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乙醇抑制大鼠原代肝细胞中P70S6K和ERK1/2活性
目的 研究乙醇对原代肝细胞中P70S6K和ERK1/2活性的影响.方法 分离成年雄性SD大鼠的肝细胞,分别以0、50、100和200 mmol/L的乙醇处理4 h,或以200 mmol/L乙醇处理0、1、2和4h,用Western blot法检测P70S6K 和ERK1/2的活性.在细胞中加入100 nmol/L的mTOR特异抑制剂雷帕霉素或10 μmol/L的MEK1/2特异抑制剂U0126,培养24 h后收集细胞,用Western blot法检测P70S6K、ERK1/2及PPARγ的表达；用EMSA检测PPARγ的活性.结果 随着乙醇浓度的增加或处理时间的延长,P70S6K的表达逐渐降低；乙醇也可抑制ERK1/2的活性；U0126同时抑制ERK1/2和P70S6K的活性,而雷帕霉素虽抑制P70S6K的活性,但增强ERK1/2的活性；乙醇不影响PPARγ的表达和活性.结论 在大鼠原代肝细胞,乙醇对P70S6K的活性有抑制作用,且存在量效关系和时效关系.P70S6K的活性受ERK1/2的控制,但P70S6K也可反向调节ERK1/2.
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ERK1/2信号途径与弓形虫侵入细胞及胞内增殖关系的研究
目的:探讨阻断细胞外蛋白调节激酶(ERK1/2)信号途径对弓形虫速殖子侵入宿主细胞及在胞内增殖的影响.方法:姬氏染色法检测ERK1/2途径不同时间及不同剂量的抑制剂U0126或PD98059作用下宿主细胞感染弓形虫速殖子的百分率,根据细胞感染率和感染细胞内虫荷量分析ERK1/2途径抑制剂对速殖子在细胞中增殖的影响.结果:速殖子在细胞培养系统中以1、10和100/μmol/L U0126或PD98059作用3h、6h和9h后,前者细胞培养孔中的细胞感染率分别较对照组平均下降34.62%(P<0.01),53.55%(P<0.01)和67.76%(P<0.01),后者分别较对照组平均下降22.67%(P<0.01)、52.21%(P<0.01)和58.99%(P<0.01);感染细胞感染速殖子率与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论:阻断ERK1/2途径的不同信号位点对弓形虫速殖子侵入宿主细胞影响不同,ERKl/2途径在速殖子侵入宿主细胞起主要作用,但对侵入后的增殖无明显影响.
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苦参碱对人横纹肌肉瘤RD细胞增殖及凋亡的影响
目的 探讨苦参碱(Ma)对人横纹肌肉瘤(RMS)细胞RD增殖及凋亡的影响.方法 取对数生长期的细胞,分为对照组(无Ma);Ma组:Ma终浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL;U0126(MAPK抑制剂)组:U0126为10μmol/L;Ma联合U0126共同作用组:U0126均为10 μmol/L,Ma浓度同Ma组;每组设5个复孔.给予相应药物作用后,采用倒置显微镜观察细胞形态学变化;四甲基氮唑蓝(MTT)比色法检测RD细胞的增殖抑制率;流式细胞仪(FCM)检测凋亡率.结果 药物作用后显微镜下可见细胞数目减少,细胞变小、变圆,随着Ma作用浓度的增加,RD细胞凋亡细胞逐步增多;Ma与U0126联合作用后,凋亡细胞明显增多,MTT比色法检测其抑制率按分组顺序分别为(13.39±1.13)%、(23.49±0.39)%、(38.84±0.35)%、(48.05±0.82)%、(63.47±1.35)%、(13.91±0.63)%、(24.52±0.46)%、(39.82±0.58)%、(48.98±0.31)%和(65.09±0.85)%;流式细胞仪检测其凋亡率按分组顺序分别为(5.49±0.96)%、(14.23±0.70)%、(25.84±4.17)%、(36.08±3.68)%、(42.53±2.71)%、(6.72±1.52)%、(17.23±3.42)%、(27.83±1.29)%、(38.25±1.44)%和(47.79±1.35)%;除U0126组外,其余各组与对照组比较差异均有显著性(P<0.05).结论 苦参碱单独或与U0126共同作用RD细胞,可抑制该细胞的增殖,促进其凋亡,在本实验范围内浓度越高这种抑制增殖、诱导凋亡的作用越明显.
