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甘草次酸衍生物的合成及其抗肝癌活性
目的:以天然产物甘草次酸为原料来合成新型衍生物,并研究其体内外抗肿瘤活性.方法:利用拼合原理将具有保肝协同作用的苦参碱和氮芥类药物美法仑分别与18α-甘草次酸连接,设计合成了2个未见文献报道的新型甘草次酸衍生物7和8.目标产物经元素分析,1 H-NMR,MS分析确证.采用MTT法测试甘草次酸衍生物在人肝癌细胞SMMC-7721的体外抗肿瘤活性和对大鼠正常肝细胞BRL的毒性.结果:化合物7活性较为显著且无细胞毒性,进一步进行小鼠体内试验,给药剂量为6,9 μmol· kg-1,化合物7对HepA肿瘤的抑瘤率分别为40.72％,60.12％,优于母体药物18α-甘草次酸,而给药剂量为6 μmol· kg-1的美法仑的抑瘤率为39.93％.结论:化合物7体外、体内对肝癌的抗肿瘤活性均较为显著,值得进一步研究开发.
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甘草次酸18位差向异构体对P-gp底物罗丹明123在Caco-2细胞上跨膜转运的影响
目的 研究甘草次酸18位差向异构体即18α-甘草次酸(α-GA)、18β-甘草次酸(β-GA)对P-糖蛋白(P-gp)底物罗丹明123在Caco-2细胞上跨膜转运的影响.方法 采用MTT法检测不同摩尔浓度的18α-甘草次酸、18β-甘草次酸及维拉帕米对Caco-2细胞生长抑制作用;建立Caco-2单层细胞模型,以P-糖蛋白底物罗丹明123(Rho-123)为荧光探针,评价甘草次酸18位差向异构体和P-糖蛋白抑制剂维拉帕米对罗丹明123在Caco-2细胞上跨膜转运的影响.罗丹明123浓度采用酶标仪检测.结果 高浓度(10 μmol ·L-1)18α-甘草次酸瞬时作用于Caco-2细胞单层模型,或者干预单层模型72 h后,均使罗丹明123单位面积BL-AP 侧累积转运量(transport B-A)增加,外排率(ER)增大,诱导P-糖蛋白底物罗丹明123外向转运;高浓度(10 μmol·L-1)18β-甘草次酸瞬时作用于Caco-2细胞单层模型没有表现出诱导作用,但在干预Caco-2单层模型72 h后,表现出对罗丹明123外向转运的诱导;各实验药物均没有对罗丹明123 AP-BL侧转运产生影响.结论 跨膜转运实验结果表明,18α-甘草次酸、18β-甘草次酸能诱导P-糖蛋白的外向转运,加速P-糖蛋白底物的外排,可能是甘草酸制剂增强肝脏解毒的机制之一.
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美法仑-甘草次酸复合物的合成及其体外抗肿瘤活性研究
目的：设计合成美法仑–甘草次酸复合物，并对其体内外抗肿瘤活性进行研究。方法以美法仑和18α-甘草次酸为原料，通过酯化、氧化、酰化和缩合反应制备目标化合物3a 和3b，结构经元素分析、MS、1H-NMR 确证，并采用 MTT法对其体外抗肿瘤活性进行研究，同时考察了其对正常大鼠肝细胞 BRL 和小鼠成纤维细胞 L929的细胞毒性。结果目标化合物3a、3b 的体外抗肿瘤活性明显优于母体药物18α-甘草次酸和美法仑，且对正常细胞的毒性小于氮芥类药物美法仑。结论美法仑–甘草次酸复合物3a 和3b 抗肿瘤活性良好，具有开发成抗肿瘤候选药物的前景。
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美法仑衍生物的合成及其抗肿瘤活性研究
