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18α,18β-甘草酸对小鼠急性肝损伤的保护作用及其联合用药配伍比例探讨
目的:对比研究18α-甘草酸,18β-甘草酸及二者联合用药对小鼠急性肝损伤的保护作用,并筛选二者联合用药的佳配伍比例.方法:小鼠随机被分为正常组,模型组,18α-甘草酸,18β-甘草酸低、中、高剂量组(15,30,60 mg· kg-1),联合用药给药剂量均为60 mg· kg-1,联合用药1(18α-甘草酸-18β-甘草酸1:3)组、联合用药2(18α-甘草酸-18β-甘草酸2:3)组、联合用药3(18α-甘草酸:18β-甘草酸1:1)组.在造模前各治疗组ip给药7d,1次/d,其他各组ip生理盐水;末次给药1h后,除正常组ip生理盐水外,其他各组均ip0.1％四氯化碳(CCl4)花生油(20 mL· kg-1)建立CCl4诱导小鼠急性肝损伤模型,观察18α-,18β-甘草酸高、中、低剂量(15,30,60 mg·kg-1)组,联合用药3个不同配伍比例组对急性肝损伤小鼠血清中和肝组织中丙氨酸转氨酶(ALT),天冬氨酸转氨酶(AST)水平的影响,并检测肝组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)含量,同时筛选二者联合用药的佳配伍比例.结果:与正常组比较,模型组血清AST,肝组织AST,ALT,MDA水平明显升高,SOD活力显著降低(P＜0.01),提示造模成功.与模型组比较,18α-甘草酸组,18β-甘草酸组均可降低小鼠血清中AST,肝组织AST,ALT活力,MDA含量,升高肝组织中SOD活力;比较二者对急性肝损伤小鼠的保护作用,结果18β-甘草酸组对肝组织中AST,ALT水平影响优于18α-甘草酸组,其他指标无显著性差异;二者联合用药的佳配伍比例为2:3,其对肝组织中AST活力及MDA含量的影响均优于单用18α-或18β-甘草酸治疗组.结论:18α-与18β-甘草酸可保护急性肝损伤小鼠,后者保护作用比前者强,二者配伍的佳比例是2:3,其对AST,MDA水平影响优于单用18α-或18β-甘草酸.
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18β-甘草酸和18α-甘草酸对大鼠原代肝细胞CYP3A酶表达的影响
目的:研究甘草中的2种成分18β-甘草酸和18α-甘草酸对原代培养大鼠肝细胞中细胞色素P450 3A(CYP3A)在mRNA及蛋白水平表达的影响,并探讨其剂量.效应关系.方法:原位两步胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞并采用"胶原蛋白凝胶三明治"培养原代肝细胞,无血清条件下培养细胞,并用不同剂量的18β-甘草酸和18α-甘草酸处理细胞,RT-PCR法测定CYP3A mRNA表达水平,Western-blot法测定CYP3A蛋白表达.结果:实验条件下对照组、18β-甘草酸、18α-甘草酸处理组CYP3A基因及蛋白均可被检测,18βv甘草酸浓度依赖性诱导CYP3A mRNA(25～100 μmol·L~(-1))及蛋白表达(50～400μmol·L~(-1)),而18α-甘草酸浓度依赖性抑制CYP3A mRNA(25～100 μmol·L~(-1))及蛋白表达(25～100 μmol·L~(-1))表达.结论:18β-甘草酸和18αv甘草酸在转录水平上分别上调和下调大鼠肝细胞CYP3A的表达.
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18α-甘草酸和18β-甘草酸对Caco-2细胞P-gp功能和表达的影响
目的:研究甘草酸18位差向异构体18α-甘草酸、18β-甘草酸对Caco-2细胞上P-糖蛋白功能和表达的影响.方法:建立Caco-2细胞模型,采用罗丹明-123摄取法评价P-糖蛋白的功能；利用流式细胞术和荧光定量PCR分析Caco-2细胞膜上P-糖蛋白的表达.结果:中、高浓度(10,60μmol·L-1)α-GL使细胞内Rho-123摄取增加,对P-gp表现出抑制作用,但没有呈现出剂量依赖性；β-GL各浓度组使细胞内Rho-123摄取减少,对P-gp表现出诱导作用,但也没有表现出剂量依赖性.二者对Caco-2细胞上P-gp功能的影响呈相反的趋势；Caco-2细胞与药物孵育72h后,中、高浓度(10,60μmol·L-1)α-GL下调MDR1mRNA表达,β-GL只在高浓度(60μmol·L-1)上调了MDR1 mRNA表达；高浓度(60μmol·L-1)β-GL在蛋白水平对P-gp有诱导作用,α-GL各浓度没有表现出对P-gp表达的影响.结论:转录水平上α-GL,β-GL对P-gp的影响与α-GL,β-GL对CYP3A的影响呈现一定的同向性,甘草酸18位差向异构体对CYP3A与P-gp的影响有相似的立体选择性,其机制是否与孕烷X受体(PXR)有关,有待进一步研究.