关键词： 苦参碱 人横纹肌肉瘤RD细胞 U0126 增殖率 凋亡率 -
ERK1/2通路抑制对生长激素垂体腺瘤GH3细胞增殖的影响
目的 观察ERK1/2通路抑制剂U0126对大鼠生长激素垂体腺瘤GH3细胞增殖的影响,以探索ERK1/2通路作为生长激素腺瘤潜在治疗靶点的可行性.方法 将大鼠GH3细胞分为对照组和U0126组,U0126组给予不同剂量(10、20、40nM)的U0126,对照组给予等体积二甲基亚砜(DMSO).细胞增殖实验(MTS法)检测细胞活力的变化;凋亡试剂盒检测细胞凋亡水平,Western-blot检测p-ERK1/2蛋白的水平.结果 与对照组相比,不同剂量U0126处理24 h的GH3细胞细胞活力分别下降14％、15％和19％;48h下降19％、28％和36％;72 h下降24％、37％和52％.处理72 h后,U0126组膜联蛋白V(Annexin V)阳性细胞占总细胞数的比率分别为5.3％、11.4％和18.5％;碘化丙啶(PI)阳性细胞的比率分别为3.7％、7.3％和10.5％.处理24 h后U0126不同剂量组ERK的磷酸化蛋白表达水平呈下降趋势,40 nM组为对照组的41.7％,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 ERK1/2通路抑制剂可以诱导大鼠GH3细胞凋亡,抑制细胞增殖.
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U0126对急性白血病细胞HL-60增殖与凋亡的影响
目的:探讨U0126对急性白血病细胞HL-60增殖与凋亡的影响.方法:用不同浓度(0、5、10、20 μmol/L)的U0126处理HL-60细胞24、48、72 h,MTT法检测细胞活力,Hoechst染色检测细胞形态,EdU染色检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,Western blot检测细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)、生存素(Survivin)、p21和p27表达及细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化水平.结果:5、10、20 μmol/L的U0126处理HL-60细胞24、48、72 h,能显著提高细胞增殖抑制率(P<0.01),具有时间与剂量依赖性(r=0.421、0.478).与0 μmol/L比较,5、10、20 μmol/L的U0126能使细胞核发白,致密浓染,细胞增殖率降低(P<0.01),细胞周期阻滞在G1期(P<0.01),PCNA、Survivin及p-ERK1/2表达均下调(P<0.01),p21与p27表达均上调(P<0.01).结论:U0126能显著抑制白血病细胞HL-60增殖,诱导细胞凋亡.
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在肿瘤细胞模型中联合应用磷脂酰肌醇3激酶/蛋白酶B通路抑制剂BEZ235和细胞外调解蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶通路抑制剂U0126的效果
目的 探讨通过联合应用磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白酶B(AKT)通路抑制剂BEZ235和细胞外调解蛋白激酶(ERK)通路抑制剂U0126抑制膜受体酪氨酸激酶/PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路与ERK/丝裂原活化蛋白激酶通路对细胞增殖的影响.方法 以磷酸酶和张力蛋白同源物缺失(PTEN-/-)的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)系作为研究对象,联合应用PI3K、mTOR双重抑制剂BEZ235及ERK激酶抑制剂U0126,通过MTT和Western blot方法检测药物对细胞增殖的影响.结果 BEZ235及U0126对PTEN-/-MEF细胞均有抑制作用,二者半数抑制浓度分别为6.257 nmol/L及22.85 μmol/L.但联合应用BEZ235与U0126,二者表现为拮抗的作用方式.结论 在PTEN缺失的细胞系中或PTEN突变的肿瘤的联合靶向治疗中,不推荐应用BEZ235与U0126联合使用.