目的：以苦参碱和18α-甘草次酸作为载体对美法仑进行结构拼合，并对其体内外抗肿瘤活性进行研究。方法以槐果碱和美法仑为原料，经过加成、酰化反应合成了美法仑衍生物2；以18α-甘草次酸和美法仑为原料，经酯化和酰化反应合成了美法仑衍生物5，目标化合物的结构经元素分析、MS、1H-NMR确证，并采用MTT法对其进行体外抗肿瘤活性研究，对体外活性较为显著的化合物2进行小鼠体内试验。结果目标化合物2和5的合成总收率分别为21.3%、18.1%。目标化合物2的体外抗肿瘤活性明显高于化合物5、18α-甘草次酸、苦参碱和美法仑。体内活性试验中，目标化合物2给药剂量为6、9μmol/kg时对HepA肿瘤的抑瘤率分别为52.00%、62.12%，而6μmol/kg美法仑的抑制率为39.93%，化合物2的抑瘤效果优于美法仑，尤以高剂量效果为明显。结论化合物2表现出体外、体内较高的抗肿瘤活性，值得进一步研究。
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G JIC 渐弱剂18α－甘草次酸对兔脂肪细胞向成骨细胞横向分化的影响
目的：探讨缝隙连接通讯渐弱剂18α－甘草次酸（ GA）对脂肪细胞向成骨细胞横向分化及细胞间缝隙连接通讯的影响。方法选取3月龄新西兰大白兔腹股沟处脂肪组织，分离提取成熟脂肪细胞，使其去分化得到去分化脂肪细胞，取第三代去分化的脂肪细胞进行成骨诱导，加入GJIC渐弱剂18α－GA设为减弱组，并设立对照组， MTT法观察18α－GA对细胞倍增是否有影响，进行茜素红钙结节染色和I型胶原免疫组化染色对成骨细胞定性检测，Western blot技术和划痕标记染料示踪法检测缝隙连接蛋白43（ Cx43）的表达。结果MTT法检测结果显示18α－GA对细胞生长增殖无显著影响。茜素红染色显示均发现紫红色结节。免疫组化染色显示减弱组I型胶原表达减弱，SLDT 法显示减弱组荧光染料扩散低于对照组，Western blot技术检测结果显示减弱组Cx43蛋白的表达下降。结论18α－GA可以减弱缝隙连接通讯以降低脂肪细胞向成骨细胞分化的能力。
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大鼠肝微粒体CYP3A1/2和CYP2C9/10参与甘草次酸羟化代谢
目的:对参与18α-甘草次酸(GA)羟化代谢的细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)亚型进行研究.方法:采用大鼠肝微粒体体外代谢GA的孵育方法和高效液相色谱(HPLC)技术,通过分析甘草次酸在肝微粒体中形成的单羟化代谢物的酶促动力学,分析其酶学模型,然后用不同的CYP同工酶选择性抑制剂和底物进行抑制实验,初步选出介导甘草次酸单羟化代谢所涉及的CYP同工酶.结果:大鼠肝微粒体羟化代谢GA呈反应时间(10～40 min),底物浓度(25～200 μmol/L)和蛋白浓度(0.25～1.0 g/L)依赖性.GA代谢为22α-羟-GA和24-羟-GA的Vmax分别为(7.9±1.4) μmol· min-1·g-1和(3.4±1.0) μmo1·min-1·g-1,Km分别为(33±9) μmol/L 和(68±18) μmol/L.抑制性研究可见:TAO和Ery剂量依赖性抑制22α-羟-GA形成,大抑制率分别为 82.4%和 45.7%,而Sul无显著抑制作用;Sul剂量依赖性抑制24-羟-GA形成,抑制率依次为 26.8%、45.3%和 69.5%,而TAO和Ery的抑制作用不显著.红霉素N-脱甲基酶活性与22α-羟化代谢速率高度相关(r=0.864, P《0.01,n=10),与24-羟化代谢速率无明显相关(r=0.310, P》0.05,n=10).结论:大鼠肝微粒体CYP3A1/2和CYP2C9/10分别参与了GA的C-22α和C-24羟化代谢.
