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视黄酸对胎鼠腭间质细胞周期分布的影响及其作用
目的探讨全反式视黄酸(atRA)对小鼠胚胎腭间质细胞(MFPM)细胞增殖和细胞周期的影响及其分子生物学作用机制.
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小鼠腭板旋转培养模型的建立及其应用
目的为研究全反式视黄酸(all-trans retinoic acid,atRA)对小鼠腭板发育的影响及其致腭裂的机制,建立腭板旋转培养模型.
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全反式视黄酸诱发胎鼠腭裂及抑制Smad2磷酸化的作用
目的 观察过量全反式视黄酸(atRA)对胎鼠腭发育的影响及其对Smad2磷酸化的调节作用.方法 将ICR孕鼠随机分为atRA实验组和溶剂对照组,在11天(查见阴栓为孕0天),分别灌胃给予80mg/(kg·d)atRA或等体积的玉米油溶剂.常规HE组织学染色观察胎鼠上腭发育情况;免疫组化和Western Blot检测突中嵴上皮内pSmad2的表达.结果 80mg/(kg·d)atRA可导致90%胎鼠发生腭裂;在腭突融合过程中,中嵴上皮细胞内Smad2被内源性的激活,出现明显磷酸化,在80mg/(kg·d)atRA组,可检测到总Smad,但是不能检测到磷酸化pSmad2的表达.结论 孕期过量atRA可导致胎鼠发生腭裂,其致畸作用机制可能与中嵴上皮细胞内Smad2磷酸化被抑制有关.
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视黄酸阻滞胎鼠腭间质细胞周期进程并诱导凋亡
目的探讨全反式视黄酸(atRA)对小鼠胚胎腭间质细胞(MEPM)细胞增殖和细胞周期的影响及其分子生物学作用机制.方法MEPM细胞取材于孕13 d胎鼠腭组织.MTT比色法检测atRA对MEPM细胞增殖活力的影响;流式细胞术分析atRA对细胞周期分布的影响,并同时观察有无细胞凋亡现象发生;Western-blot检测atRA对细胞周期蛋白D和E表达的影响,并观察对视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)磷酸化的影响.结果与溶剂对照组相比,在5～10μmol/L浓度范围内,atRA能够显著性抑制MEPM细胞增殖活力(P＜0.05),并将细胞周期滞留在G0/G1期(P＜0.05).atRA对细胞周期蛋白D和E的表达及相应酶活性均表现为抑制效应.观察Rb的变化也显示,atRA降低Rb的磷酸化作用.结论atRA对腭器官发育敏感期腭间质细胞增殖活力及细胞周期的抑制作用可能是atRA诱导诱导唇腭裂的机制之一.
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小鼠腭板旋转培养模型的建立及其初步应用
目的为研究全反式视黄酸(atRA)对小鼠腭板发育的影响及其致腭裂的机制,建立腭板旋转培养模型.方法于妊娠第12天取下小鼠胚胎腭移植体,以10-5～10-1μmol/L atRA诱导,在旋转培养装置中连续培养72h,观察腭板发育融合情况.结果经72h培养后,对照组正常融合,与体内发育一致.atRA在10-5μ.mol/L能促进腭板的融合,≥10-4μmol/L抑制腭板的发育及融合,造成腭裂,融合率下降,并呈显著的剂量-效应关系.结论本模型中,腭板能在体外培养中存活并继续生长、发育、融合;atRA在10-5μmol/L能促进腭板融合,高于10-4μmol/L呈剂量-效应关系的抑制融合,造成腭裂,证明小鼠腭板旋转培养模型建立成功.
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全反式视黄酸对大鼠原代肝细胞铁代谢的影响
目的 研究全反式视黄酸(atRA)对大鼠原代肝细胞铁代谢的影响.方法 按seglent胶原酶消化法分离大鼠原代肝细胞,将活性大于90%的肝细胞培养于10%血清DMEM培养基中,随机分为4个剂量组,即维生素A完全缺乏组、边缘性缺乏组、正常对照组、治疗剂量组,分别给予0、0.5、1.0和50μmol/L的atRA.收集培养72h后的肝细胞,用RT-PCR法检测铁调节蛋白2(IRP2)mRNA、转铁蛋白受体(TFR)mRNA、铁蛋白(Fn)mRNA的表达.结果 VA缺乏时可导致肝细胞的活性及合成功能降低,使IRP2 mRNA、TFR mRNA表达增加,而Fn mRNA表达下降;而补充atRA可抑制IRP2 mRNA的表达水平.结论 atRA可通过影响IRP2mRNA的表达,进而影响TFR mRNA、Fn mRNA的水平来调节铁代谢.