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ERK/MAP激酶抑制剂U0126增强索拉菲尼对原代胃癌细胞的抑制效应
目的:研究ERK/MAP激酶抑制剂U0126是否增强索拉菲尼对原代胃癌细胞的抑制效应,并探索其可能机制.方法:选取病理确诊胃癌患者外科手术标本培养原代胃癌细胞.使用索拉菲尼和U0126分别或同时处理原代细胞.MTT试验检测处理后细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Q-PCR和Western Blotting分别检测转录水平和翻译水平增殖和凋亡相关分子的表达情况.结果:使用索拉菲尼和U0126同时处理的原代胃癌细胞,其增殖明显受到抑制,凋亡增加,并均强于单独处理组.同时处理组中p-ERK和p-Raf表达水平降低,Bim、Bax和Bad水平升高,水平变化均强于单独处理组,P＜0.01.结论:U0126能够增强索拉菲尼抑制胃癌细胞增殖和促进细胞凋亡的效应,其机制可能是二者在抑制ERK/MAPK通路及诱导Bcl-2家族中促凋亡分子表达上有协同效应.
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U0126在A549肺腺癌细胞凋亡中的作用
目的:探讨ERK信号通路抑制剂U0126与A549肺腺癌细胞凋亡的关系.方法:选用不同浓度的ERK信号通路抑制剂U0126(10μMU0126、20μMU0126和40μMU0126)作用于A549细胞,采用流式细胞术和TUNEL原位末端标记法检测细胞的凋亡情况.结果:U0126阻断ERK信号通路后,细胞凋亡率明显增加,各实验组明显高于对照组(P＜0.01),但20μM U0126组与40μM U0126组间无明显差异(P＞0.05).结论:ERK信号传导通路与A549肺腺癌细胞的凋亡有关,但A549肺腺癌细胞凋亡是受多因素的调控.
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细胞外信号调节激酶1/2抑制剂U0126上调脑缺血再灌注小鼠海马微管结合蛋白2的表达
目的 探讨细胞外信号调节激酶(ERK)1/2抑制剂U0126对脑缺血再灌注损伤小鼠海马微管结合蛋白2(MAP-2)表达的影响.方法 健康昆明小鼠150只,随机分为假手术组、缺血再灌注组和U0126组,每组50只,各组再根据缺血后再灌注的时间点细分为6、12、24、48和72h5个亚组.利用免疫组织化学方法和Western blot方法检测MAP-2在各组小鼠海马的表达变化,同时应用TUNEL法检测各组小鼠海马细胞的凋亡情况.结果 与假手术组相比,缺血再灌注组小鼠海马MAP-2的表达在6h时已经明显降低,24 h达低值,而在72 h略有回升(P＜0.01);与相同时间点的缺血再灌注组小鼠相比,U0126组小鼠海马MAP-2的表达明显升高(P＜0.01),而且海马细胞的凋亡情况明显好转(P＜0.01).结论 U0126能够上调脑缺血再灌注损伤小鼠海马MAP-2的表达,减少脑缺血再灌注损伤海马神经细胞的凋亡.
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黄芩素和U0126体外协同抗人膀胱癌细胞的作用及机制研究
目的:探讨黄芩素和U0126体外协同抗人膀胱癌T-24细胞的作用及机制研究.方法:用黄芩素、U0126及二者联合处理T-24细胞,流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡;显微镜下计数细胞数量变化;TUNEL法检测细胞凋亡指数;实时定量PCR和Western blot分别检测T-24 细胞胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2) 、CyclinD1、GSK-3β和AKT RNA水平、蛋白水平,分析黄芩素与U0126对膀胱癌细胞凋亡和增殖的影响.结果:T-24细胞经不同浓度黄芩素处理后, 细胞凋亡率显著增加;T-24细胞经黄芩素处理24 h,G0/G1 期细胞比例明显增多,S 期细胞比例明显下降,细胞数减少,采用黄芩素联合U0126 处理T-24细胞24 h,S 期细胞比例显著降低;黄芩素或U0126单独处理T-24细胞引起明显细胞凋亡,二者联合处理凋亡更明显;利用两种药物单独或联合作用T-24细胞24 h,GSK-3β、ERK1/2、AKT磷酸化水平显著降低, ERK1/2、CyclinD1的 mRNA表达减少,联合处理作用更显著.结论:黄芩素和U0126 均可诱导T-24细胞凋亡,增加G0/G1 期细胞比例,降低S 期细胞比例,联合应用效果更明显.
