一氧化氮在弓形虫感染中的作用

弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种人畜共患、传播广泛、专门寄生在有核细胞内的机会性致病原虫.一般寄生于脑、肌肉等细胞中,可长期甚至终生寄生在宿主体内,是爱滋病患者、器官移植患者等免疫功能受累或受抑制宿主并发症甚至死亡的重要原因之一(Luft et al.,1992).弓形虫速殖子和缓殖子的转换是其机会性致病的中心环节.目前对速殖子和缓殖子的转换机制还未完全了解,但已发现一些线索.其中一氧化氮(nitric oxide,NO)在弓形虫感染中被认为起着至关重要的作用.

激光照射对弓形虫速殖子作用的流式细胞分析

用流式细胞术(FCM)检测分析了激光照射对弓形虫RH株速殖子的作用.结果显示,激光照射后弓形虫速殖子群体DNA含量分布发生改变, DNA含量的第1道数峰值(平均值)左移,第1峰值分布范围内速殖子数占总速殖子数百分率增加,3.5 W和4.5 W剂量照射组与对照组相比差异存在显著性(P<0.05).提示激光照射能抑制弓形虫DNA的合成,减少弓形虫群体DNA的含量.

氯喹治疗小鼠弓形虫感染的实验观察

目的研究和探索治疗弓形虫病新的有效药物,并揭示其治疗机理.方法用弓形虫Rh株感染昆明小鼠,设计氯喹治疗组、甲硝唑组及对照组,观察对比.扫描电镜及透射电镜下观察对比各种情况下弓形虫的超微结构变化.结果按照疗效判定标准,氯喹治疗小鼠弓形虫感染有效,而甲硝唑无效.扫描电镜观察发现, 氯喹治疗组中弓形虫速殖子有聚集、粘连,虫体大小不均,表面皱缩,形态不规则.透射电镜观察对照组大量有核细胞内有弓形虫侵入并增殖,以一个细胞内3～4个弓形虫速殖子者多见.氯喹治疗组中少数组织细胞内有弓形虫侵入,且细胞内仅有1个弓形虫速殖子;大部分弓形虫细胞膜及核膜均有破损,破膜从头、尾两端开始;弓形虫内脂肪空泡及线粒体数量较对照组明显减少,棒状体断裂.结论氯喹是一种非常有效的治疗小鼠弓形虫病药物.其治疗机理是破坏弓形虫的细胞膜及核膜,降低其攻击有核细胞的能力,阻断其在细胞内的增殖,且造成代谢紊乱.

ERK1/2信号途径与弓形虫侵入细胞及胞内增殖关系的研究

目的:探讨阻断细胞外蛋白调节激酶(ERK1/2)信号途径对弓形虫速殖子侵入宿主细胞及在胞内增殖的影响.方法:姬氏染色法检测ERK1/2途径不同时间及不同剂量的抑制剂U0126或PD98059作用下宿主细胞感染弓形虫速殖子的百分率,根据细胞感染率和感染细胞内虫荷量分析ERK1/2途径抑制剂对速殖子在细胞中增殖的影响.结果:速殖子在细胞培养系统中以1、10和100/μmol/L U0126或PD98059作用3h、6h和9h后,前者细胞培养孔中的细胞感染率分别较对照组平均下降34.62%(P<0.01),53.55%(P<0.01)和67.76%(P<0.01),后者分别较对照组平均下降22.67%(P<0.01)、52.21%(P<0.01)和58.99%(P<0.01);感染细胞感染速殖子率与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论:阻断ERK1/2途径的不同信号位点对弓形虫速殖子侵入宿主细胞影响不同,ERKl/2途径在速殖子侵入宿主细胞起主要作用,但对侵入后的增殖无明显影响.

