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A20基因在血管内皮细胞的表达研究
目的探讨外源性A20基因在内皮细胞获得稳定表达的可行性. 方法将N-末端标记E-tag的HA20cDNA重组于pCAGGS真核表达载体,构建了pCAGGSEHA20真核表达重组体.DOTAP脂质体介导的pCAGGSEHA20和pMAMneo基因转染,经G418筛选阳性克隆,再用免疫荧光及分子原位杂交检测A20基因的表达.结果成功构建了pCAGGSEHA20真核表达重组体,A20基因在经G418筛选后的内皮细胞中得到有效表达.结论在DOTAP脂质体介导下,A20基因能够导入内皮细胞并在其内获得表达.
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锌指蛋白基因对内毒素诱导选择素表达的影响
目的探讨外源性A20基因对内毒素诱导的内皮细胞E-选择素表达的影响. 方法 DOTAP脂质体介导的pCNDA3.1 EHA20基因转染人脐静脉内皮细胞,经G418筛选阳性克隆,免疫荧光检测A20基因的表达,原位杂交、免疫荧光及Western blot分别检测内皮细胞E-选择素的表达. 结果 A20基因在经C418筛选后的内皮细胞中有高表达;内毒素能诱导人内皮细胞E-选择素表达;A20基因能抑制内毒素诱导的内皮细胞90%的E-选择素表达,两者间相差显著(P＜0.05). 结论 A20基因能够显著抑制内毒素诱导的内皮细胞活化,有助于创伤的治疗.
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锌指蛋白A20在内毒素所致人脐静脉内皮细胞损伤中的作用
目的探讨外源性锌指蛋白A20对内毒素(LPS)诱导的内皮细胞同型半胱氨酸蛋白酶caspase-3表达和凋亡的影响. 方法 RT-PCR检测A20基因在内毒素诱导内皮细胞中的表达.DOTAP脂质体转染pCDNA3.1EHA20于脐静脉内皮细胞,经G418筛选,A20表达经免疫荧光鉴定.Tunnel原位末端标记法、原位杂交检测转染前后内毒素诱导内皮细胞凋亡情况及caspase-3的表达情况. 结果 A20基因在内毒素诱导的内皮细胞中能表达.正常对照组及转染A20基因组人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡为(5±1)%、(6±1)%,LPS作用后对照组与转染A20基因组凋亡分别为(36±3)%、(10±1)%,两者相差显著(P<0.05).A20基因能显著抑制内毒素诱导的内皮细胞caspase-3的表达. 结论 A20基因在创伤的治疗中可能有一定作用.
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A20基因甲基化对弥漫性大B细胞性淋巴瘤的影响
目的 检测弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)中A20基因甲基化状况,探讨其对DLBCL临床过程及预后的影响.方法 通过组织学观察及免疫表型检测筛选104例DLBCL,收集其临床病理资料及随访;并以甲基化特异性PCR(MSP)法检测A20基因启动子区5CpG岛甲基化的情况;以免疫组化SP法检测肿瘤细胞P糖蛋白(PgP)和Ki-67蛋白的表达.结果 104例DLBCL中,A20基因甲基化率为26％ (27/104),活化后B细胞样(ABC)-DLBCL组甲基化率(35.4％)高于生发中心B细胞样(GCB)DLBCL组(10.2％) (P ＜0.05);PgP阳性率65.4％ (68/104),A20基因甲基化组PgP阳性率(85.2％)明显高于无甲基化组(58.4％)(P＜0.05);A20基因甲基化与非甲基化组之间Ki-67高表达病例与低表达病例均无明显差异(P＞0.05);A20基因甲基化病例的复发率明显高于无甲基化病例(P＜0.05);生存分析发现,两组病例的生存状况差异不显著.结论 DLBCL部分病例存在A20基因甲基化,以ABC-DBLCL病例多见.A20基因甲基化与DLBCL的复发有关,且可能通过NF-κB异常活化而促进肿瘤细胞PgP蛋白表达,从而影响DLBCL的化疗效果.