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黄芩素和U0126体外抗人乳腺癌的作用及机制研究
目的：：探讨黄芩素和U0126体外对乳腺癌的作用及其机制。方法：用黄芩素、U0126单独处理以及二者联合处理人乳腺癌细胞株MCF-7细胞,采用CCK8检测细胞增殖变化；流式细胞术检测MCF-7细胞周期以及凋亡变化；显微镜观察细胞数量变化；TUNEL法检测细胞凋亡改变；划痕实验分析细胞迁移情况； Western blot实验检测细胞凋亡相关因子的蛋白水平变化,分析黄芩素与U0126对乳腺癌细胞的增殖、凋亡和迁移的影响。结果：黄芩素或U0126可抑制细胞的增殖且具有浓度依赖性(P<0.05)；黄芩素阻滞MCF-7细胞周期进入S期,增加G0~G1期细胞比例(P<0.05),降低S期细胞比例(P<0.05),诱导细胞凋亡(P<0.05)；降低ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化水平和CyclinD1的蛋白水平表达；黄芩素与U0126联合处理MCF-7细胞,与黄芩素单独处理组相比较,S期细胞比例明显降低( P<0.05),细胞凋亡更加明显( P<0.05), ERK1/2和JNK的磷酸化水平(P<0.05)、CyclinD1的蛋白表达量降低更加明显(P<0.05)；同时黄芩素可有效抑制人乳腺癌细胞株MCF-7细胞的迁移(P<0.05)。结论：黄芩素和U0126通过降低ERK1/2、JNK的磷酸化水平表达,降低CyclinD1的水平表达,有效抑制MCF-7细胞增殖和迁移,诱导MCF-7细胞凋亡并且二者具有协同作用。因此,黄芩素和U0126联合有望用于临床治疗乳腺癌。
关键词： 黄芩素 U0126 人乳腺癌细胞株MCF-7 凋亡 迁移 -
磷酸化ERK1／2对帕金森病模型小鼠黑质半胱氨酸蛋白酶－3表达的影响
目的：研究磷酸化ERK1／2（p－ERK1／2）对1－甲基－4－苯基－1，2，3，6四氢吡啶（MPTP）所致帕金森病（PD）模型小鼠黑质中半胱氨酸蛋白酶（ caspase）－3的调控作用。方法建立PD小鼠模型，观察小鼠行为学变化；免疫组化和免疫印迹法检测黑质酪氨酸羟化酶（ TH）、caspase－3和p－ERK1／2的阳性细胞数和蛋白表达水平以及caspase－3酶活性改变，并观察给予p－ERK1／2特异性抑制剂U0126对上述变化的影响。结果与对照组相比，模型小鼠出现典型PD 症状， TH 蛋白水平下降约28．2％（ P＝0．009）， p－ERK1／2、caspase－3阳性细胞及蛋白水平显著增加（ P＜0．01）；经ERK1／2抑制剂U0126处理后，上述变化均显著减轻（ P＜0．01）。结论 P－ERK1／2对 MPTP 诱导的 PD 小鼠黑质 caspase－3表达可能有调控作用， U0126对PD小鼠具有一定的神经保护作用。
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磷酸化ERK1/2在6-OHDA致PC12细胞损伤中的作用
目的 观察细胞外信号调节激酶( ERK1/2)在6-OHDA致PC12细胞损伤的帕金森(PD)细胞模型中所起的作用.方法 6-OHDA处理体外培养的PC12细胞株,建立PD细胞模型.MTT法检测6-OHDA对PC12细胞活力的影响,免疫印迹法研究p-ERK1/2蛋白表达随时间变化的趋势,并检测ERK1/2上游激酶抑制剂PD98059和U0126对6-OHDA诱导ERK1/2磷酸化及凋亡的影响.结果 PC12细胞随6-OHDA作用时间的增加,p-ERK1/2出现表达升高；PD98059和U0126明显抑制6-OHDA所致的ERK1/2磷酸化,明显减低了细胞损伤的程度.结论 在6-OHDA介导的多巴胺神经元损伤中呈现ERK1/2磷酸化,抑制ERK1/2可以6-OHDA引起的PC12细胞损伤,该过程可能在调控PD多巴胺能细胞损伤中起重要作用.
