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全反式视黄酸对大鼠原代肝细胞铁代谢的影响
目的 研究全反式视黄酸(atRA)对大鼠原代肝细胞铁代谢的影响.方法 按seglent胶原酶消化法分离大鼠原代肝细胞,将活性大于90%的肝细胞培养于10%血清DMEM培养基中,随机分为4个剂量组,即维生素A完全缺乏组、边缘性缺乏组、正常对照组、治疗剂量组,分别给予0、0.5、1.0和50μmol/L的atRA.收集培养72h后的肝细胞,用RT-PCR法检测铁调节蛋白2(IRP2)mRNA、转铁蛋白受体(TFR)mRNA、铁蛋白(Fn)mRNA的表达.结果 VA缺乏时可导致肝细胞的活性及合成功能降低,使IRP2 mRNA、TFR mRNA表达增加,而Fn mRNA表达下降;而补充atRA可抑制IRP2 mRNA的表达水平.结论 atRA可通过影响IRP2mRNA的表达,进而影响TFR mRNA、Fn mRNA的水平来调节铁代谢.
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国外医药信息
从耳叶决明叶中分离得到具有保肝活性的化学成分经作者实验发现，耳叶决明叶80%丙酮水提取物，对D-半乳糖胺诱发小鼠原代肝细胞的细胞毒性具有保护作用。进一步研究中，从耳叶决明叶中分离得到1个新的苯并香豆素苷avaraoside I（化合物1），1个新的黄烷醇二聚体avaraol I（2）和29个已知化合物。
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肝复康滴丸对四氯化碳损伤大鼠原代肝细胞的保护作用
目的:研究肝复康滴丸含药大鼠血清对CCl4损伤原代肝细胞的保护作用.方法:采用酶消化法分离大鼠肝实质细胞进行体外培养并建立CCl4肝损伤模型,以AST和ALT为指标,并采用MTT法对细胞活性和增殖进行检测,观察肝复康滴丸含药血清对肝损伤原代细胞的保护作用.结果:肝复康滴丸含药血清可使肝损伤大鼠原代细胞的增殖率明显提高,AST和ALT的含量明显降低.结论:肝复康滴丸具有很好的肝细胞保护作用.
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扶正化瘀方对原代大鼠肝细胞中CYP450的影响
目的:采用原代大鼠肝细胞(PRH)研究扶正化瘀方(FZHY)对大鼠细胞色素P450酶(CYP450)的影响.方法:采用两步灌流法分离大鼠原代肝细胞,形成肝板结构后加入FZHY共培养24 h,换成含有4种CYP450同工酶(CYP1A2,CYP2C9,CYP2D6,CYP3A4)对应的特异性探针药物(非那西丁、甲苯磺丁脲、氢溴酸右美沙芬、睾酮)的培养基,培养2h后吸取上清液,利用UPLC-MS/MS对探针药物的代谢产物进行检测,考察FZHY对探针药物代谢产物生成量的影响,评价FZHY对PRH中CYP450代谢活力的影响.结果:PRH中CYP1A2,CYP2C9,CYP2D6与CYP3A4具有良好的代谢活力.4种探针药物在0 ～ 500μmol·L-1内对PRH没有毒性,在0.5～500 μg·L-1时,FZHY对PRH没有毒性.FZHY在5μg·L-1时对PRH具有轻微的保护作用,并能使甲苯磺丁脲的代谢活化值——米氏常数(Km)降低20.8％;氢溴酸右美沙芬的Km降低39.2％;非那西丁的Km降低17.4％;并使睾酮的Km显著降低.结论:FZHY能抑制原代大鼠肝细胞中CYP1 A2,CYP2C9,CYP2D6和CYP3A4的代谢活性.