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缝隙连接阻断剂对体外培养的大鼠血管平滑肌细胞表型转化的影响
目的 探讨缝隙连接阻断剂对大鼠血管平滑肌细胞表型转化的影响.方法 采用贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞,细胞免疫荧光染色法检测大鼠主动脉平滑肌细胞缝隙连接蛋白43的表达,荧光漂白后恢复技术检测缝隙连接介导的细胞间通讯.四唑盐比色法测定细胞增殖能力,逆转录聚合酶链反应法检测平滑肌α-肌动蛋白的表达,并观察缝隙连接特异性阻断剂18α-甘草次酸对上述指标的影响.结果 大鼠血管平滑肌细胞体外培养3天后可表达缝隙连接蛋白43.荧光物质能够通过缝隙连接在相邻细胞间进行传递,孤立细胞荧光恢复率显著低于相邻细胞(7.30%±0.58%比80.61%±6.57%,P<0.01);而18α-甘草次酸能够抑制缝隙连接介导的细胞间通讯,18α-甘草次酸组荧光恢复率显著低于对照组(61.43%±7.62%比80.61%±6.57%, P<0.05).18α-甘草次酸可抑制血管平滑肌细胞增殖,并且可促进平滑肌α-肌动蛋白信使核糖核酸的表达.结论 缝隙连接阻断剂可促进大鼠血管平滑肌细胞由合成型向收缩型转化,提示缝隙连接在调节血管平滑肌细胞表型转化过程起一定作用.
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内皮缝隙连接在介导细胞间交联和损伤血管内皮修复中的作用
目的 探讨内皮缝隙连接在介导细胞间通讯及在损伤血管内皮修复中的作用.方法 采用植块法培养大鼠主动脉内皮细胞,细胞免疫荧光染色法检测大鼠主动脉内皮细胞缝隙连接蛋白37、40及47的表达,荧光漂白后恢复技术检测缝隙连接介导的细胞间通讯.机械划痕建立内皮损伤模型,每24 h摄像一次以定量分析内皮损伤修复速度,并观察缝隙连接特异性阻断剂18α-甘草次酸对内皮损伤后修复的影响.结果 缝隙连接蛋白37、40及47在内皮细胞中均有表达.荧光物质能够通过缝隙连接在相邻细胞间进行传递,孤立细胞荧光恢复率显著低于相邻细胞(5.70%±0.63%比82.26%±1.68%,P＜0.01);而18α-甘草次酸能够抑制缝隙连接介导的细胞间通讯,18α-甘草次酸干预组荧光恢复率显著低于对照组(53.58%±1.73%比82.26%±1.68%,P＜0.05).内皮划痕宽度在对照组与18α-甘草次酸干预组之间无显著性差异(396.57±25.32 μm比370.12±19.40 μm,P＞0.05),内皮损伤24 h后,18α-甘草次酸干预组划痕宽度显著大于对照组(237.38±20.40 μm比126.29±21.40 μm,P＜0.05).18α-甘草次酸干预组内皮损伤完全愈合时间显著多于对照组(4.2±0.2天比2.6±0.3天,P＜0.05).结论 内皮细胞间存在缝隙连接介导的细胞间通讯,而18α-甘草次酸能抑制这种细胞间通讯并减慢内皮损伤修复速度及延长其愈合时间,提示内皮细胞缝隙连接在内皮损伤后修复过程中起重要作用.
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甘草提取物及其主要成分对HepG2细胞中二相代谢酶UGT1A基因表达的影响
目的 研究甘草提取物及18α-甘草酸(18α-GL)、18β-甘草酸(18β-GL)、18α-甘草次酸(18α-GA)、18β-甘草次酸(18β-GA)对HepG2细胞上UGT1A蛋白表达和UGT1A mRNA作用的影响.方法 建立HepG2细胞模型,采用Western blot分析HepG2细胞中二相代谢酶UGT1A的蛋白表达,采用Q-PCR从转录水平检测UGT1A mRNA.结果 Western blot买验结果表明18α-GL、18β-GL对UGT1A的蛋白表达有增加作用但差异无统计学意义;18α-GA和18β-GA使UGT1A的蛋白表达量增加且具差异有统计学意义(P＜0.05).Q-PCR实验结果表明18α-GL、18β-GL使UGT1A的mRNA表达有上调作用;18α-GA对UGT1A的mRNA表达有上调作用,但差异没有统计学意义,而18β-GA使UGT1A的mRNA表达上调,且差异有统计学意义(P＜0.05).结论 甘草提取物、18α-GL、18β-GL、18α-GA和18β-GA对UGT1A蛋白表达和mRNA影响均表现为诱导作用,且18β-GA对UGT1A的诱导作用差异有统计学意义.
