;识别并降解DcR3 mRNA.筛选DcR3低表达转染癌细胞,3H观测其体外DcR3-SW480-RNAi转染细胞的增长率及凋亡表达.结果:转染的DcR3-SW480-RNAi-F1R1细胞可降低DcR3 mRNA的转录,凝胶电泳反应产物显示与对照组相比,DcR3-SW480-RN-Ai-F1R1细胞组条带明显减弱;3H掺入细胞的定量分析显示DcR3-RNAi-SW480结肠癌细胞的数量明显减少,P<0.001;Western 印记检测显示凋亡抗体Caspase-3及PARP表达增加.结论:经转染的DcR3-RNAi-SW480结肠癌细胞其DcR3 mRNA表达降低.肿瘤细胞的生长数量减少,凋亡表达增加, 有一定可探索性抗癌前景.

  • RNA干扰技术裸鼠体内沉默缺氧诱导因子1α的表达对宫颈癌的抑瘤效应

    作者:江敬红;王卓然;蒋丽;鲍燕;程艳香

    目的 观察体内沉默缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的表达后对宫颈癌的抑瘤效应,并探讨其可能的机制.方法 将实验用宫颈癌Siha细胞分为空白对照组(转染空载体)、无关对照组(转染无关对照质粒)和实验组(稳定转染pU-HIF-1α-shRNA的真核表达载体),接种裸鼠,建立裸鼠荷瘤模型,观测HIF-1α-shRNA对裸鼠皮下移植瘤的生长抑制作用.采用免疫组化SP法和Western blot 法,检测HIF-1α和葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)蛋白在肿瘤组织中的表达.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,检测HIF-1α、GLUTI和己糖激酶Ⅱ(HKⅡ)mRNA的表达.采用酶显色法,检测肿瘤组织中的乳酸含量.采用原位末端标记(TUNEL)法,检测细胞凋亡.结果 实验组裸鼠肿瘤的生长速度较空白对照组和无关对照组明显减慢(P<0.05).接种50 d后处死裸鼠,实验组裸鼠的肿瘤重量为(1.90±0.28)g,也明显轻于空白对照组[(2.95±0.77)g]和无关对照组[(2.54±0.56)g,P<0.01].实验组肿瘤组织中HIF-1α mRNA和蛋白的相对表达量分别为0.45±0.04和1.25±0.92,GLUT1mRNA和蛋白的相对表达量分别为0.32±0.02和1.25±0.48,均明显低于空白对照组和无关对照组(均P<0.05).实验组中HK Ⅱ mRNA和乳酸的含量均明显低于空白对照组和无关对照组(均P<0.05),但凋亡细胞数较空白对照组和无关对照组明显增多(均P<0.01).结论 以HIF-1α为靶点的基因治疗,可通过下调靶基因GLUT1和HKⅡ的表达来降低宫颈癌Siha细胞的糖酵解水平,促进肿瘤细胞凋亡,从而发挥抑制宫颈癌生长的作用.

  • RNA干扰抑制人牙周韧带细胞S100A4基因的表达

    作者:赵彬;吕婧;李霞

    目的 研究RNA干扰技术(RNAi)下调牙周韧带(PDL)细胞中钙结合蛋白S100A4的表达,获得稳定的细胞单克隆,拟为后续试验提供细胞水平平台.方法 利用RNAi技术,针对人cDNA序列设计了S100A4干扰序列及一个阴性对照,将其连接到RNA干扰载体pGenesil-1上.转染人PDL细胞,通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测有干扰序列的有效性.结果 干扰片段转染72 h后的mRNA抑制效率为67.83%.结论 RNAi可以有效抑制PDL细胞中S100A4的基因表达,为进一步研究S100A4在PDL细胞中的功能提供新的思路.

  • 靶向白血病特异性转录调节因子融合蛋白siRNA的研究进展

    作者:赵午莉;邵荣光

    白血病是血液系统的恶性疾病.在各种致癌因子的作用下,血细胞分化受阻且增生能力增强,导致血细胞无限增生且替代了原有的正常细胞,诱发了白血病.与大多数实体瘤不同,超过50%的白血病病例有明显的特异染色体改变,比如染色体异位和翻转,而且白血病和实体瘤相比具有更强的变异基因稳定性.以上两点表明,靶向特异肿瘤基因的分子治疗对白血病来讲比实体瘤更有前景.由于RNA干扰技术能使特异基因降解,高效抑制特异基因的表达,而不影响正常基因的功能,因此采用siRNA对血液肿瘤的研究已有不少报道.

  • 乙型肝炎治疗研究进展

    作者:甘平;彭芳

    乙性肝炎病毒感染所导致的慢性肝炎是我国的一个大问题,给患者及社会带来了很大负担.慢性乙型肝炎现行治疗主要依靠干扰素、核苷类似物等,其存在高耐药、低耐受以及不良反应等问题.新的、更为安全有效的治疗药物及方法亟待发展.近,科学家们发现人体内的TRIM22分子对抑制乙肝病毒的复制起到重要作用,为乙肝的治疗及有效药物的研发开辟了新的道路.

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