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UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术鉴定石斛碱在人肝微粒体中的代谢产物
目的:通过UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术对石斛碱在人肝微粒体中的主要代谢产物进行鉴定与分析.方法:运用人肝微粒体体外温孵法,模拟细胞色素P450酶(CYP450)及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)酶反应体系,采用ThermoQ-Exactive型四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统分析,Hypersil Gold C18色谱柱(2.1 mm ×150 mm,1.9 μm),流动相0.1％甲酸水溶液-乙腈梯度洗脱,流速0.3 mL· min-1,电喷雾离子源(ESI)正离子模式检测.结果:通过精确相对分子质量和二级碎片离子信息,鉴定了石斛碱在入肝微粒体中Ⅰ相代谢的4个主要代谢产物,依次标记为M-250([M+H]+m/z250.180 1),M-262([M+ H]+m/z 262.180 0),M-280([M +H] +m/z 280.190 6),M-296([M+H]+ m/z 296.185 6),以及Ⅱ相代谢的1个主要代谢产物,标记为M-440([M]+m/z 440.227 8).结论:所建立的UPLC/LTQ-Orbitrap-MS测定人肝微粒体中石斛碱及其代谢产物的方法灵敏、快捷,可应用于石斛碱在人肝微粒中的代谢研究,同时为石斛碱的药物代谢动力学研究提供了实验依据.
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Beagle犬肝微粒体中葛根素的HPLC-ESI-MS测定及代谢动力学研究
目的:建立Beagle犬肝微粒体中葛根素及其代谢物的液相色谱质谱测定方法,并对葛根素在Beagle犬肝微粒体中的代谢动力学进行研究.方法:超速离心法制备Beagle犬肝微粒体;Shimadzu-ODS色谱柱(2.0mm×150 mm,5 μm);流动相甲醇-水梯度洗脱,正离子模式,选择离子扫描m/z 417(M+H)+(葛根素),m/z 531(2M+Na)+(大豆苷元).结果:在体外代谢系统中,葛根素在Beagle犬肝微粒体中被代谢为大豆苷元,其酶促动力学参数Vmax为(0.047±0.006)mg·min-1·g-1,K为(1.22±0.53)mg·L-1.结论:该HPLC-MS法能够准确灵敏测定犬肝微粒体中葛根素和大豆苷元;葛根素在Beagle犬肝微粒体中被P450酶代谢为大豆苷元,同时为白葛胶囊后续研究奠定基础.
关键词： 葛根素 大豆苷元 HPLC-ESI-MS 肝微粒体 体外代谢 -
齐墩果酸和熊果酸的人肝微粒体代谢研究
目的 研究齐墩果酸和熊果酸的体外代谢差异,对参与熊果酸代谢的细胞色素P450酶进行鉴定.方法 考察齐墩果酸在人肝微粒体孵育体系中的代谢稳定性;采用9种细胞色素P450(CYP)选择性抑制剂和14种人重组CYP单酶分别与熊果酸共孵育,利用高效液相法检测熊果酸及代谢产物的含量,并且测定相关动力学参数Km和Vmax.结果 齐墩果酸在人肝微粒体中不代谢,熊果酸在人肝微粒体和人重组CYP单酶中的动力学行为符合米氏动力学行为,CYP3A4和CYP2C9参与了熊果酸的代谢.结论 本研究阐述了齐墩果酸和熊果酸的体外代谢规律,尤其是熊果酸的细胞色素P450代谢酶,丰富了五环三萜类化合物的药物代谢研究.
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芦荟大黄素的体外肝微粒体代谢动力学和代谢酶表型研究
目的 研究芦荟大黄素在人肝微粒体(HLM)和大鼠肝微粒体(RLM)的代谢特征,并确定其代谢酶表型.方法 将芦荟大黄素分别与加入不同辅酶因子的人和大鼠肝微粒体孵育,LC-MS/MS法定量分析芦荟大黄素的剩余含量,考察芦荟大黄素的代谢稳定性和酶动力学.将芦荟大黄素分别与一组重组人源CYP同工酶(CYP1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、3A4)孵育,或在HLM中加入各同工酶的特异性抑制剂,确定其CYP酶代谢表型.结果 在HLM和RLM中,芦荟大黄素均可发生依赖于NADPH的Ⅰ相代谢消除.经加热法确定,Ⅰ相代谢主要由CYP酶介导,30 min的代谢百分率分别为85.8%和81.7%,消除半衰期t1/2分别为(10.3±0.3)min和(11.5±3.3)min;内在清除率CLint分别为(420.1±10.9)和(573.4±188.2)ml/(min·kg);表观酶动力学参数Km分别为(2.4±0.9)和(3.9±1.4)μmol/L,Vmax分别为(1492±170.5)和(2783±595.8)nmol/(min·g protein).在RLM中还观察到芦荟大黄素的葡糖醛酸结合反应,30 min代谢转化率为38.5%,消除半衰期t1/2为31.6 min,CLint为(197.1±15.5)ml/(min·kg).CYP酶代谢表型研究表明,芦荟大黄素的肝微粒体代谢由多个CYP同工酶介导,其中CYP1A2、3A4、2B6和2C9的整体归一化贡献率分别为35.4%、21.9%、6.6%和6.8%.结论 芦荟大黄素在HLM和RLM中,主要发生多个CYP同工酶介导的Ⅰ相代谢消除,其中CYP1A2和3A4的代谢贡献率>20%;HLM和RLM代谢存在一定的种属差异,RLM还存在葡糖醛酸结合反应.
