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手霉素抗肿瘤及诱导细胞凋亡作用的实验研究
目的 研究手霉素(manumycin)的体外抗肿瘤及其诱导肿瘤细胞凋亡的作用,初步探讨手霉素抗肿瘤作用机制,为将来这种新型药物的抗肿瘤作用开发提供理论基础和临床应用提供试验依据.方法 MTT法检测药效动力学特征;采用Gimsa染色技术、透射电镜技术、流式细胞技术、DNA提取及琼脂糖凝胶电泳技术测定和观察癌细胞凋亡的情况;流式细胞技术检测凋亡相关基因bcl-2、bax表达水平.结果 手霉素抑制细胞生长呈时效和量效关系;Gimsa染色、透射电镜结果 显示手霉素诱导人乳腺癌细胞株MCF-7出现较典型的细胞凋亡形态学变化及超微结构改变;流式细胞分析的DNA直方图上可见G1期峰出现细胞凋亡峰亚G1期峰,乳腺癌细胞的周期也发生了改变,多数细胞被阻滞在G2/M期;琼脂糖凝胶电泳可观察到具有凋亡特征的梯形条带;流式细胞仪分析的实验结果 显示手霉素作用MCF-7细胞前后bcl-2和bax蛋白表达水平无明显改变.结论 (1)手霉素体外具有很强的抗肿瘤作用,可以抑制多种细胞增殖.(2)诱导肿瘤细胞凋亡是手霉素发挥抗肿瘤作用的一条重要途径.经手霉素作用后,肿瘤细胞bcl-2和bax蛋白表达水平无明显变化,手霉素诱导肿瘤细胞凋亡作用并非通过调控bcl-2和bax的表达水平实现.
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靶向Nrf2基因microRNA表达载体构建及初筛
目的 利用真核表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP miR载体构建针对人Nrf2基因的微小RNA( microRNA)真核表达载体,为研究Nrf2基因在化学物毒作用提供参考依据.方法 设计特异性针对Nrf2基因的寡核苷酸序列,构建重组载体并命名为pcDNA-Nrf2-A、pcDNA-Nrf2-B、pcDNA-Nrf2-C、pcDNA-Nrf2-D,转染人乳腺癌MCF-7细胞；通过荧光显微镜观察绿色荧光监测转染效率,转染48 h后用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学检测瞬时转染细胞Nrf2基因mRNA和蛋白的表达变化观察沉默作用来初筛有效的重组载体.结果 成功构建miRNA真核表达载体pcDNA-Nrf2;转染效率约为20% ～40%；瞬时转染重组质粒48 h后,与空白对照和阴性对照质粒比较,pcDNA-Nrf2-A Nrf2 mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05)；pcDNA-Nrf2-B、pcDNA-Nrf2-C、pcDNA-Nrf2-D mRNA表达降低,差异有统计学意义(P ＜0.001),pcDNA-Nrf2-C抑制Nrf2基因mRNA表达强于pcDNA-Nrf2-D(P ＜0.05).结论 成功构建了Nrf2的microRNA表达载体pcDNA-Nrf2-C,可作为进一步研究Nrf2基因功能的工具.
关键词： Nrf2 微小RNA 真核表达载体 人乳腺癌细胞株MCF-7 -
三羟异黄酮拮抗表皮生长因子促乳腺癌细胞增殖
目的通过体外细胞,观察三羟异黄酮(genistein)和表皮生长因子(EGF)对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响.方法用不同剂量genistein、不同剂量EGF、固定剂量genistein和EGF的混合液,作用于体外培养的雌激素受体阳性(ER+)人乳腺癌细胞株MCF-7,作用不同时间后,用噻唑蓝(MTT)法测定细胞生长情况.结果 genistein剂量超过25μmol/L以后对人乳腺癌细胞株MCF-7细胞增殖均有抑制作用,而且随剂量增大和作用时间延长其抑制作用逐渐增强,其中50μ mol/L为适宜浓度,EGF剂量超过4.15 nmol/L以后对人乳腺癌细胞株MCF-7细胞增有明显的促进作用,而且随剂量增大和作用时间延长其作用逐渐增强,其中8.30 nmol/L EGF联合作用于MCF-7细胞,则可显示出两者有交互作用,EGF对细胞的促增殖作用可以被genistein的作用逆转.结论genistein可抑制EGF诱导的人乳腺癌细胞株MCF-7细胞的增殖.