新孢子虫速殖子在HCT-8、Vero和Hela细胞中培养的比较

目的 观察和比较新孢子虫速殖子在人结肠癌细胞(HCT-8)、人宫颈癌细胞(Hela)和非洲绿猿肾细胞(Vero)中的生长情况.方法 分别用HCT-8、Hela和Vero细胞(RPMI-1640培养基)连续培养新孢子虫速殖子9d,观察并计数速殖子数量,绘制生长曲线;4d取培养物作吖啶噔染色,用激光共聚焦显微镜观察速殖子.结果 新孢子虫速殖子用HCT-8、Vero和Hela细胞培养均生长,尤以在HCT-8和Vero细胞中生长较快,第6d虫体数达到高峰,且在HCT-8中高峰期可持续2d,在Vero中生长高峰可持续1d.在Hela细胞中速殖子生长较慢,虫体数量一直处于较低水平.吖啶噔染色观察,HCT-8和Vero细胞中纳虫泡较大且速殖子数量较多,Hela细胞内纳虫泡较小且速殖子数量较少.结论 新孢子虫速殖子在HCT-8细胞中生长较快,纳虫泡较大且速殖子数量较多.HCT-8细胞可以替代Vero细胞用于速殖子的体外培养.

刚地弓形虫速殖子表面抗原研究进展

刚地弓形虫是猫科动物的肠道球虫,由法国学者Nicolle及Manceaux在刚地梳趾鼠单核细胞内发现,虫体呈弓形.

弓形虫动物转种条件的研究

弓形虫病是一种人兽共患寄生虫病,人群与动物的弓形虫感染率很高.有关弓形虫在实验动物体内传代、虫株分离以及致病力等方面的研究虽有报道[1～3],但鼠龄、接种途径对感染小鼠生存时间的影响,以及感染时间与收虫数量的关系的报道甚少.为了全面了解弓形虫动物转种的影响因素,本文用胰蛋白酶消化与不消化法收集的弓形虫速殖子、不同虫数经不同途径接种,以及感染不同龄鼠,观察了感染小鼠的存活时间及不同感染时间收虫量的动态变化,为弓形虫生物学、免疫学和分子生物学的研究奠定基础.

家蝇幼虫抗菌肽对弓形虫速殖子DNA的损伤作用

目的 从家蝇幼虫血淋巴中分离纯化出有抗弓形虫作用的抗菌肽,观察其对弓形虫速殖子DNA的损伤作用.方法 通过损伤加感染的方法诱导家蝇幼虫大量表达抗菌肽,然后经过研磨、离心和层析等过程,分离纯化并筛选出抗弓形虫作用的抗菌肽,采用流式细胞术(FCM)分析其对弓形虫速殖子DNA含量的影响.结果 通过DNA含量直方图可以看出,实验组的速殖子数少于对照组,且两组分布参数存在较明显差异.正常的弓形虫速殖子处于M1期的较M2期的少,抗菌肽组则相反,处于M1期的较M2期的多,且M1峰值明显前移.结论 家蝇幼虫血淋巴中存在抗弓形虫作用的抗菌肽,其可通过抑制弓形虫DNA的合成杀伤弓形虫.

弓形虫感染对大鼠雄性生殖系统及其胎鼠发育影响的实验研究

本研究以大鼠为实验对象,探讨弓形虫感染对雄性生殖系统的影响及其可能的致病机理.以2×105/ml活的纯化弓形虫速殖子悬液(CF-11纤维素纯化)腹腔接种成年雄性SD清洁级大鼠2 ml,至感染第9周,解剖大鼠,检测血清性激素、睾丸精子数、精子活率、活力、精子质量、睾丸酶活性及睾丸组织的病理学损害等.并且对弓形虫感染大鼠雄性生育力进行研究,即弓形虫感染后第9天与正常成年雌鼠按1∶2合笼交配1周,于交配的第2天早晨开始检查阴道,以发现阴栓和查到精子为妊娠0天.