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右旋黄皮酰胺在大鼠肝微粒体中的代谢转化
目的:研究黄皮酰胺的主要代谢途径,为进一步研究黄皮酰胺代谢的立体选择性打下基础.方法:用大鼠肝微粒体体外温孵法对右旋黄皮酰胺((+)-clausenamide)进行温孵,用硅胶柱色谱、制备TLC分离纯化代谢产物并通过光谱分析鉴定其结构.结果:分离得到5个代谢产物CM1,CM3,CM4,CM5及CM6,其结构分别鉴定为6-羟基,4-羟基,4,6-二羟基,4-苯环邻位羟基,4,7-苯环间位-二羟基黄皮酰胺.结论:黄皮酰胺的代谢主要发生羟化或双羟化,CM3是其主要代谢产物,量较少的CM4,CM6为其进一步代谢产生的双羟基代谢产物;另2个代谢产物CM1,CM5产生的量也较少;CM2未分离得到,但通过HPLC分析知其为右旋黄皮酰胺的微量代谢产物.
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新型抗肿瘤微管抑制剂IG-105的体外代谢及药物相互作用的研究
Ⅳ-(2,6-二甲氧基吡啶-3-取代)-9-甲基咔唑-3-磺酰胺(IG-105)是全新结构的小分子微管解聚合剂,在体外和动物实验中显示出较好的抗肿瘤活性.为了解IG-105的代谢性质并评价代谢性药物相互作用可能性,使用混合人肝微粒体(HLMs)和重组CYP450同工酶(rP450s)研究参与IG-105生物转化的药物代谢酶,利用液相色谱-静电场轨道阱质谱(HPLC-Orbitrap-MS)鉴定可能的代谢产物,并评估IG-105对5种主要CYP450酶的抑制作用.结果显示,IG-105可以被包括CYP1 A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4和CYP3A5在内的多种P450酶代谢,其中IG-105的代谢有可能是由CYP1 A2、CYP2B6、CYP2C 19和CYP3A介导的;脱甲基化是IG-105主要的Ⅰ相代谢反应,鉴定出3种代谢产物(M1～M3);同时IG-105对CYP1 A2、CYP2C9、CYP2C 19、CYP2D6和CYP3A具有一定的抑制作用,IC50值分别为6.4、23.64、0.39、1.4和3.14 μmol·L-1.结果表明,IG-105的生物转化涉及多个酶途径,当与其他药物合用时,由于其他药物抑制某种P450酶的活性而使IG-105代谢受阻从而引起毒副作用的风险较低;同时,IG-105对CYPl A2、CYP2D6和CYP3A具有中度抑制作用,对CYP2C19具有较强的抑制作用,因此与主要被这些酶代谢的药物合用时应格外注意药物相互作用,避免毒副作用.
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黄芩苷与黄芩素在离体大鼠肝、肾、小肠及膀胱中代谢的相互转化
黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)是一种常用的中药, 在传统的中药方剂中被广泛用于治疗发炎、 发热、 咳嗽、 痢疾、 黄疸、 肝炎及高血压等症.黄芩苷(baicalin,BG)与黄芩素(baicalein,B)(图1)是黄芩中两种主要的有效黄酮类成分,具有抗菌、抗病毒、抗炎、清除氧自由基、调节免疫、保护大鼠脑损伤等多种作用[1～3].
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力达霉素的体外代谢
旨在研究力达霉素在血浆和肝微粒体中的体外代谢性质,指导临床合理用药.选择HPLC-MS/MS测定方法,通过测定力达霉素的活性成分,考察力达霉素在大鼠、比格犬、猕猴和人血浆及肝微粒体中的代谢稳定性以及在人肝微粒体中对细胞色素P450 (cytochrome P450,CYP450)各亚型酶的抑制作用.结果表明,力达霉素在4个种属血浆中均有代谢,其代谢速率为大鼠＞比格犬＞人＞猕猴;在4个种属肝微粒体中,只有在猕猴肝微粒体中代谢；在浓度为0.000 5～10 ng·mL-1时,对人肝微粒体中细胞色素P450各亚犁酶几乎无抑制作用.可见力达霉素在人体内的代谢性质与比格犬体内较相似,而且临床上当力达霉素与通过CYP450酶代谢的药物合用时,不会导致这些药物的代谢减慢.