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U0126对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖、迁移及侵袭的影响
[目的]探讨U0126对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖、迁移及侵袭的影响.[方法]用不同浓度MEK/ERK抑制剂U0126(25,50,100 μmol/L)处理Tca8113细胞24,48,72 h,采用MTT法检测细胞增殖抑制情况,划痕实验检测细胞迁移距离,Transwell实验检测48 h时的细胞侵袭率,细胞免疫荧光染色和Western blot法检测48 h时的细胞ERK1/2,p-ERK1/2,MEKK1,p-MEKK1在细胞内定位和蛋白表达情况及E-cadherin和Vimentin表达水平.[结果]U0126对细胞的增殖、迁移和侵袭具有明显的抑制作用(P＜0.01),且呈现出浓度和时间依赖性;细胞中磷酸化的ERK1/2主要表达在细胞核膜和核内,U0126对磷酸化的ERK1/2表达具有明显的抑制作用(P＜0.01);与对照组比较,U0126各剂量组E-cadherin蛋白表达水平均明显升高(P＜0.01),而Vimentin蛋白表达水平明显降低(P＜0.01),且均呈现出浓度依赖性.[结论] U0126可抑制Tca8113细胞的增殖、迁移和侵袭,其机制认为可能与抑制ERK1/2活化、促进E-cadherin表达及抑制Vimentin表达有关系.
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U0126在胰腺癌细胞解离中作用机制的实验研究
胰腺癌具有很强的侵袭转移能力,因此开发针对侵袭、转移的新型治疗方法将有助于提高胰腺癌的治疗效果.癌细胞从原发部位解离、游走是癌细胞侵袭、转移过程中为关键的第一步[1].
关键词： 胰腺肿瘤 细胞解离 U0126 丝裂原活化蛋白激酶激酶-2 -
CAR的表达调节对肝癌基因治疗中腺病毒载体感染效率的影响
目的:通过抑制Raf-MEK-ERK信号转导途径调节肝癌细胞表面柯萨奇病毒和腺病毒受体(coxsackie-adenovirus receptor,CAR)的表达,探索肝癌基因治疗中CAR表达与腺病毒(adenovirus,Ad)感染效率之间的关系.方法:选择两株人肝癌细胞株SMMC-7721及HepG2,以Raf-MEK-ERK信号转导抑制剂U0126作用后,应用Western blotting检测细胞表面CAR蛋白的表达水平.选用能表达GFP的非复制型E1A缺陷的Ad感染人肝癌细胞SMMC-7721及HepG2,应用FACS分析U0126处理前后Ad感染效率的变化.结果:细胞经MEK抑制剂U0126处理后,细胞膜表面CAR的表达呈明显上调趋势.FACS检测显示,经U0126处理后,在相同感染复数(10 MOI)Ad-GFP的感染下,GFP+细胞率明显升高,SMMC-7721细胞由(71.65±6.21)%上升至(86.54±5.70)%;HepG2细胞由(77.53±4.62)%上升至(87.06±2.83)%(均P<0.05).结论:抑制剂U0126抑制Raf-MEK-ERK信号转导途径后,可上调肝癌细胞膜表面CAR的表达,从而导致Ad在肝癌细胞感染效率的提高.