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18β-甘草酸和18α-甘草酸对大鼠原代肝细胞CYP3A酶表达的影响
目的:研究甘草中的2种成分18β-甘草酸和18α-甘草酸对原代培养大鼠肝细胞中细胞色素P450 3A(CYP3A)在mRNA及蛋白水平表达的影响,并探讨其剂量.效应关系.方法:原位两步胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞并采用"胶原蛋白凝胶三明治"培养原代肝细胞,无血清条件下培养细胞,并用不同剂量的18β-甘草酸和18α-甘草酸处理细胞,RT-PCR法测定CYP3A mRNA表达水平,Western-blot法测定CYP3A蛋白表达.结果:实验条件下对照组、18β-甘草酸、18α-甘草酸处理组CYP3A基因及蛋白均可被检测,18βv甘草酸浓度依赖性诱导CYP3A mRNA(25～100 μmol·L~(-1))及蛋白表达(50～400μmol·L~(-1)),而18α-甘草酸浓度依赖性抑制CYP3A mRNA(25～100 μmol·L~(-1))及蛋白表达(25～100 μmol·L~(-1))表达.结论:18β-甘草酸和18αv甘草酸在转录水平上分别上调和下调大鼠肝细胞CYP3A的表达.
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小檗碱对肝细胞核因子4α表达及葡萄糖激酶活性的影响
目的:观察小檗碱对小鼠原代肝细胞核因子4α(HNF4α)表达及葡萄糖代谢活性的影响,探讨小檗碱治疗2型糖尿病的分子机制.方法:采用改良两步灌流法培养小鼠原代肝细胞,用不同浓度的小檗碱(0,1,3,10,30,100 αmol·L-1)和1 mmol·L-1二甲双胍干预24 h后,采用RT-PCR方法检测HNF4αmRNA表达;采用Western-blot方法检测HNF4α蛋白的表达,同时检测GK的活性.结果:与阴性对照组相比,小檗碱在10,30,100 μmol ·L-1时能够明显促进HNF4α mRNA及蛋白的表达,二者同时在30 μmol·L-1时达到大值(HNF4α mRNA相对吸光度为0.48±0.20,蛋白相对吸光度为3.47±0.86,P＜0.01);在10,30 μmol·L-1时明显上调GK活性,同时在30 μmol·L-1时达到大值(0.080±0.073,P＜0.05);而二甲双胍对HNF4αmRNA、蛋白的表达及对GK活性的影响则与阴性对照组无明显差异.结论:小檗碱改善糖代谢的作用可能与其调节肝细胞核因子4α的表达进而调节GK活性有关.
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川楝子对大鼠肝组织超微结构和原代培养肝细胞的影响
目的:研究川楝子对大鼠肝组织超微结构和原代培养肝细胞的影响.方法:大鼠口服川楝子提取液(生药)90 g·kg~(-1),2h后取肝组织,电镜下观察肝组织超微结构变化.分离培养原代大鼠肝细胞,加入川楝子含药血清共同孵育,分别于1,2,8,24 h时检测培养上清液中LDH,ALT,AST水平.结果:大鼠口服川楝子提取液后2 h,肝细胞体积增大,线粒体肿胀变性,内质网扩张,胞浆内脂滴比正常组略有增多.5%或10%川楝子含药血清均可导致肝细胞上清液中LDH,ALT,AST水平不同程度的升高(P＜0.05或P＜0.01),在24 h为显著.结论:川楝子口服能被机体吸收,其原型药物或代谢产物对肝细胞产生直接的损伤作用.
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乙醇抑制大鼠原代肝细胞中P70S6K和ERK1/2活性
目的 研究乙醇对原代肝细胞中P70S6K和ERK1/2活性的影响.方法 分离成年雄性SD大鼠的肝细胞,分别以0、50、100和200 mmol/L的乙醇处理4 h,或以200 mmol/L乙醇处理0、1、2和4h,用Western blot法检测P70S6K 和ERK1/2的活性.在细胞中加入100 nmol/L的mTOR特异抑制剂雷帕霉素或10 μmol/L的MEK1/2特异抑制剂U0126,培养24 h后收集细胞,用Western blot法检测P70S6K、ERK1/2及PPARγ的表达；用EMSA检测PPARγ的活性.结果 随着乙醇浓度的增加或处理时间的延长,P70S6K的表达逐渐降低；乙醇也可抑制ERK1/2的活性；U0126同时抑制ERK1/2和P70S6K的活性,而雷帕霉素虽抑制P70S6K的活性,但增强ERK1/2的活性；乙醇不影响PPARγ的表达和活性.结论 在大鼠原代肝细胞,乙醇对P70S6K的活性有抑制作用,且存在量效关系和时效关系.P70S6K的活性受ERK1/2的控制,但P70S6K也可反向调节ERK1/2.