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用体外代谢数据预测临床上药物体内代谢性相互作用
用体外代谢数据可以预测临床上药物体内代谢的相互作用.本文介绍其中一些重要概念、预测模型、方法及影响预测准确性的因素.
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重组人代谢酶酵母表达系统在新药体外代谢研究中的作用
重组人代谢酶酵母表达系统是指利用基因重组技术将人的药物Ⅰ相代谢酶和Ⅱ相代谢酶基因转染至酵母细胞从而高效地获得单一的重组人代谢酶酵母.本文通过查询国内外文献总结了重组人代谢酶酵母表达系统在新药体外代谢研究中的作用.在新药研发的早期阶段,利用重组人代谢酶酵母系统,确定候选药物(或新药)的代谢途径及代谢酶亚型;评估候选药物(或新药)对代谢酶的诱导和抑制作用;研究代谢酶基因多态性相关的药物相互作用;筛选和制备候选药物(或新药)的新代谢物.重组人代谢酶酵母表达系统不仅为新药研发提供更加高效、便利的高通量新药筛选平台,也为候选药物的安全性评价提供物质基础.
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二-(4-氯苯甲酰异羟肟酸)二正丁基合锡在大鼠肝微粒体中的代谢研究
目的 体外研究二-(4-氯苯甲酰异羟肟酸)二正丁基合锡(DBDCT)在大鼠肝微粒体中的代谢及酶促动力学,并探讨参与其代谢的主要CYP450同工酶亚型.方法 优化二-(4-氯苯甲酰异羟肟酸)二正丁基合锡在大鼠肝微粒体中的孵育条件,并对其在不同酶源中的酶促动力学进行研究；通过体外抑制实验初步探讨参与二-(4-氯苯甲酰异羟肟酸)二正丁基合锡代谢的主要CYP450同工酶的亚型.结果 不同酶源代谢实验显示,苯巴比妥(PB)、地塞米松(Dex)诱导组和空白对照组比较有显著性差异,而β-萘黄酮(BNF)组和空白对照组无明显差异；抑制实验显示酮康唑对二-(4-氯苯甲酰异羟肟酸)二正丁基合锡的代谢有较强的抑制作用；结论 二-(4-氯苯甲酰异羟肟酸)二正丁基合锡在大鼠肝微粒体中代谢较快,CYP3A在催化二-(4-氯苯甲酰异羟肟酸)二正丁基合锡代谢中起了主导作用,CYP2C9可能部分参与,而CYP1A对二-(4-氯苯甲酰异羟肟酸)二正丁基合锡的代谢无明显催化作用；提示二-(4-氯苯甲酰异羟肟酸)二正丁基合锡与经上述同工酶代谢的药物联合应用时,应注意药物之间相互作用的可能性.
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丹参素-吡嗪酯类脑靶向衍生物设计合成及体外代谢研究
目的 设计合成丹参素脑靶向衍生物,并研究其在大鼠体外血浆和脑匀浆中的代谢.方法 将四甲基吡嗪及其衍生物作为载体引入丹参素设计脑靶向衍生物,借助计算软件对化合物的脂水分配系数、脑血浓度比、P-糖蛋白亲和力等参数进行预测,筛选出较优化合物DT3进行化学合成;采用HPLC-UV测定DT3及中间产物DT1在大鼠血浆和脑匀浆中的降解情况.结果 制备了两种丹参素-吡嗪酯类衍生物——DT1和DT3;建立了DT3、DT1和羟甲基川芎嗪在大鼠血浆和脑匀浆中同步检测方法;DT3在血浆和脑匀浆中均经历DT3→DT1→活性代谢物过程;DT3在血浆中降解相对于DT1有所减缓,其羟甲基川芎嗪的t1/2分别为1.71和1.68 min;DT3在脑匀浆可快速代谢出羟甲基川芎嗪,且浓度呈现平稳增加,t1/2达222.88 min.结论 本实验设计合成的丹参素-吡嗪酯类衍生物DT3延长了血浆t1/2,同时能在脑匀浆快速降解出活性代谢物.