关键词： 三羟异黄酮 表皮生长因子 人乳腺癌细胞株MCF-7 增殖 -
黄芩素和U0126体外抗人乳腺癌的作用及机制研究
目的：：探讨黄芩素和U0126体外对乳腺癌的作用及其机制。方法：用黄芩素、U0126单独处理以及二者联合处理人乳腺癌细胞株MCF-7细胞,采用CCK8检测细胞增殖变化；流式细胞术检测MCF-7细胞周期以及凋亡变化；显微镜观察细胞数量变化；TUNEL法检测细胞凋亡改变；划痕实验分析细胞迁移情况； Western blot实验检测细胞凋亡相关因子的蛋白水平变化,分析黄芩素与U0126对乳腺癌细胞的增殖、凋亡和迁移的影响。结果：黄芩素或U0126可抑制细胞的增殖且具有浓度依赖性(P<0.05)；黄芩素阻滞MCF-7细胞周期进入S期,增加G0~G1期细胞比例(P<0.05),降低S期细胞比例(P<0.05),诱导细胞凋亡(P<0.05)；降低ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化水平和CyclinD1的蛋白水平表达；黄芩素与U0126联合处理MCF-7细胞,与黄芩素单独处理组相比较,S期细胞比例明显降低( P<0.05),细胞凋亡更加明显( P<0.05), ERK1/2和JNK的磷酸化水平(P<0.05)、CyclinD1的蛋白表达量降低更加明显(P<0.05)；同时黄芩素可有效抑制人乳腺癌细胞株MCF-7细胞的迁移(P<0.05)。结论：黄芩素和U0126通过降低ERK1/2、JNK的磷酸化水平表达,降低CyclinD1的水平表达,有效抑制MCF-7细胞增殖和迁移,诱导MCF-7细胞凋亡并且二者具有协同作用。因此,黄芩素和U0126联合有望用于临床治疗乳腺癌。
关键词： 黄芩素 U0126 人乳腺癌细胞株MCF-7 凋亡 迁移 -
木犀草素下调AEG-1和MMP-2的表达对血管生成和乳腺癌细胞侵袭性的抑制作用
本研究探讨木犀草素对乳腺癌细胞增殖及其对血管生成和乳腺癌细胞侵袭性作用的影响.采用MTT比色法检测木犀草素对乳腺癌细胞增殖的作用;鸡胚绒毛尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)模型检测木犀草素对新生血管生成的影响;细胞划痕法检测木犀草素对乳腺癌细胞侵袭性的情况;Westem blot方法检测凋亡抑制基因Bcl-2蛋白、星形胶质细胞升高基因-1 (astrocyte elevated gene-1,AEG-1)蛋白、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)蛋白的表达.实验结果显示,木犀草素以时间和剂量依赖的方式抑制MCF-7细胞增殖,下调Bcl-2蛋白表达;木犀草素能显著抑制CAM中新生血管生成;与对照组相比,60 μmol/L木犀草素作用MCF-7细胞48 h后,其迁移率降低了71.07％(P＜ 0.01),AEG-1和MMP-2蛋白表达量分别下降了82.34％和85.70％ (P＜ 0.05).以上结果表明,木犀草素能有效地抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖,抑制抑癌基因Bcl-2蛋白表达,抑制血管新生和乳腺癌细胞的侵袭,下调AEG-1和MMP-2表达.