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全反式视黄酸对小鼠胚胎发育毒性的体外实验研究
目的为研究全反式视黄酸(atRA)的发育毒性及其可能的作用机制,本研究采用植入后体外全胚胎培养方法研究atRA对小鼠胚胎生长发育的影响.方法孕8.5日龄小鼠胚胎移植于atRA终浓度为0、0.01、0.1、0.2、0.4、1.0、10.0 μmol/L的全胚胎培养基中,体外连续培养48 h,观察atRA对胚胎发育和器官形态分化的影响.结果atRA可影响小鼠胚胎在体外的生长发育,并呈现剂量-效应关系;0.1μmol/L组,atRA明显影响卵黄囊直径、颅臀长、前脑、中脑、听觉系统、视觉系统、心脏、体位和前肢芽等指标,与对照组比较,差异有显著性(P＜0.05);≥0.20 μmol/L组,卵黄囊体积减小、表面皱缩、血管减少及分化程度降低,神经系统、心脏、腮弓和颅面等多种器官出现畸形,所有器官形态分化指标均显著低于对照组(P＜0.05).结论atRA有致畸性和胚胎毒性,在器官形成期可以引起神经系统、心脏、腮弓和颅面等多种器官的发育畸形.
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全反式视黄酸与1,25-(OH)2D3联合应用对溃疡性结肠炎小鼠Th17相关细胞因子作用的实验研究
目的 研究全反式视黄酸(all-trans retinoic aciol,ATRA)与1,25-(OH)2D3联合作用对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎小鼠辅助性T细胞17 (Thelper17 cells,Th17)细胞相关因子表达的影响.方法 50只6周龄雌性SPF级C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组、ATRA组、1,25-(OH)2 D3组与ATRA+1,25-(OH)2 D3联合组.对照组饮用蒸馏水,其余组饮用3.0％ DSS溶液造模.造模第3天起对3个干预组分别灌胃给予0.2 mg/d/只ATRA或/和100 ng/d/只1,25-(OH)2D3.第9天处死小鼠,取结肠组织,进行大体形态学评分;HE染色进行组织病理学评分;免疫组织化学法检测结肠IL-17、IL-23表达;ELISA测定结肠维甲酸相关核孤儿受体γt(retinoid acid receptor related orphanreceptors,RORγt)、IL-6和TGF-β表达.采用单因素方差分析进行组间比较,采用析因设计方差分析判断两因素联合是否有交互作用.结果 3个干预组与模型组比较,疾病活动指数(disease activity index,DAD、大体形态和组织病理学评分均降低,IL-17、RORγt,IL-23及IL-6表达量下降,ATRA+1,25-(OH)2D3联合干预组效果更显著(P＜0.05).结论 联合应用ATRA和1,25-(OH)2D3能更有效地抑制Th17相关因子的表达,减轻炎症,缓解结肠炎症状.
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PcG蛋白EZH2在全反式维甲酸诱导的小鼠iPS细胞系分化过程中的作用
目的 探讨组蛋白甲基转移酶EZH2在小鼠iPS细胞系IP14D-1向生殖细胞分化过程中的作用.方法 将小鼠iPS细胞系IP14D-1通过悬浮培养分化形成拟胚体(iEBs)作为向生殖细胞分化的启动步骤,1μmol/L全反式维甲酸(atRA)持续诱导iEBs 2、4和7d,采用实时RT-PCR、荧光定量RT-PCR、免疫荧光检测atRA处理前后EZH2和生殖细胞分化标志性基因Stra8在iEBs中的表达.结果 在atRA诱导IP14D-1来源的iEBs中,EZH2表达在诱导后2d达到高峰,伴随atRA诱导,EZH2表达减弱；而生殖细胞分化标志性基因Stra8其变化特点与EZH2相反,无atRA诱导时EBs表达Stra8较弱,伴随atRA诱导,Stra8表达增强.EZH2和Stra8阳性信号分别定位于胞膜和胞质,其变化特点与PT-PCP结果相一致.结论 atRA诱导使EZH2低水平表达时期提前出现,伴随Stra8增强表达,启动了小鼠iPS细胞向生殖细胞的分化进程.