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重组人EPO对rhIL-6诱导HepG2细胞和人原代肝细胞Hepcidin mRNA表达的抑制作用
本研究探讨EPO对人肝细胞株和原代肝细胞Hepcidin表达的影响和rhEPO在慢性病贫血治疗方面的机制.在HepG2人肝癌细胞及人原代肝细胞培养液中加入不同浓度的rhlL-6、rhEPO并作用不同时间.提取mRNA,行RT-PCR后进行紫外荧光显像,以Hepcidin与G3PDH的mRNA比值进行半定量分析;比较不同条件下人原代肝细胞及肝肿瘤细胞Hepeidin的表达水平.结果表明:rhIL-6能刺激HepG2细胞和人原代肝细胞Hepcidin mRNA表达升高,rhEP0对IL-6刺激Hepcidin mRNA表达有抑制作用,单纯rhEPO对HepG2细胞Hepcidin表达基本无影响.结论:重组人IL-6能刺激HepG2细胞和人原代肝细胞Hepcidin mRNA表达升高,并在一定范围内呈时间、剂量依赖效应,rhEPO对这一作用有抑制作用.
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人类乙肝病毒体外感染树鼩肝原代细胞的研究
目的 为进一步研究人类乙肝病毒(HBV)提供接近自然感染状态的理想细胞模型.方法 体外二步灌流法分离树鼩原代肝细胞,纯化后的乙肝患者血清感染上述肝细胞,Southern blot和Noahem blot检测感染后细胞内的DNA和RNA,ELISA方法 检测细胞上清的HBsAg,免疫组化检测细胞内HBsAg的表达.结果 可检测出肝细胞内cccDNA(共价闭合环状DNA)、pgRNA(前基因组RNA)和sgRNA(亚基因组mRNA),感染后第7天,信号开始增强,持续到实验结束的第14天.细胞上清中HBsAg自第1天到第5天S/CO值逐渐下降,随后S/CO值逐渐升高.结论 HBV可在原代树鼩肝细胞中复制和表达.
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同种肝细胞脾内移植治疗大鼠肝衰竭的实验研究
目的:探讨经脾内同种异体移植培养的原代肝细胞与肝细胞悬液治疗大鼠药物性肝衰竭的疗效,并观察脾内移植肝细胞的生物学特性.方法:采用D-氨基半乳糖(D-gal)建立大鼠急性肝衰竭模型,24h后随机分为3组进行治疗,Ⅰ组:经脾内移植体外培养3d的肝细胞2×107;Ⅱ组:经脾内移植预孵育8h的肝细胞悬液2×107;Ⅲ组:经脾内注射生理盐水1 mL.观察受体大鼠的存活率、肝脏功能和病理变化及移植肝细胞的生物学特性.结果:Ⅰ组、Ⅱ组大鼠存活率(78%,71%)与Ⅲ组大鼠存活率(23%)相比具有显著性差异(P＜0.01,P＜0.05),肝功能各项指标均有明显改善,肝组织病理改变较轻.而Ⅰ,Ⅱ组大鼠的存活率、肝功能改变方面,没有统计学差异.经HE和PAS染色证实,移植的肝细胞在受体脾内结构和功能保持较好.结论:经脾内移植的培养肝细胞和肝细胞悬液均能提高大鼠药物性肝衰竭的存活率、改善肝功能及肝脏组织病理变化.而培养肝细胞与细胞悬液相比,统计学上没有明显差异,但结果显示培养肝细胞仍具有一定的优越性.
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原代肝细胞分离培养技术现状及展望
原代肝细胞的分离和培养是建立体外HBV感染的细胞模型和临床应用生物人工肝的关键步骤,许多学者对肝细胞分离和培养技术做了大量探索.本文就近年来建立的各种肝细胞分离技术和培养技术的优缺点进行比较,并对该领域今后的发展前景作了展望.