关键词： 木犀草素 基质金属蛋白酶-2 人乳腺癌细胞株MCF-7 鸡胚绒毛尿囊膜 -
RNA干扰A20基因的表达对人乳腺癌细胞MCF-7增殖、凋亡和迁移的影响
目的 利用 RNA 干扰技术靶向沉默 A20 基因,对MCF-7细胞株增殖、凋亡和迁移的影响进行研究,探讨A20基因作为乳腺癌治疗靶点的潜在价值. 方法 人工合成靶向A20基因的siRNA序列和阴性对照( NC) siRNA序列,利用脂质体转染技术将siRNA导入MCF-7细胞株,采用CCK-8细胞增殖实验、Annexin V、7-AAD双染流式细胞术检测凋亡实验和 Transwell 细胞迁移实验研究沉默 A20 基因对MCF-7细胞增殖、凋亡和迁移的影响. 结果 靶向沉默A20基因表达能够有效抑制MCF-7 细胞的增殖和迁移,促进细胞凋亡的发生. 结论 A20基因在MCF-7细胞的增殖、凋亡和迁移过程中起重要作用,A20基因可能是针对乳腺癌抗肿瘤靶向治疗的潜在靶点.
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亚高温热疗联合多西紫杉醇对人乳腺癌细胞增殖的影响
目的 观察亚高温热疗联合多西紫杉醇化疗是否具有协同抗肿瘤效应,并探讨其作用机制.方法 首先采用MTT法观察多西紫杉醇对人乳腺癌细胞株MCF-7细胞增殖的影响,并筛选出有效浓度.将体外培养的MCF-7细胞分为空白对照组、多西紫杉醇组及热疗+多西紫杉醇组,热疗+多西紫杉醇组又根据热疗温度(包括39.0℃、39.5℃、40.0℃、40.5℃、41.0℃)不同细分为5个亚组.各组MCF-7细胞分别经相应干预后,利用流式细胞仪检测上述各组细胞凋亡情况及对细胞生长周期的影响.采用Western blotting技术检测各组细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)蛋白、凋亡基因Bcl-2、Bax蛋白、热休克蛋白70(HSP-70)及多药耐药基因(MDR)产物P糖蛋白(P-gp)表达情况.结果 热疗联合多西紫杉醇干预可促进MCF-7细胞凋亡增加,如41.0℃热疗+多西紫杉醇组凋亡率[(37.12±6.73)％]显著高于多西紫杉醇组凋亡率[(19.16±3.42)％];热疗联合多西紫杉醇干预可诱导MCF-7细胞生长周期停滞在G2/M期,如41.0℃热疗+多西紫杉醇组G2/M期细胞比例[(38.18±4.72)％]显著高于多西紫杉醇组[(26.63±4.08)％].热疗+多西紫杉醇组MAPK通路蛋白表达较多西紫杉醇组显著增强,Bcl-2蛋白表达则明显降低,而Bax蛋白表达有轻微升高.热疗+多西紫杉醇组细胞热休克蛋白70(HSP-70)、P-gp蛋白表达均较多西紫杉醇组明显增强.结论 亚高温热疗联合多西紫杉醇干预能抑制人乳腺癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,具有协同抗肿瘤效应,其治疗机制可能与激活细胞外调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38蛋白有关,另外亚高温热疗联合多西紫杉醇干预能增强MCF-7细胞HSP-70及P-gp蛋白表达,这可能会导致肿瘤细胞化疗耐药性产生.