关键词： 小鼠诱导性多能干细胞 生殖细胞 EZH2 全反式视黄酸 -
先天性心脏病大动脉转位小鼠模型的建立
目的：尝试建立一种先天性心脏病大动脉转位小鼠模型，为探讨该类疾病发生、发展的相关机制提供条件。方法：20只8~10周大的SPF级ICR孕鼠随机分为对照组（n=5）和实验组（n=15）。实验组孕鼠在E8.5天给予单次剂量全反式视黄酸（70 mg/kg）腹腔注射，对照组孕鼠在E8.5天给予单次剂量二甲基亚砜（70 mg/kg）腹腔注射。注射完毕后继续饲养至E18天后取出胚胎，在体式显微镜下观察心脏表型。结果：与对照组相比，实验组胚胎的早产、流产、胚胎吸收的发生率显著增加；大动脉转位表型明显，发生率为61.2%，同时合并突眼、神经管畸形等多种心外表型发生。结论：全反式视黄酸可以诱导小鼠胚胎发生大动脉转位，是一种可行的疾病动物模型。
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过量全反式视黄酸对腭突中嵴上皮细胞迁移的影响
目的 通过细胞划痕实验观察过量全反式视黄酸(all-trans retinic acid,atRA)对原代腭突中嵴上皮细胞迁移的影响.方法 以10w龄昆明小鼠按雌雄比例2∶1合笼,得到妊娠13d孕鼠.将1只妊娠13d孕鼠处死,分离得到全部胎鼠腭突,以中性蛋白酶分离腭突中嵴上皮,继以胰酶消化,用DMEM/F-12培养基调整细胞浓度后接种于培养瓶中,CO2培养箱中培养96 h.取同等细胞浓度接种于6孔板中,同样条件下培养24 h.弃去原培养基,在各孔贴壁细胞层划出一条划痕带,分别加入相应培养基后得到3孔5 μ mol/L atRA实验组和3孔对照组,继续原条件培养72 h.结果:原代腭突中嵴上皮细胞贴壁生长,多角形或卵圆形,成片生长;当细胞融合率＞80％,呈现销路石状外观.在培养过程中,对照组划痕逐渐弥合,培养72 h,爬行细胞几乎覆盖整个划痕带;而atRA实验组未见到向划痕区迁移的细胞,划痕宽度没有改变.结论:过量atRA可抑制腭突中嵴上皮细胞发生迁移.
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全反式视黄酸对新生鼠头盖骨成骨细胞的影响
目的:探讨全反式视黄酸(ATRA)对体外培养的新生大鼠成骨细胞增殖与分化的影响.方法:从新生大鼠颅骨分离出成骨细胞,细胞增殖实验采用噻唑盐(MTT)比色试验法;细胞分化实验采用氨基安替比林法(金氏法)测定碱性磷酸酶(ALP)的活性,并用免疫细胞化学法检测细胞周期调控蛋白Cyclin D1表达的影响,研究ATRA对成骨细胞代谢的影响及部分作用机制.结果:培养液中加入10-5、10-6、10-7、10-8和10-9mol/L ATRA培养72 h对成骨细胞有促细胞增殖作用,而10-5、10-6、10-7mol/L的ATRA在24、48、72 h均能显著促进成骨细胞分化,免疫细胞化学染色Cyclin D1蛋白表达降低.结论:ATRA对成骨细胞具有促增殖和诱导分化作用,细胞周期调控蛋白可能在ATRA诱导成骨细胞增殖和分化过程中发挥重要作用.