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18α－GA通过上调蛋白酶体活性促进晚期骨髓间充质干细胞增殖
目的：明确18α－甘草次酸（18α－glycyrrhetinic acid，18α－GA）对晚期骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells ，BMSCs）衰老标志物和增殖能力的影响。方法：晚期BMSCs （≥14代）应用2．0 mg／L的18α－GA持续作用30 d，比较18α－GA组与DMSO组蛋白酶体活性；衰老相关β－半乳糖苷酶（ senescence－associatedβ－galactosidase，SA－β－Gal）染色和Western blot检测衰老相关蛋白p53、p21和p16的表达变化；CCK－8、BrdU掺入试验、流式细胞术和Western blot分别检测细胞增殖能力、细胞周期分布及细胞周期相关分子表达变化。结果：应用18α－GA后BMSCs蛋白酶体活性较DMSO组增高约0．2倍（P＜0．01）。18α－GA组SA－β－Gal阳性衰老细胞较DMSO组减少，且细胞着色浅淡；衰老相关蛋白p53和p21表达水平分别较对照组降低（P＜0．05）。 CCK－8实验及流式细胞术结果显示18α－GA组细胞增殖能力较DMSO组增高，S期细胞显著增多（P＜0．05），18α－GA组BrdU染色阳性细胞率较DMSO对照组增高（P＜0．05）。18α－GA组细胞周期相关蛋白cyclin D1及CDK4表达水平分别较DMSO组增高（P＜0．05）。结论：18α－GA可激活晚期BMSCs蛋白酶体活性延缓细胞衰老，并且可能通过上调细胞周期相关蛋白表达水平促进晚期BMSCs增殖。
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18α(18β)-甘草次酸30位酰胺衍生物的合成工艺研究
目的 制备甘草次酸30位酰胺类衍生物N-β-羟乙基-18β-甘草次酸-30-酰胺(Ⅲ)和N-β-羟乙基-18α-甘草次酸-30-酰胺(Ⅳ),并优化其制备工艺.方法 18β-甘草次酸(18β-GA,Ⅰ)经高温碱催化进行构型转化反应得到18α-甘草次酸(18α-GA,Ⅱ);化合物Ⅰ、Ⅱ分别与2-氨基乙醇缩合制得目标化合物Ⅲ、Ⅳ;用常规光谱方法鉴定结构;同时考察不同种类缩合剂、溶剂量、物料比、处理方法对目标化合物产率的影响,筛选佳制备工艺.结果 目标化合物Ⅲ、Ⅳ的产率分别为63％、48％.结论 确定以EDCI、HOBt、DMAP为催化系统,配料比分别为18β-GA-EDCI-HOBt-DMAP(1∶1.5∶1∶0.5)及18α-GA-EDCI-HOBt-DMAP(1∶2∶1∶0.5),二氯甲烷为溶剂,化合物Ⅲ、Ⅳ的反应时间分别为18、28h,所用工艺是制备甘草次酸30位酰胺类衍生物的较好工艺.
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18α-甘草次酸及其甲酯的制备
目的 制备具有肝靶向潜能的18α-甘草次酸及其甲酯.方法 18β-甘草次酸与盐酸的无水甲醇溶液一起加热,经碱性水解、酸化制备了18α-甘草次酸,再经酯化获得了其甲酯.结果 制备了18α-甘草次酸(产率34%)及其甲酯;对合成工艺、理化性质和光谱特征进行研究,优化了制备工艺.结论 在酸性条件下对18β-甘草次酸进行酯化,再经碱构型转化、水解并用混合溶剂结晶是制备18α-甘草次酸的较好途径.
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光学异构体18α-甘草次酸制备方法研究
目的 对18α-甘草次酸(18α-Glycyrrhetinic acid,18α-GA) 的制备工艺进行优化并结构表征.方法 以天然甘草三萜皂苷元18β-甘草次酸(18β-GA)为原料,分别利用分步反应法和一锅法制得其光学异构体18α-GA,对2种制备方法 的工艺和产率进行考察;用常规的四大光谱法确定化学结构.结果 用分步反应法制得目标化合物的总产率为45%;而用一锅法可直接制得目标产物,产率达63%,简化了操作流程,缩短了反应时间,提高了反应产率;详细描述了目标化合物的光谱特征和理化性质.结论 用一锅法制备18α-甘草次酸的操作简单,产率高,是制备光学纯度较高的18α-甘草次酸的较好途径.