关键词： 亚高温热疗 多西紫杉醇 人乳腺癌细胞株MCF-7 丝裂原活化蛋白激酶 凋亡 -
黄芩素联合U0126诱导人乳腺癌细胞株MCF-7凋亡的分子机制研究
目的 探讨黄芩素和U0126诱导人乳腺癌细胞株MCF-7凋亡的分子机制.方法 单独及联合使用20μmol黄芩素、10 μmol U0126处理MCF-7细胞24 h;光学显微镜观察细胞数量变化,流式细胞术检测MCF-7细胞周期变化,CCK8法检测细胞增殖变化,TUNEL法和流式细胞术检测细胞凋亡,实时聚合酶链反应(Real Time PCR)和Western blot检测凋亡相关因子mRNA和蛋白的表达水平.结果 与黄芩素单独刺激MCF-7细胞相比,黄芩素联合U0126刺激MCF-7细胞时,S期细胞比例降低更明显;MCF-7细胞经不同浓度黄芩素或U0126处理后,增殖抑制,且具有浓度依赖性(P＜0.05);与黄芩素单独处理MCF-7细胞相比,黄芩素与U0126联合处理时,细胞凋亡更加显著(P＜0.05),早期凋亡和晚期凋亡均增多(P＜0.05);与黄芩素或U0126单独处理MCF-7细胞相比,黄芩素和U0126联合处理MCF-7细胞时,凋亡抑制因子Bcl-2的mRNA水平降低(P＜0.05),凋亡促进因子Bax的mRNA水平增高(P＜0.05),ERK1/2、GSK-3β和P38的磷酸化水平降低(P＜0.05),凋亡促进因子Bax表达量增高(P＜0.05),凋亡抑制因子Bcl-2表达量降低(P＜0.05).结论 黄芩素或U0126通过调控Bcl-2/Bax的表达水平以及ERK1/2、GSK-3 β和P38的磷酸化水平抑制MCF-7细胞增殖,促进细胞凋亡,且具有协同效应.因此,黄芩素和U0126可联合用于临床治疗乳腺癌,具有重要临床意义.
关键词： 黄芩素 U0126 人乳腺癌细胞株MCF-7 凋亡 分子机制 -
高良姜素诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡的研究
目的 研究高良姜素促进人乳腺癌细胞株MCF-7的凋亡作用.方法 采用CCK-8法检测高良姜素对MCF-7细胞的增殖抑制作用;以流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot法检测Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP等相关蛋白的表达水平.结果 高良姜素对MCF-7细胞增殖有明显的抑制作用,24 h和48 h的IC50分别为43.71μmol·L-1和20.68μmol·L-1;高良姜素能够诱导MCF-7细胞凋亡,呈浓度依赖关系;高良姜素能上调Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP蛋白的表达,下调Bcl-2蛋白的表达.结论高良姜素对MCF-7细胞增殖有明显的抑制作用,通过线粒体途径调节凋亡相关蛋白的表达水平诱导MCF-7细胞凋亡.
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Rabex-5基因RNAi慢病毒表达载体的构建及其在MCF-7中对Rabex-5表达的影响
目的:构建Rabex-5 RNAi慢病毒表达载体,并转染人乳腺癌细胞株MCF-7,观察其对Rabex-5基因的沉默效应.方法:将设计合成的单链引物退火成双链oligo序列,连接入经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切线性化的pMAGic慢病毒质粒载体中,经转化DH5α感受态细胞并筛选出阳性克隆,测序鉴定.用293FT细胞包装产生慢病毒,感染MCF-7细胞,利用Real-time PCR和Western blot鉴定抑制Rabex-5表达的效果.结果:PCR与测序鉴定证实成功构建了Rabex-5 RNAi的慢病毒载体,转染MCF-7细胞后,与未干扰组和阴性对照组相比,Rabex-5的mRNA和蛋白表达下调,以RNAi3的沉默效应佳.结论:成功构建了Rabex-5 RNAi慢病毒表达载体,其可使MCF-7细胞株Rabex-5表达下调,为进一步研究靶向Rabex-5 RNAi对乳腺癌细胞恶性生物学行为变化及基因治疗研究奠定了实验基础.
关键词： Rabex-5 RNA干扰 慢病毒载体 人乳腺癌细胞株MCF-7