弓形虫主要表面抗原的研究进展

弓形虫生活史有无性繁殖与有性生殖两个世代.存在形式有滋养体、包囊、卵囊、配子体、裂殖体,滋养体包括速殖子、缓殖子,它们在分子学上有一些共同成份:表面抗原(surface antigen,SAG),微线体蛋白(microneme protein,MIC)、棒状体蛋白(rhoptryprotein,ROP),致密颗粒抗原(densegranulesantigen,GRA)等,但两者的部分成分存在着期特异性.缓殖子除了和速殖子共享些抗原外,尚发现一些其本身特异性抗原.

槐果碱的体外抗弓形虫作用

[目的]评估槐果碱的体外抗弓形虫作用.[方法]采用CCK-8法测定槐果碱对HeLa细胞的毒性和对弓形虫选择性作用的效果,光学显微镜下观察细胞形态变化,应用台盼蓝拒染法检测活细胞百分比.[结果]槐果碱浓度为500 μmol/L时,对HeLa细胞有明显的抑制作用;槐果碱体外抗弓形虫作用的选择性指数为0.96,效果低于乙胺嘧啶(1.77),但优于螺旋霉素(0.73);给予200 μmol/L槐果碱治疗24 h后,HeLa细胞破损程度明显降低,细胞内外速殖子数量显著减少,且在10～200 μmol/L浓度范围内时活细胞比例随给药浓度的增加而明显上升.[结论]槐果碱在体外表现出良好的抗弓形虫活性,且对弓形虫感染的HeLa细胞具有一定程度的保护作用.

人巨噬细胞和人包皮成纤维细胞体外培养弓形虫速殖子

目的 比较弓形虫RH株速殖子在人巨噬细胞和人包皮成纤维细胞内的增殖情况. 方法 按照弓形虫速殖子∶细胞为1∶1的比例将弓形虫RH株速殖子分别与人巨噬细胞和人包皮成纤维细胞共培养0、6、12、24、48 h后,于显微镜下观察细胞内虫体增殖情况.在两种细胞培养瓶中分别接种弓形虫RH速殖子,连续传代,每隔10代取弓形虫速殖子,将其密度调整为1×107个/ml,0.3 ml/只,腹腔接种ICR健康小鼠,记录小鼠存活时间. 结果 在相同条件下弓形虫速殖子侵入人巨噬细胞的时间早于侵入人包皮成纤维细胞的时间;共培养48 h时,绝大部分弓形虫速殖子胀破细胞,游离在细胞外.在两种细胞培养瓶中分别接种3×106弓形虫RH速殖子,约72 h后均可获得大量游离的弓形虫速殖子,2～3d传1代.人巨噬细胞内连续传代约30次,每代可获得(1×107～4×107)个速殖子,约增殖3～13倍;人包皮成纤维细胞中连续传代30次,每代可获得(1×107～3×107)个速殖子,约增殖3～10倍.弓形虫速殖子传代次数为10、20和30代时,人巨噬细胞内传代的弓形虫速殖子接种小鼠的存活时间分别为(4.3±0.5)、(4.0±0.8)、(4.3±1.2)d,人包皮成纤维细胞内传代的弓形虫速殖子接种小鼠的存活时间分别为(4.0±0.0)、(3.7±0.9)、(4.3±0.5)d,各代之间差异无统计学意义(P＞0.05),弓形虫速殖子毒力未见明显改变. 结论 弓形虫RH株速殖子可在人巨噬细胞和人包皮成纤维细胞内增殖并长期稳定传代.

弓形虫速殖子和缓殖子相互转换机制的研究进展

弓形虫在中间宿主内以速殖子和缓殖子两种滋养体形式存在.其机会性致病与速殖子和缓殖子之间的互相转换密切相关,揭示此转换机制将有助于寻找更有效的途径以控制弓形虫的急性和慢性感染.本文对近年来有关这种转换机制的研究进展加以综述.