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甘草酸单铵盐原料药主成分异构体及其与有关物质同时分离检测和结构确证
建立简单、灵敏、快速的高效液相色谱法,对甘草酸单铵盐原料药中主成分异构体进行分离以及同时与有关物质的分离检测,并对各待测物结构进行鉴定.参考欧洲药典7.0版(EP7.0)、英国药典2012版(BP2012)、中国国家药品标准(WS1-XG-2002)及国内外相关文献,对流动相的组成进行选择,通过优化流动相中盐的浓度、水系溶液的pH值、有机相的加入比例、柱温及流速等参数,确定了佳的色谱条件:采用Durashell C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以0.01 mol·mL-1高氯酸铵(氨水调至pH 8.2)-甲醇(48∶52)为流动相,流速0.8 mL·min-1,检测波长254 nm,柱温50℃,进样量10 μL.利用质谱、核磁共振谱、紫外光谱和液相色谱等实验技术对获得的18α-甘草酸、18p甘草酸、有关物质A、有关物质B对照品结构进行确证,以保证其结构的准确无误；采用高效液相色谱法对法定机构提供的甘草酸单铵盐对照品进行定位,并采用二级管阵列检测器分析测定各待测物色谱峰的纯度.在优化的色谱条件下,18α-甘草酸、18β-甘草酸、有关物质A和B在0.50～100μg·mL-1内线性关系良好(r=0.999 9),检出限分别为0.15、0.10、0.10和0.15 μg·mL-1.本方法检测灵敏、重现性好、结果准确可靠,可用于甘草酸单铵盐原料药主成分异构体及其与有关物质的同时分离检测.在EP7.0、BP2012收载的甘草酸单铵盐质量标准中,对主成分异构体的分离以及对色谱图中相对保留时间约为1.2的物质的结构归属有待商榷.本方法能够为甘草酸原料药、制剂以及中药材的质量标准的制定、质量控制及结构鉴定提供依据.
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甘草酸18H差向异构体对急性肝损伤小鼠血清IL-2和TNF-α的影响
目的:研究甘草酸18H差向异构体18α、18β-甘草酸(GL)及其不同配比物对CCl4诱导的急性肝损伤小鼠IL-2和TNF-α的影响.方法:将实验动物分为9组,即正常对照组、模型组、α-GL、β-GL和5个不同比例组(α∶β为8∶2、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8).各组小鼠给药4d后采用腹腔注射CCl4复制小鼠急性肝损伤模型,ELISA法检测小鼠血清IL-2和TNF-α含量.结果:CCl4急性肝损伤小鼠经药物治疗后,IL-2水平较模型组有所升高,TNF-α水平较模型组有所下降;4∶6和3∶7比例组与模型组相比有统计学差异(P＜0.05),其中4:6比例组的TNF-α水平具有显著差异(P＜0.01).结论:18α-、18β-GL及其不同比例能一定程度上恢复急性肝损伤小鼠受损的免疫功能,且以4∶6比例组效果显著.
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18β-甘草酸对鼠黑素瘤B16细胞酪氨酸酶的影响
18β-甘草酸(glycyrrhizin,GR)是由1分子18β-甘草次酸(glycyrrhhetinic acid GA)和2分子葡萄醛酸构成的亲水性三萜皂苷,是甘草提取物中重要的有效成分之一,具有广泛的药理作用,如抗炎、抗病毒、保肝解毒及增强免疫功能等作用[1].笔者观察了GR和GA对小鼠黑素瘤B16细胞黑素合成的影响,现将观察结果报告如下.
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HPLC法分离测定甘草酸二铵及其制剂中的18α-、18β-甘草酸
目的:建立能有效分离18α-、18β-甘草酸的HPLC方法并用于测定甘草酸二铵及其制剂的含量.方法:采用Agilent HC-C18(2)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm)；乙腈-磷酸盐缓冲液(pH7.0) (22:78)为流动相；流速:1.0 mL·min-1;检测波长:250 nm;柱温:30℃.结果:18α-、18β-甘草酸分离度大于1.5,国内三个厂家的14批样品均为18α-、18β-两种构型的混合物,以18α-构型为主.HPLC法较UV法含量测定结果低10％以上.结论:甘草酸二铵产品为18α-、18β-两种构型的混合物,且产品中杂质较多,而国内现有药品标准均采用UV法,不能分离上述两种异构体,可采用本文方法测定含量并对其构型组成加以合理控制.