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小檗碱对肝细胞核因子6 mRNA表达及葡萄糖激酶活性的影响
目的:观察小檗碱对小鼠原代肝细胞核因子6(HNF6)mRNA表达及葡萄糖代谢关键酶葡萄糖激酶(GK)活性的影响,探讨小檗碱治疗2型糖尿病的分子机制.方法:采用改良两步灌流法培养原代肝细胞,用不同浓度的小檗碱(0,1,3,10,30,100μmol/L)和1 mmol/L二甲双胍干预24 h后,采用MTT比色法观察小檗碱对原代肝细胞增殖的影响;采用RT-PCR方法检测HNF6 mRNA表达,同时检测GK的活性.结果:与阴性对照组相比,1,3,10,30 μmol/L的小檗碱均能促进HNF6 mRNA的表达(1.00±0.21,1.11±0.06,1.37±0.10,1.40±0.09 vs0.68±0.02;P＜0.01);当小檗碱为10,30μmo1/L时,均可上调GK的活性(0.069±0.082,0.080±0.073 vs 0.009±0.007;P＜0.05);二者均在30μmol/L时达到大值.小檗碱为100 μmo1/L时HNF6 mRNA的表达、GK的活性与阴性对照组无差异,可能与其抑制肝细胞生长有关.结论:小檗碱改善糖代谢的作用可能与其调节HNF6的表达进而调节GK活性有关.
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利用肝癌细胞系研究HBV的新进展
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)属嗜肝DNA病毒科.一般可采用原代肝细胞或肝癌细胞系对HBV复制进行体外研究.由于原代肝细胞来源困难、存活时间短,而肝癌细胞系具有来源方便、操作简便、条件可控和可重复性等优点,是研究HBV的理想工具.
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人巨细胞病毒感染树鼩原代肝细胞的研究
目的 研究人巨细胞病毒AD169标准株(HCMV AD169)是否能感染树鼩肝原代细胞,为进一步研究人巨细胞病毒感染树嗣的动物模型研究打下基础.方法 2014年6月起取一只树嗣肝脏,分离并培养树嗣原代肝细胞,利用感染剂量MOI分别为0、0.1和1的HCMV AD169感染肝细胞,在不同时间点(12、24、48、72、120 h)检测细胞培养液上清中病毒TCID50滴度,间接免疫荧光法检测肝细胞内HCMV AD169 PP65蛋白表达,RT-PCR法检测培养肝细胞内HCMV AD169 UL49 mRNA,并对PCR结果进行测序并碱基序列比较.结果 细胞培养液上清病毒TCIDS0滴度显示,HCMV AD169能在树鼩肝细胞内复制,间接免疫荧光法可以观察到肝细胞内病毒复制旺盛,RT-PCR和测序分析确证树嗣肝细胞内病毒为HCMV AD169.结论 HCMV AD169能感染体外培养的树鼩原代肝细胞,试实验具有一定的局限性,不能完全说明HCMV AD169感染树鼩动物的成功.
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小檗碱、巴马汀和药根碱在大鼠原代肝细胞中的摄取转运特征
目的 通过大鼠原代肝细胞模型,明确小檗碱、巴马汀和药根碱的肝细胞摄取特征.方法 Seglen两步法分离大鼠原代肝细胞并悬浮培养,应用已知底物瑞舒伐他汀评价转运体的功能,将药物在4和37℃分别与肝细胞孵育不同时间,UPLC-MS/MS测定肝细胞摄取量,考察温度和时间对药物摄取的影响,并计算转运参数.通过浓度依赖的摄取实验,计算得到Km、Vmax和主动摄取率等参数.在肝细胞模型上,将转运体的特异抑制剂与小檗碱、巴马汀和药根碱共孵育,观察阳性抑制剂对受试药物转运的影响.结果 小檗碱、巴马汀和药根碱在37℃条件下的摄取量随着底物浓度的增高而增加,4℃条件下摄取量较低且变化很小,3种生物碱进入肝细胞的CLactive/CLuptake分别为85.26％、74.90％和57.74％.阳性抑制剂布洛芬、地高辛、甘草酸和盐酸哌唑嗪能显著降低小檗碱和巴马汀的摄取,甘草酸和盐酸哌唑嗪能减少药根碱的摄取.结论 小檗碱、巴马汀和药根碱进入肝细胞均以主动转运为主,Oatp1 a1、Oatp1 a4、Oatp1 b2和Oct1可能介导了小檗碱和巴马汀的肝脏摄取,Oatp1 b2和Oct1参与了药根碱的主动转运.