153用于竞争性RT-PCR评估刚地弓形虫速殖子-缓殖子相互转换的多竞争体的构建与验证

金丝桃素体外抗刚地弓形虫速殖子效果的观察

目的 观察金丝桃素对体外培养的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株速殖子的杀伤作用,探讨金丝桃素抗弓形虫的效果. 方法 将生理盐水(A组)和终浓度为5 μg/ml(B组)、50 μg/ml(C组)、500 μg/ml(D组)的金丝桃素分别加入含弓形虫速殖子1×106个/孔的24孔培养板中,于2、4、6h后收集虫体,台盼蓝染色检测速殖子着色率,吉氏染色观察速殖子形态和结构变化,透射电镜观察速殖子超微结构的变化,流式细胞仪检测相同处理的携带黄色荧光蛋白的弓形虫的存活情况. 结果 弓形虫速殖子经不同浓度金丝桃素作用2h后,B组、C组和D组虫体的台盼蓝着色率分别为(11.0±3.6)％、(25.0±6.3)％和(40.0±2.7)％,D组着色率高于C组和B组(P＜0.01),3组均高于A组(6.0±3.0)％,但B组和A组间差异无统计学意义(P＞0.05).作用4h后,D组着色率为(97.0±2.0)％,高于C组(30.0±7.2)％、B组(20.0±3.0)％和A组(10.0±1.0)％(P＜0.01);作用6h后,D组着色率为(98.0±1.7)％,亦高于C组(42.7±5.5)％、B组(34.0±6.6)％和A组(19.3±4.9)％,两两比较,各组间差异均有统计学意义(P＜0.01).吉氏染色观察发现,随时间的延长和剂量的增高,虫体两端逐渐变圆、肿胀、坏死.透射电镜观察结果显示,随金丝桃素作用时间延长,虫体逐渐肿胀,胞膜与基质间出现明显空隙,虫体内空泡增多、变大,胞膜破裂,内部结构溶解.流式细胞仪检测结果表明,弓形虫速殖子存活率在金丝桃素作用后的各时间段内与对照组间差异有统计学意义(P＜0.01);金丝桃素作用2h后,D组无弓形虫存活,C组弓形虫存活率为(7.9±1.9)％,低于B组(38.1±5.5)％和A组(81.8±6.0)％(P＜0.01);作用4h后,C组无弓形虫存活;B组在作用4h和6h后,弓形虫存活率分别为(14.3±7.9)％和(1.4±1.8)％,均低于A组的(73.8±11.3)％和(64.1±14.4)％(P＜0.01). 结论 金丝桃素具有较强的体外抗弓形虫速殖子效果,且随剂量增高和作用时间延长抗虫效果更明显.

右旋松萝酸体外抗弓形虫速殖子的实验研究

目的 探索右旋松萝酸在体外抗RH株弓形虫速殖子的效果.方法 实验设右旋松萝酸组、乙酰螺旋霉素组、二甲基哑砜(DMSO)组及生理盐水对照组,前两组分别再设4个浓度组,于1 ml弓形虫速殖子悬液(1×106个/ml)中分别加入终浓度为5、10、25和50 μg/ml右旋松萝酸或乙酰螺旋霉素;后两组分别加入等体积的牛理盐水和1%DMSO;每组15管.作用1、2和4 h后,取弓形虫悬液涂片,台盼蓝染色,光镜观察记数.将各组作用4 h的弓形虫悬液洗涤后,接种昆明小鼠,作冉转种试验,观察弓形虫速殖子复苏情况.同时将洗涤后的虫体接种丁制备的SD大鼠心肌成纤维细胞.观察虫体侵袭力.结果 10、25和50 μg/ml右旋松萝酸组作用4 h,弓形虫速殖子台盼蓝着色率达100%,部分虫体肿胀,两端变圆,细胞质内出现颗粒,细胞核深染.各浓度的乙酰螺旋霉素组弓形虫速殖子变化与右旋松萝酸组相似.仪50 μg/ml组作用4 h后台盼蓝着色率达100%.再转种试验结果显示右旋松萝酸组仅5 μg/ml组小鼠于接种后第8～9天死亡,腹腔液见大量弓形虫速殖子;其余各组小鼠大多存活至再次转种,且腹腔液均末见弓形虫速殖子.但乙酰螺旋霉素各浓度组小鼠均于接种后6～8 d死亡,腹腔液见大量虫体及假包囊.右旋松萝酸5 μg/ml组,弓形虫速殖子侵入大鼠心肌成纤维样细胞,会形成假包囊,其余组均为阴性.但乙酰螺旋霉素、生理盐水和DMSO组速殖子对大鼠心肌成纤维细胞均有不同程度感染.结论 右旋松萝酸在体外有较强的抗弓形虫速殖子作用.