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A20诱导沉默对鼻咽癌细胞生物学行为的影响
目的 观察A20 基因表达下调对鼻咽癌细胞体内外增殖、侵袭及转移能力的影响.方法 筛选并建立Tet-on基因表达系统诱导A20沉默的鼻咽癌肝转移亚系5-8F-H3细胞系,实时荧光定量PCR、Western印迹检测干扰效率;CCK8法、平板克隆形成实验检测A20对5-8F-H3增殖能力的影响;流式细胞仪检测细胞周期;侵袭小室检测A20对5-8F-H3侵袭能力的影响;裸鼠皮下成瘤实验和体内转移实验检测经强力霉素(DOX)诱导A20基因表达沉默对5-8F-H3在体内增殖及转移能力的影响.结果 可诱导沉默 A20 的鼻咽癌细胞5-8F-H3/A20-shRNA 构建成功.5-8F-H3/A20-shRNA经DOX诱导后,A20基因mRNA及蛋白的表达均下调(均P＜0.01);CCK8法(F＝18.542,P＝0.003)、平板克隆形成实验(F ＝40.080,P ＜0.001)及流式细胞术检测实验(F ＝7.398,P ＝0.024)结果显示A20基因表达下调明显抑制5-8F-H3在体外增殖能力;侵袭小室检测结果显示A20基因表达下调抑制5-8F-H3在体外侵袭能力(F＝26.157,P＜0.001).裸鼠皮下成瘤实验和体内转移实验结果显示A20基因表达下调明显抑制5-8F-H3在裸鼠体内的成瘤和转移能力.结论 A20与鼻咽癌多种恶性生物学行为密切相关,有望成为鼻咽癌潜在治疗靶点.
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一例T细胞淋巴瘤白血病患者A20基因启动子和3'UTR区新突变的鉴定
目的 分析T细胞淋巴瘤白血病患者A20基因非编码区(UTR)突变情况,了解A20基因调控改变特点.方法 利用PCR和核苷酸序列分析方法检测52例T细胞白血病患者和99名健康对照者外周血单个核细胞中A20基因启动子区和3'UTR基因突变.结果 在1例T细胞淋巴瘤白血病患者中,发现其A20基因启动子区存在错义突变(c.-672T＞G),该突变在基因库中已作为单核苷酸多态性登记(rs 139054966),同时发现在A20基因3'UTR mRNA的3916位点存在核苷酸替换(C＞G),而在其他T细胞白血病样本和健康对照组中均未发现这两种改变.结论 首次发现T细胞肿瘤中存在A20基因的rs139054966(c.-672T＞G)和3916(C＞G)改变,前者位于转录因子P53的结合区域,其具体意义有待进一步明确.
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去泛素化酶A20在糖尿病肾病大鼠肾脏及脂多糖诱导的系膜细胞中的表达及变化
目的：观察去泛素化酶A20在糖尿病肾病（DN）大鼠肾脏及脂多糖（LPS）诱导的系膜细胞中的表达变化及可能的作用机制。方法（1）Wistar雄性大鼠30只，随机均分为2组，模型组给予链脲佐菌素（STZ）60 mg/kg腹腔注射建立早期DN大鼠模型；对照组给予60 mg/kg枸椽酸缓冲液腹腔注射。分析2组6、8周时血糖和尿微量白蛋白变化。HE染色分析2个时间点的肾脏病理变化。采用免疫组化检测A20在肾脏中的表达。（2）体外培养肾脏系膜细胞，采用不同时间（0、2、4、6、12、24、48、72 h）和不同浓度（0.1、1、10μg/L）的LPS处理细胞后，检测A20、核因子（NF）-κB、核因子κB抑制因子（IκB）、IκB激酶γ（IKKγ）、单核细胞趋化蛋白（MCP）-1蛋白及基因的表达变化。结果（1）模型组较对照组血糖和尿微量白蛋白含量均升高（均P<0.01）。