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EGFR过表达对原代肝细胞AKT的激活作用
目的 构建含表皮生长因子受体EGFR基因的重组腺病毒载体,并观察所构建腺病毒介导的EGFR过表达对其下游的AKT通路的激活.方法 将EGFR的cDNA片段克隆至pshuffle-CMV载体,将该载体与pAdEasy质粒进行细菌内同源重组从而获得重组腺病毒载体pAd-EGFR,之后在Ad293细胞中进行包装以及扩增,并对病毒效价进行检测;后利用所制备的腺病毒Ad-EGFR感染小鼠原代肝细胞,利用蛋白印迹法Western blot检测EGFR在原代肝细胞中的表达及其对信号分子AKT的活化作用.结果 成功制备具有生物学活性的EGFR重组腺病毒,并观察到该重组腺病毒在Huh-7细胞介导EGFR的过表达以及在原代肝细胞中对EGFR下游PI3K-AKT通路的激活作用.结论 所构建的EGFR重组腺病毒载体可以介导细胞中EGFR的过表达并激活PI3K-AKT信号通路,为今后研究EGFR的相关生物学功能奠定了基础.
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干细胞与肝脏病治疗研究进展
全球17亿人有各种不同类型的慢性肝病,其中25％～30％的人会发生严重纤维化并终进展成肝硬化.主要的致病原因是HCV、HBV感染,酗酒和非酒精性脂肪肝.肝硬化是85％ ～ 90％原发性肝癌的病因,这些疾病给全球的医疗卫生增加了显著的负担.目前,对于终末期肝病和先天遗传性代谢性肝病,原位肝移植( OLT)一直被认为是理想的方法,但由于缺乏供体、费用昂贵、免疫排斥而需要服用免疫抑制剂等因素,其在临床的广泛应用受到限制.有人尝试将生物人工肝(BAL)和肝细胞移植(LCT)[1]作为肝移植的辅助或替代疗法,原代肝细胞是理想供体,同样来源匮乏,且原代肝细胞体外培养或体内移植后的增殖及功能的维持状况均不甚理想.干细胞研究的兴起为应用干细胞移植治疗终末期肝病提供了新的治疗思路.
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金黄地鼠原代肝细胞的分离纯化与培养
目的 建立一种简单、高效的金黄地鼠肝细胞分离、纯化及培养的方法.方法 实验采用两步胶原酶原位灌流法分离地鼠原代肝细胞,percoll离心法纯化细胞,台盼蓝染色检测成活率,对所分离培养的原代肝细胞进行形态学鉴定,Western Blot检测细胞功能.结果 经过分离纯化的金黄地鼠肝细胞,细胞成活率为(93.7％±2.1)％,细胞形态呈现不规则多边形,细胞多为双核和多核细胞.细胞在腺苷处理后,AMP激活的蛋白激酶(AMPK)磷酸化水平明显升高.结论 成功建立了金黄地鼠肝细胞分离纯化及培养的方法.
关键词： 金黄地鼠 原代肝细胞 两步胶原酶原位灌流法 AMPK -
茶多酚对乙醇所致原代肝细胞损伤的保护作用研究
目的 研究乙醇对原代肝细胞的氧化损伤作用,同时探讨茶多酚对乙醇所致的原代肝细胞损伤模型的保护作用.方法 离小鼠原代肝细胞,直接以不同浓度乙醇作用于肝细胞,或以茶多酚预处理后再用乙醇作用于肝细胞,测定各组细胞存活率、抗氧化酶及丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性的变化.结果 着乙醇浓度的增加,小鼠原代肝细胞存活率逐渐下降,抗氧化酶活性降低,转氨酶升高;而茶多酚的预处理对于乙醇所致的小鼠原代肝细胞损伤具有明显的保护作用,表现为相同乙醇浓度作用下,随茶多酚浓度的升高,细胞存活率逐渐升高,抗氧化酶活性增加,转氨酶下降,且差异有统计学意义(P<0.05).结论 醇可以诱导小鼠原代肝细胞的氧化损伤,而茶多酚对其氧化损伤具有明显的保护作用.