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视黄酸对脐血树突状细胞的作用及其途径
目的:研究视黄酸(RA)对脐血树突状细胞(dendritic cell,DC)分化、成熟和功能的影响,探讨视黄酸受体(retinoic acid receptorα,RARα)在RA对脐血DC调节中的作用.方法:收集脐血9份,分离单个核细胞后,均匀分为4组:对照组、RA组、RARα特异性拮抗剂组(RO组)、RA+RO组.在体外进行DC的诱导培养,流式细胞仪检测细胞表面标记及其荧光强度,观察RA及RARα对DC分化、成熟的影响;培养DC与T细胞进行混合淋巴细胞反应(mixedlymphocyte reaction,MLR)后,观察RA及RARα对DC刺激异体T细胞增殖能力的作用;采用ELISA法和RT-PCR法研究RA和RARα在DC对Th细胞极向分化调节中的作用.结果:RA使DC的分化、成熟明显受抑,但当RO同时加入时,则可逆转该影响;MLR后发现RO可逆转RA对T细胞增殖的抑制作用;在DC对T细胞极向分化的研究中,无论在蛋白水平还是基因水平,RO均可明显阻止RA对Th1(IFN-γ)的下调和对Th2(IL-4、IL-10)的上调作用.结论:RA抑制体外培养的脐血单个核细胞向DC的分化和成熟,降低其MLR能力,使免疫反应向Th2方向偏移.RARα从多个环节上参与了RA对脐血DC的调节作用.
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全反式视黄酸阻断苯并(a)芘致成纤维细胞周期改变的通路
目的观察全反式视黄酸(ATRA)逆转苯并(a)芘诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)细胞周期紊乱过程中细胞周期素D1(cyclin D1)、细胞周期素依赖性激酶K4(CDK4)、转录因子E2F-1和E2F-4的作用.方法用0.1 μmol/L ATRA预处理细胞后,再用2 μmol/L苯并(a)芘作用细胞,用Western blotting方法测定其蛋白表达水平;建立稳定转染了反义cyclin D1质粒和反义CDK4质粒的细胞系,应用反义技术证明上下游关系;用流式细胞技术测定细胞周期.结果2 μnol/L苯并(a)芘作用于HELF24h后,cyclin D1、E2F-1蛋白表达水平明显增高,CDK4和E2F-4蛋白表达水平无明显变化;用0.1 μmol/LATRA预处理24h后,cyclin D1、E2F-1蛋白表达水平明显下降;与相同作用的对照组相比,苯并(a)芘刺激反义cyclin D1或反义CDK4细胞后E2F-1表达增加的幅度明显降低;与相同作用的对照组相比ATRA预处理的反义cyclin D1或反义CDK4细胞中,苯并(a)芘诱导的E2F-1过表达水平降低的幅度明显降低;流式细胞术测定结果显示,苯并(a)芘诱导细胞从G1期进入S期,ATRA通过聚积G1期细胞而阻滞苯并(a)芘诱导的细胞周期进程.结论ATRA通过cyclin D1/E2F-1途径阻断苯并(a)芘诱导的HELF的细胞周期改变.
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维生素A与妇科疾病的关系
维生素A (Vitamin A,VA)是维持机体正常生理功能必需的营养物质,在人体视觉、免疫、生长发育及细胞分化等方面发挥重要的生物学作用.研究发现,维生素A受体广泛分布于女性生殖系统中,正常的维生素A水平对维持女性生殖健康有着重要的作用.目前维生素A在妇科疾病中的研究报道较少,现本文对维生素A与妇科疾病的关系做一综述.
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肺气肿治疗的新进展
慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种以进行性不完全可逆的气流受限为特征的疾病,具有极高的病死率和致残率,已成为美国第4位的主要死亡原因.已有人预测:到21世纪中叶我国每年死于COPD的患者将达150万[1],而肺气肿是COPD主要的病理改变之一,当其严重时可在COPD气流受限的发生和发展中占主导地位[2],肺气肿是中老年人常见的疾病,很多人发展到晚期因严重喘憋而活动受限,生活质量极差.
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维生素A在过敏性疾病发生中的作用研究进展
目前对于维生素A及其衍生物在免疫调节的相关作用的研究已经取得了较大的进展,然而其在过敏性疾病中的作用还未明确,给其应用前景带来一定的不确定性.该文以过敏性疾病的发生机制为切入点,就维生素A在过敏性疾病发生中的作用作一综述.