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MEK抑制剂阻断小鼠脑缺血后ERK通路的激活和IL-1βmRNA合成
目的研究细胞外信号调节激酶(ERKs)在脑缺血中的作用以及U0126对缺血脑组织保护作用的机制.方法线栓法制作小鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,颈内静脉注射U0126;Western blot法和免疫组化法检测pMEK、pERK1/2和pElk-1;核糖核酸酶保护测定法检测IL-1βmRNA含量.结果注射U0126后的MCAO小鼠pMEK活性降低,其降低幅度与U0126有剂量依赖的关系,并在缺血前给药有效;U0126注射后pERK1/2和pElk-1也表现出相似的下降变化.小鼠MCAO后1到2 h IL-1βmRNA水平上升;而注射U0126后IL-1βmRNA在MCAO后1至4h内下降.结论ERK在小鼠脑缺血中发挥重要作用.静脉注射MEK抑制剂U0126可阻断脑缺血引起的pMEK、pERK1/2和pElk-1的活性增加.U0126通过阻断ERK通路进而降低IL-1βmRNA而对缺血脑组织产生保护作用.
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细胞外信号调节激酶在局灶性脑缺血中的作用
目的研究细胞外信号调节激酶(ERK)在局灶性脑缺血中的作用.方法线栓法制作小鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型.通过Western blot和免疫组织化学方法研究磷酸化ERK1/2的活性特征.静脉内应用ERK通路阻滞剂U0126,测定缺血小鼠的神经系统损害和脑梗死体积的改变.结果MCAO后30min,磷酸化ERK1/2在局灶缺血小鼠脑组织中显著升高,2 h达到高峰,6 h恢复.免疫组化研究显示磷酸化ERK1/2阳性细胞在梗死基底节和周围皮质大量出现.荧光双染提示磷酸化ERK1/2阳性的细胞为神经元和星形细胞.与对照组相比,注射U0126的脑缺血小鼠神经损伤评分降低44.6%,梗死体积降低54.4%.结论ERK在小鼠局灶性脑缺血中起着重要的作用,阻断ERK通路对缺血性脑损伤有一定保护作用,并可能成为脑缺血治疗的新途径.
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sunitinib对人气道平滑肌细胞增殖、迁移和ERK磷酸化的影响
目的:探讨sunitinib对血小板源性生长因子(platelet-derived growthfactor,PDGF)-BB刺激的人气道平滑肌细胞(human airway smooth muscle cells,HASMCs)增殖和迁移的影响,及其对细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinases,ERK)信号通路的干预作用.方法:体外培养HASMCs分为6组:对照组、PDGF-BB组、sunitinib与PDGF-BB联合干预组、sunifinib组、U0126组、PDGF-BB与U0126联合干预组.流式细胞术检测HASMCs细胞周期,Transwell法观察细胞迁移,Westernblot法检测ERK的磷酸化.结果:与对照组相比,PDGF-BB(20 ng/ml)显著诱导HASMCs增殖和迁移(P＜0.01),sunitinib(3nmoL/L)显著抑制PDGF-BB诱导的HASMCs的增殖和迁移,其作用与U0126相当(P＞0.05).PDGF-BB组ERK磷酸化水平较对照组明显增高(P＜0.01).sunitinib干预后可使PDGF-BB诱导的ERK磷酸化程度下降,其对PDGF-BB诱导的ERK磷酸化的抑制作用与ERK特异性拮抗剂U0126对PDGF-BB诱导的ERK磷酸化的抑制作用相当.结论:sunifinib抑制PDGF-BB诱导的HASMCs的增殖和迁移,可能是通过调节ERK通路起作用.
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鞘内注射U0126对吗啡戒断大鼠脊髓神经元Fos表达的影响
目的:研究鞘内注射U0126对吗啡依赖大鼠戒断反应中Fos表达的影响.方法:采用大鼠吗啡依赖及戒断模型,分为正常对照组、吗啡依赖组、吗啡戒断组、U0126组、DMSO组,运用免疫组织化学法(n=6)和Western blot(n=4)方法观察鞘内注射U0126对吗啡戒断大鼠脊髓神经元Fos表达的影响.结果:鞘内注射U0126可明显减少L5节段脊髓背角Fos阳性神经元的数目,U0126组为287±54,低于戒断组380±71,两者差异有显著性(P<0.05).Western blot显示U0126组Fos蛋白的表达与戒断组相比也明显减少.结论:鞘内注射U0126能明显抑制吗啡戒断大鼠脊髓神经元Fos表达.