一氧化氮供体对弓形虫速殖子DNA含量的影响

目的探讨亚硝基铁氰化钠(SNP)对弓形虫速殖子DNA含量的影响.方法采用SNP与影响胞内/胞外钙离子浓度的试剂作用于RH株刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)速殖子,流式细胞仪检测其DNA含量的变化.结果①SNP导致弓形虫速殖子DNA的损伤,并呈时间和剂量依赖性;②2mmol/L胞外钙离子螯合剂EGTA,25μmo1/L胞内钙离子螯合剂BAPTA/AM及50μmol/L钙离子拮抗剂verapamil单独处理弓形虫速殖子,其DNA含量与对照组相比无显著变化;③2 mmlol/LEGTA,25μμmqol/LBAPTA/AM及50 μmol/Lverapamil明显减少2 mmol/LSNP所致的速殖子亚二倍体峰的比例.结论SNP通过改变弓形虫速殖子胞浆游离钙离子浓度,诱导其亚二倍体峰的出现,造成虫体的损伤.

应用双向电泳及蛋白质印迹分析弓形虫特异性抗原

将感染弓形虫速殖子的SD大鼠血清和健康大鼠血清作为一抗进行蛋白质印迹(Western blotting)分析,比较杂交蛋白点的差异,分析弓形虫速殖子特异性抗原.弓形虫速殖子总蛋白双向电泳考马斯亮蓝染色图谱(7 cm×8 cm,pH 3～10)共检测到209个蛋白质斑点.Western blotting显示实验组抗原抗体反应点17个,对照组仅2个非特异性的蛋白结合点.

弓形虫速殖子和缓殖子相互转换机制的研究进展

弓形虫是广泛分布的机会性致病原虫,速殖子和缓殖子之间的相互转换是其致病的中心环节.速殖子引起的急性感染可被宿主正常的免疫系统所抑制,从而转变为代谢、增殖缓慢的缓殖子,并以包囊的形式继续存在于脑、肌肉和视网膜等细胞中,形成隐性感染.当宿主免疫功能下降时,包囊中的缓殖子则可变为代谢旺盛、增殖迅速的速殖子,引起组织破坏,形成局部炎症,如慢性脑炎和视网膜脉络膜炎等,如不及时治疗,可直接导致这类免疫功能受累患者(如爱滋病患者及器官移植患者)的死亡[1,2].

人包皮成纤维细胞和人子宫颈癌细胞体外培养弓形虫速殖子

目的 比较弓形虫RH株速殖子在人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblast,HFF)和人子宫颈癌(HeLa)细胞的感染和细胞内增殖情况.方法 分别于含一盖玻片的细胞培养皿(35 mm)内培养HFF细胞和HeLa细胞.待形成单细胞层后各加入经3 μm滤膜纯化的弓形虫RH株速殖子共培养,分别于0.5、1、2、4、8、12、24、36、48、72和96 h取出盖玻片,经吉氏染色镜下观察速殖子在两种细胞内的增殖情况.结果 与HFF细胞共培养4 h后.速殖子即可侵入HFF细胞,1个细胞内可见数十个速殖子;24 h可见明显的假包囊,72 h细胞被胀破.而与HeLa细胞共培养8 h后速殖子才侵入细胞,每个细胞内可见3～5个速殖子,48 h形成假包囊,96 h大部分细胞被胀破. 结论 弓形虫RH株速殖子可在HFF细胞和HeLa细胞内增殖,在HFF细胞内的增殖速度快于HeLa细胞.