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HPLC法同时测定中国不同产地甘草中18α-甘草酸和18β-甘草酸含量的研究
同时测定中国不同产地甘草中18α-甘草酸和18β-甘草酸含量.采用高效液相色谱法,色谱柱Ecosil-C18分析柱,流动相为乙腈0.1％磷酸盐缓冲液(80∶20,pH =7),体积流量为1.0 mL/min,检测波长为250 nm,柱温为30℃,进样量为10μL.18α-甘草酸和18β-甘草酸检测质量浓度分别在3.145 ～314.7、3.184 ～318.4μg/mL范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关(r =0.999 9);精密度、稳定性、重复性试验的RSD≤1.03％;平均加样回收率分别为99.81％、99.47％,RSD分别为0.71％、0.94％(n=6).内蒙古杭锦旗的甘草中甘草酸的含量较高,新疆喀什、宁夏盐池县出产的出产的甘草中甘草酸含量较接近.
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18α-甘草酸和18β-甘草酸抗大鼠肝纤维化作用比较研究
目的以γ-干扰素(IFN-γ)为阳性对照药,比较研究18 α-甘草酸(18 α-GL)、18β-甘草酸(18β-GL)的抗大鼠肝纤维化作用.方法以二甲基亚硝胺(DMN)腹腔注射诱导大鼠肝纤维化模型,染毒开始及染毒后5周分别用18 α-GL,18β-GL,IFN-γ预治疗和治疗肝纤维化.观察各组肝羟脯氨酸(HyP)、血清透明质酸(HA)水平,血清生化指标、病理及肝纤维化程度.结果与IFN-γ比较,18 α-GL,18β-GL差相异构体预治疗组和治疗组抗肝纤维化作用与其相近,治疗组明显优于染毒对照组;18α-GL治疗组明显优于18β-GL组.结论18 α-GL,18β-GL差相异构体有较好的抗肝纤维化作用,且18 α-GL明显优于18β-GL.
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HPLC法同时测定甘草酸二铵原料中18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量
目的：建立HPLC法同时测定甘草酸二铵原料中差向异构体18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量。方法：色谱柱：Dia-monsil C18柱（200 mm ×4．6 mm，5μm）；流动相：水相（水-60％高氯酸溶液为48∶0．5，用氨水调节pH至8．0）-甲醇（48∶52）；检测波长：248 nm；流速：1．0 ml· min－1；柱温：30℃；进样量：20μl。结果：18α-甘草酸和18β-甘草酸得到良好分离；线性范围均为0．0050～1．0000 mg· ml－1（r分别为0．9997和0．9993）；平均回收率分别为99．7％和99．1％，RSD分别为0．9％和0．4％（n＝9）。结论：该法专属性强，准确度高，可用作甘草酸二铵原料中差向异构体的含量测定。
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18α-、18β-甘草酸及其不同配比物对大小鼠的抗炎作用
目的:观察并比较18α-、18β-甘草酸(GL)及其不同配比物的抗炙作用.方法:制备小鼠和大鼠急性炎症模型,观察18α-、18β-GL及其不同配比物对二甲笨致小鼠耳肿胀、角叉菜胶致大鼠足跖肿胀和四氯化碳致大鼠急性肝损害的影响,并对其抗炎作用进行比较.结果:小鼠耳肿胀实验显示α-与β-GL比例为3:7时对耳肿胀有抑制作用,在抑制角又菜诱发的大鼠足肿胀实验中,氢化可的松组与α-、β-GL比例为5:5,4:6和3:7能明显抑制足肿胀.各给药组均能提高四氯化碳致肝脏损害后的血清白细胞介素-6(IL-6)水平,并且β-GL和4:6,3:7配比组提高明显.结论:α-、β-GL抗炎效果存在着差异.并且不同比例的两者配比物所表现出来的抗炎能力随着比例的改变而改变.α-GL和β-GL比例为4:6与3:7体现出较强的抗炎效果.有开发成新一代甘草酸制剂的潜力.