模型组肾小管上皮细胞呈玻璃样变，8周时更明显。模型组较对照组A20蛋白在肾小管表达明显减弱，而肾小球中基本无表达，8周时表达更少。（2）IKKγ不同浓度与时间下差异均无统计学意义。与0 h相比，2、4 h时A20蛋白和基因水平呈高表达，6 h后表达降低（均P<0.05）；各时间点NF-κB表达水平均较0 h增高，IκB表达均降低（均P<0.05）。A20和IκB的蛋白和基因表达呈浓度依赖性降低（均P<0.05），NF-κB蛋白和基因以及MCP-1基因表达呈浓度依赖性升高（均P<0.05）。结论A20可通过调节NF-κB信号通路来导致炎症信号通路的持续激活，可能在DN的发生发展中发挥作用。
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锌指蛋白基因抑制氧损伤诱导的内皮细胞E-选择素的表达
目的:探讨外源性锌指蛋白基因A20对氧损伤诱导的内皮细胞E-选择素表达的影响.方法:DOTAP 脂质体介导pcDNA3.1EHA20质粒转染人脐静脉内皮细胞,经G418筛选,免疫荧光检测A20基因的表达,原位杂交、免疫组化分别检测过氧化氢诱导的内皮细胞E-选择素表达.结果:A20基因在经G418筛选后的内皮细胞中得到高效表达,过氧化氢能诱导人内皮细胞E-选择素高表达,而A20基因能抑制80%以上过氧化氢诱导的内皮细胞E-选择素表达,两者间相差显著.结论:A20基因能够显著抑制过氧化氢诱导的内皮细胞活化,有助于氧损伤的治疗.
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RNA干扰A20基因的表达对人乳腺癌细胞MCF-7增殖、凋亡和迁移的影响
目的 利用 RNA 干扰技术靶向沉默 A20 基因,对MCF-7细胞株增殖、凋亡和迁移的影响进行研究,探讨A20基因作为乳腺癌治疗靶点的潜在价值. 方法 人工合成靶向A20基因的siRNA序列和阴性对照( NC) siRNA序列,利用脂质体转染技术将siRNA导入MCF-7细胞株,采用CCK-8细胞增殖实验、Annexin V、7-AAD双染流式细胞术检测凋亡实验和 Transwell 细胞迁移实验研究沉默 A20 基因对MCF-7细胞增殖、凋亡和迁移的影响. 结果 靶向沉默A20基因表达能够有效抑制MCF-7 细胞的增殖和迁移,促进细胞凋亡的发生. 结论 A20基因在MCF-7细胞的增殖、凋亡和迁移过程中起重要作用,A20基因可能是针对乳腺癌抗肿瘤靶向治疗的潜在靶点.
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A20基因在神经母细胞瘤细胞系中的抗凋亡作用
目的 A20基因是一种肿瘤坏死因子(TNF-α)诱导下的原始反应基因.其编码的锌指结构蛋白在押制NF-kB和TNF-α介导的细胞凋亡方面得到了广泛的研究.但对于其在神经系统中的作用研究较少.该实验采用脂质体转染及克隆筛选将A20基因导入神经母细胞瘤(SY-SH-5Y细胞系)中,通过体外实验观察A20-SY-SH-5Y细胞在抗凋亡方面的表现.方法 SY-SH-SY细胞系转染A20基因后.应用肿瘤坏死因子(TNF-α)刺激,采用流式细胞仪(FACS)测定细胞的死亡率.并进行DNA片断化分析(DNA Ladder).结果 实验表明:转染A20的SY-SH-5Y细胞系在TNF-α的诱导下死亡率小于对照组转染pCDNA3基因的SY-SH-5Y细胞系(P<0.05).结论 A20作为一种在细胞抗凋亡过程中发挥关键作用的基因,能够在神经母细胞瘤SY-SH-5Y细胞系中表现出较强抗凋亡能力,为临床上许多以凋亡为主要表现的神经系统疾病的治疗提供了新思路.