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肝癌的化学预防机制
一、维甲酸类的功能表达机制天然维甲酸类(retinoid)有视黄醇(retinol)(醇型)和视黄酸(retinoic acid)(碳酸型)等,前者为血中所输送的分子种系,而后者乃视黄醇在靶细胞内被氧化所形成的活性型.从视黄酸与核内受体结合而抑制转录看来,它被认作为相当于类固醇激素的生理活性物质,视黄酸于其侧链部分带有4个双键,故可形成相应的立体异构体结构(反式型,顺式型).该异构体各具不同的生理活性,其中以全反式型与9-顺式型视黄酸为重要.已有研究揭示,全反式视黄酸同称做视黄酸受体(RAR)的核内受体,9-顺式视黄酸则同维甲酸类X受体(RXR)与RAR两者相结合而司转录调节作用.
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全反式视黄酸影响小鼠胚胎干细胞向原始生殖细胞分化的相关基因表达
目的 探讨全反式视黄酸(all-trans retinoic acid,atRA)诱导小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)向原始生殖细胞(Primordial germ cellS,PGCs)分化的相关基因表达改变及其机制.方法 mESCs分化形成拟胚体(embryoid bodies,Ebs),不同浓度atRA(1 μM,2 μM,5 μM)持续诱导Ebs 16h、2d和5d,观察Ebs形态变化,实时PCR和Western blot检测PGCs分化相关基因和蛋白表达变化.分析基因肩动子中RA反应元件,以Stra8(Stimulated by Retinoic Acid Gene 8,Stra8)基因为阳性对照,确定各基因对atRA刺激的原发性反应和继发性反应.结果 不同浓度atRA诱导Ebs 16h和2d后形态无明显变化.诱导后Ebs的PGCs分化相天基因mRNA表达分4种情况:16h内(Stra8)表达量达大,然后下降;2d内(Scp3)表达量达大,然后下降;5d达到大量(Mvh);表达量无明显变化(Fragilis,Blimp-1和Prm1).Mvh表达符合继发反应特点;Stra8和Scp3表达符合原发反应特点;Blimp1,Prm1和Fragilis表达可能与atRA调节无关.Stra8蛋白变化与mRNA变化相一致,而Mvh则不一致.结论 atRA诱导mESCs向PGCs分化,各阶段标志基因表达变化均在相对短的时间内完成(2～5d),atRA诱导浓度可选用1 μM.根据基因表达模式初步得出,atRA调控的靶基因为Mvh,具备继发反应特点,与特异性分化有关,而Blimp-1、Fragilis和Prm1调控PGCs分化可能与atRA无关.
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全反式视黄酸通过RARγ蛋白直接调控PPARγ2蛋白抑制骨髓间充质干细胞成脂分化
目的 研究高浓度全反式视黄酸(atRA)抑制大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)成脂分化过程中,视黄酸核受体γ(RARγ)对过氧化物酶体增殖激活受体γ2 (PPARγ2)与CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)调控的机制.方法 体外分离、培养、诱导rBMSCs.成脂分化诱导液中,加入0.5、1.0 μmol/L atRA持续作用15d后,real-time PCR和Western blotting分别检测RARγ、C/EBPα、PPARγ2的mRNA和蛋白表达水平.重组腺病毒过表达RARγ(over-RARγ)、沉默RARγ(si-RARγ)分别感染BMSCs,采用real-time PCR及Westernblotting检测RARγ、C/EBPα、PPARγ2的mRNA及蛋白表达水平.Co-IP检测1.0μmol/L atRA持续成脂诱导15d后,明确RARγ与PPARγ2两者之间是否有相互作用.结果 诱导15d结束时,与对照组相比,加入0.5、1.0 μmol/L atRA后,RARγ表达明显增加(P＜0.01,P＜0.001),而PPARγ2、C/EBPα表达明显降低(P＜0.001).over-RARγ组:RARγ mRNA和蛋白表达均较对照组明显增加(P＜0.01),而PPARγ2、C/EBPαmRNA和蛋白表达均较对照组明显降低(P＜0.05,P＜0.01).si-RARγ组:RARγ蛋白表达较对照组明显减低,但PPA Rγ2、C/EBPα却无明显变化.Co-IP结果提示:RARγ与PPARγ2蛋白之间有直接作用,形成复合物,未发现其与视黄酸反应元件(RARE)相结合证据.结论 高浓度atRA抑制rBMSCs成脂分化,是通过激活视黄酸信号通路RARγ而实现的.RARγ下调成脂分化通路PPARγ2、C/EBPα表达是通过直接作用于下游的PPARγ2蛋白而实现的.