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甘草提取物及其主要成分对HepG2细胞中二相代谢酶UGT1A基因表达的影响
目的 研究甘草提取物及18α-甘草酸(18α-GL)、18β-甘草酸(18β-GL)、18α-甘草次酸(18α-GA)、18β-甘草次酸(18β-GA)对HepG2细胞上UGT1A蛋白表达和UGT1A mRNA作用的影响.方法 建立HepG2细胞模型,采用Western blot分析HepG2细胞中二相代谢酶UGT1A的蛋白表达,采用Q-PCR从转录水平检测UGT1A mRNA.结果 Western blot买验结果表明18α-GL、18β-GL对UGT1A的蛋白表达有增加作用但差异无统计学意义;18α-GA和18β-GA使UGT1A的蛋白表达量增加且具差异有统计学意义(P＜0.05).Q-PCR实验结果表明18α-GL、18β-GL使UGT1A的mRNA表达有上调作用;18α-GA对UGT1A的mRNA表达有上调作用,但差异没有统计学意义,而18β-GA使UGT1A的mRNA表达上调,且差异有统计学意义(P＜0.05).结论 甘草提取物、18α-GL、18β-GL、18α-GA和18β-GA对UGT1A蛋白表达和mRNA影响均表现为诱导作用,且18β-GA对UGT1A的诱导作用差异有统计学意义.
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18α-、18β-甘草酸对小鼠免疫性肝损伤的保护作用及其联合用药的研究
目的 对比研究18α-甘草酸与18β-甘草酸对免疫性肝损伤小鼠的保护作用,并筛选二者联合用药的佳配伍比例.方法 采用刀豆蛋白A(ConA)诱导小鼠免疫性肝损伤模型,观察18α-和18β-甘草酸高、中、低剂量组,以及二者联合用药不同配伍比例组对肝损伤小鼠的丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、一氧化氮(NO)活性及其各脏器指数的影响,并检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)的含量,同时筛选二者联合用药的佳配伍比例.结果 与模型组比较,18α-和18β-甘草酸组均可降低小鼠血清中AST及肝匀浆中AST、ALT、NO活力,降低肝匀浆中TNF-α、IFN-γ的含量,改善小鼠肝脏、胸腺指数;比较二者对免疫性肝损伤小鼠的保护作用,差异无统计学意义;二者联合用药的佳配伍比例为1:4,其对肝匀浆中AST、ALT、NO水平的影响优于单用18α-、18β-甘草酸治疗组.结论 18α-和18β-甘草酸对小鼠免疫性肝损伤均有保护作用,二者联合用药的佳配伍比例为1∶4,其对转氨酶及NO水平的影响优于单用18α-或18β-甘草酸.
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HPLC法同时测定甘草中18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量
目的:建立同时测定甘草中18α-甘草酸和18β-甘草酸含量的方法.方法:采用高效液相色谱法.色谱柱为Ecosil-C18柱,流动相为乙腈-0.1％磷酸盐缓冲液(80∶20,V/V,pH 7),流速为1.0 ml/min,检测波长为250nm,柱温为30℃,进样量为10μl.结果:18α-甘草酸和18β-甘草酸检测质量浓度分别在3.042～304.2、3.084～308.4 μg/ml范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系(r=0.999 9);精密度、稳定性、重复性试验的RSD≤1.02％;平均加样回收率分别为99.76％、99.35％,RSD分别为0.70％、0.93％(n=6).结论:该方法准确、可靠、简单、快速,可用于不同商品规格甘草药材的质量评价.
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反相高效液相色谱法测定甘草酸18H-差向异构体含量
目的 建立同时测定18α-甘草酸和18β-甘草酸的反相高效液相色谱法.方法 色谱柱为C18柱(250 mm×4.6 μm,5 μm),流动相为0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.0)-乙腈(80∶20),流速1.0 mL/min,柱温30℃,检测波长250 nm.结果 18α-甘草酸和18β-甘草酸达到基线分离,两者的进样量在1.0～2.0 μg范围内与峰面积线性关系良好,r＝0.999 8(n＝6),平均回收率分别为99.58%和99.94%,RSD分别为0.54%和0.28%(n＝9).结论 所用方法简便、快速,可同时测定18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量.
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RP-HPLC法同时测定甘草酸制剂中18α -、18β-甘草酸的含量
目的:建立RP - HPLC法同时测定甘草酸制剂中18α -、18β-甘草酸的含量.方法:采用Phenyl - Hexyl(4.6 mm× 250mm,5μm)色谱柱,流动相为10 mmol·L-1醋酸铵溶液(pH =7.75) -乙腈(83∶ 17),流速1.0 mL·min-1,柱温38℃,检测波长250 nm.结果:18α -、18β-甘草酸的线性范围均为0.3 ～ 80 μg·mL-1(r2分别为0.9998和0.9999).两差向异构体得到良好的分离,各制剂中异构体的组成比各不相同.结论:该方法准确,简便,重复性好,可为控制甘草酸制剂中18α -甘草酸和18β-甘草酸的质量标准提供参考,为对18α -甘草酸和18β-甘草酸的进一步研究奠定了基础.