关键词： A20基因 凋亡 肿瘤坏死因子 SY-SH-5Y细胞系 转染 -
锌指蛋白A20基因对内皮细胞缺氧损伤的保护作用
目的:探讨外源性锌指蛋白家族中A20基因对缺氧诱导内皮细胞凋亡的影响.方法:①培养原代人脐静脉内皮细胞,将细胞分组建立缺氧模型;②采用DOTAP脂质体介导pcDNA3.1EHA20质粒转染培养的内皮细胞,经G418筛选,免疫荧光检测A20基因的表达;③TUNEL原位末端标记法检测转染前后缺氧诱导内皮细胞凋亡情况.结果:A20基因在内皮细胞中得到有效表达,正常对照组及转染A20基因组人脐静脉内皮细胞凋亡为(4±1)%,缺氧培养24h后对照组与转染A20基因组凋亡分别为(18±1)%、(8±1)%,两者相差有显著性意义(P＜0.05. 结论:A20基因能够显著抑制缺氧诱导的内皮细胞凋亡,可能在缺氧所致内皮细胞损伤中具有保护作用.
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锌指蛋白A20基因抑制缺氧诱导内皮细胞CD54的表达
[目的]探讨外源性锌指蛋白基因A20对缺氧诱导内皮细胞黏附分子CD54表达的影响.[方法]培养原代人脐静脉内皮细胞,将细胞分组建立缺氧模型;采用DOTAP脂质体介导pcDNA3.1EHA20质粒转染培养的内皮细胞,筛选抗G418的阳性克隆,经免疫荧光鉴定A20基因的表达;采用免疫组化和原位杂交检测内皮细胞CD54的表达.[结果]A20基因在经G418筛选后的内皮细胞中得到高效表达.缺氧能诱导人内皮细胞CD54高表达,外源性A20基因能抑制75%以上由缺氧诱导的内皮细胞CD54表达,两者问相差明显(P
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转染锌指蛋白基因A20抑制内毒素诱导的内皮细胞IL-8表达的研究
目的探讨转染外源性锌指蛋白基因A20对内毒素诱导的内皮细胞白细胞介素-8(IL-8)表达的影响.方法DOTAP脂质体介导pcDNA3.1EHA20质粒转染人脐静脉内皮细胞,经G418筛选,免疫荧光检测A20基因的表达,双抗夹心EIISA法检测内皮细胞分泌IL-8的含量变化.结果A20基因在经G418筛选后的内皮细胞中得到高效表达;内毒素能刺激人内皮细胞分泌IL-8;A20基因能减少70%以上内毒素诱导的内皮细胞IL-8的分泌,两者间相差显著(P＜0.05).结论转染外源性A20基因能够显著抑制内毒素诱导的内皮细胞活化,有助于炎症的治疗.
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A20基因缺失对弥漫大B细胞淋巴瘤临床病理特征和预后的影响及相关分子机制研究
目的 检测弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中肿瘤坏死因子α诱导蛋白3基因(A20基因)缺失情况,探讨A20基因缺失对DLBCL临床过程及预后的影响及其与核因子-κB(NF-κB)通路活化的关系.方法 荧光原位杂交检测其A20基因缺失情况;免疫组织化学染色检测肿瘤中A20、Survivin、P65、Ki-67蛋白的表达,TUNEL技术检测肿瘤细胞凋亡水平,收集临床病理资料并随访,进行统计分析.结果 DLBCL病例A20基因缺失率为21.7％,活化后B细胞样型(ABC)-DLBCL的A20基因缺失率明显高于生发中心B细胞样型(GCB)-DLBCL(30.6％ vs.8.3％,P＜0.05),A20蛋白表达与A20基因缺失呈负相关(r=-0.259,P=0.023),P65蛋白和Survivin蛋白表达与A20基因缺失呈正相关(r=0.280、0.313,P=0.015、0.007);肿瘤细胞凋亡在A20基因缺失的DLBCL病例中较低,在A20蛋白表达阳性病例中明显高于表达阴性病例,在Survivin和P65蛋白阳性表达病例中明显低于阴性表达病例(P＜0.05),而在ABC-DLBCL和GCB-DLBCL病例间差异无统计学意义(P＞0.05);COX回归分析结果显示,年龄、A20基因的缺失、DLBCL类型和Ki67表达是DLBCL独立的生存相关因素;A20基因缺失者的生存状况明显较未缺失者差(P=0.015).结论 A20缺失可能影响A20蛋白表达,使其对NF-κB活化的负调节作用减弱,使Survivin表达上调而影响肿瘤细胞的增殖和凋亡;A20基因缺失对DLBCL的临床过程和预后有一定影响.
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鼠A20基因的腺病毒载体构建及耳蜗毛细胞表达
目的 构建鼠锌指蛋白A20基因的重组腺病毒载体,并观察其对豚鼠耳蜗毛细胞的感染情况.方法 采用基因工程技术,经亚克隆后将A20基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用pAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染HEK293细胞包装、扩增,将重组腺病毒感染耳蜗毛细胞.PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因对病毒滴度和感染情况进行监测.结果 酶切鉴定及PCR结果表明A20基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达5×109pfu/mL,并对耳蜗毛细胞有很强的感染能力.结论 应用细菌内同源重组法成功构建了含鼠A20基因的重组腺病毒载体.
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A20基因与NF-κB信号通路的研究进展
NF-κB信号通路在慢性炎症中发挥着重要作用,在受到炎症因子的刺激下能够活化,加重炎症反应.NF-κB信号通路受到多种细胞因子的调控,A20基因作为NF-κB信号通路的一个负向调节因子,通过影响NF-κB信号通路中的某些基因,发挥炎症抑制作用,与某些炎症相关疾病的发生发展密切相关.
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A20启动子区rs5029924多态性与创伤后脓毒症易感性的相关性
目的 探讨A20蛋白基因启动子区rs5029924位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与创伤后脓毒症之间的关系. 方法 采用PCR-DNA测序法检测103例创伤脓毒症组(A组)、120例创伤非脓毒症组(B组)、135例健康对照组(对照组)个体基因组rs5029924位点的基因分布,分析不同基因型与脓毒症易感性的关系.体外以脂多糖(lipopolysac charides,LPS)刺激不同基因型健康者的外周血细胞,利用荧光定量PCR技术测定A20 mRNA表达,流式细胞技术测定A20蛋白表达,ELISA技术分析TNF-α及IL-1β水平. 结果 对照组rs5029924的CC、CT、TT基因型频率为77.8％、20.0％和2.2％,而A组、B组分别为63.1％、34.0％、2.9％及83.3％、15.0％、1.7％.A组CC基因型频率显著低于B组及对照组(P＜0.05),而B组与对照组间差异无统计学意义(P＞0.05)；CT/TT基因型患脓毒症的危险性是CC基因型的2.397倍,T等位基因相对C等位基因也能显著增加脓毒症的发病风险(OR=2.056)；LPS刺激后,CC基因型个体外周血白细胞A20 mRNA和蛋白表达水平均显著高于CT/TT,而TNF-α及IL-1β3水平则显著低于CT/TT个体. 结论 rs5029924位点多态性与脓毒症易感性相关,可能是由于突变型通过影响启动子活性而降低A20表达,导致炎症失控.
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锌指蛋白基因抑制内皮细胞粘附分子表达及单核细胞粘附
目的 单核细胞粘附是动脉粥样硬化发生的重要阶段,研究锌指蛋白A20基因在氧化型低密度脂蛋白诱导内皮细胞粘附分子表达及单核细胞粘附中的作用.方法 脂质体DOTAP转染pEGFPEHA20-N1于原代培养的脐静脉内皮细胞,经G418筛选,A20表达经免疫荧光鉴定.激光共聚焦显微镜及微管吸吮系统分别检测转染前后氧化型低密度脂蛋白诱导单核细胞粘附情况及内皮细胞粘附分子VCAM-1表达.结果 氧化型低密度脂蛋白能显著提高单核细胞粘附力及内皮细胞VCAM-1表达,A20基因能显著抑制氧化型低密度脂蛋白诱导单核细胞粘附及内皮细胞VCAM-1表达.结论 A20基因对动脉粥样硬化的防治可能有一定作用.