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UPLC-Q-TOF-MS法鉴定连翘脂素在人肝微粒体中的代谢产物
目的 建立体外人源肝微粒体孵育体系,应用UPLC-Q-TOF-MS法,首次对连翘脂素在人肝微粒体中的代谢产物进行鉴定.方法 采用Phenomenex Kinetex C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,2.6 μm),以0.1％甲酸水-乙腈为流动相进行梯度洗脱,流速为400 μL·min-1;进样量5μL.采用正离子模式进行检测,电喷雾离子源,源温度为550℃,质量数扫描范围m/z 100～1 000.结果 对ESI-MS正离子模式下连翘脂素可能的裂解途径进行了推测,同时鉴定了连翘脂素在肝微粒体中的8个代谢产物.结论 所建立的连翘脂素在人肝微粒体中的UPLC-Q-TOF-MS测定法方便快捷,可应用于连翘脂素在人肝微粒中的代谢研究,同时为连翘脂素的药物代谢动力学提供了依据.
关键词： 连翘脂素 人肝微粒体 体外代谢 超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱 -
大鼠原位肝灌流及体外肝微粒体温孵研究对甲基苯磺酰胺代谢的影响因素
目的研究抗肿瘤新药对甲基苯磺酰胺(PTS)肝代谢过程中对大鼠CYP3A2,CYP2D1,CYP1A2的影响,P-糖蛋白抑制剂对PTS代谢的影响,PTS合并用药时的代谢变化.方法♂Wistar大鼠分组ip苯巴比妥,酮康唑和维拉帕米连续给药3 d后肝灌流PTS 25 μmol·L-1,比较空白组与各处理组PTS代谢变化.♂Wistar大鼠分组ip PTS 33和99mg·kg-1·d-1连续给药4 d后分别肝灌流CYP3A2,CYP2D1底物右美沙芬和CYP1A2底物非那西丁.比较空白组与PTS处理组对CYP3A2,CYP2D1,CYP1A2活性的影响.体外实验右美沙芬40μmol·L-1和非那西丁20 μmol·L-1与不同浓度的PTS在空白微粒体中温孵.PTS与不同浓度依托泊苷(VP-16),氟尿嘧啶(5-FU)在空白微粒体中温孵.结果苯巴比妥诱导组PTS代谢加快,酮康唑组代谢减慢.右美沙芬和非那西丁代谢在温孵反应中与空白组无显著差别.依托泊苷体外实验中抑制PTS代谢达50.7%,氟尿嘧啶对PTS代谢没有影响.结论大鼠原位肝灌流是良好的整体器官药物代谢模型,是体外实验有力的补充.PTS大鼠肝代谢与CYP450相关.PTS代谢不影响CYP3A2,CYP2D1,CYP1A2活性.P-糖蛋白抑制剂不影响PTS在实验条件下的代谢.合并用药的依托泊苷对PTS肝代谢有显著抑制.
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手性药物体外代谢的研究方法
手性药物体外代谢的研究是通过建立体外代谢模型对手性药物的代谢行为进行评价.随着大量手性药物的开发,出现了多种与体外代谢相关的研究方法和技术来评价对映体之间的分子以及代谢动力学方面的差异,从而选择出对映体.现对已有的一些研究方法及其优缺点进行综述,从而提供更系统化的手性药物的评选方法,更快速有效地为手性药物提供技术支持.
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去甲斑蝥素体外肝细胞代谢产物的HPLC-MS分析
目的：建立去甲斑蝥素体外肝细胞代谢产物的HPLC-MS分析方法。方法去甲斑蝥素进行体外肝细胞代谢，透析得到代谢产物，并用HPLC-MS对产物进行鉴定，再通过半制备HPLC色谱仪分离纯化，后根据理化性质和波谱数据鉴定代谢物的结构。结果共分离得到7个化合物，对其中量较高的2个化合物进行结构鉴定，分别为去甲斑蝥素与谷氨酸结合物（1）、去甲斑蝥酸钠（2）。结论体外细胞代谢法由于反应条件相对单纯，易于控制，适合于制备去甲斑蝥素体外肝细胞代谢产物。
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去甲斑蝥新型衍生物N-14NCTDA大鼠肝微粒体酶代谢
目的 初步阐明十四烷基去甲斑蝥素酰亚胺(tetradecyl derivative of norcantharidin,简称N-14NCTDA)肝微粒体酶代谢情况,鉴定该药物体外Ⅰ相代谢产物,并推测其主要代谢途径.方法 以超速离心法制备大鼠肝微粒酶并以二辛可酸(butyleyanoacrylate,BCA)法测定微粒体蛋白浓度.药物与肝微粒体在一定条件下孵育,使用飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF MS)进行分析.结果 制备的大鼠肝微粒体酶蛋白质量浓度约为6.4 g·L-1.代谢研究结果显示,孵育后反应液中主要检测到3个代谢产物,其分子离子峰相对分子质量分别为380.280 6、378.264 8和394.259 7,分别对应原型药羟基化、醛基化及羧化产物.结论 UPLC/Q-TOF MS方法适用于N-14NCTDA和其代谢产物的定性鉴别.体外初步代谢结果表明,N-14NCTDA的酰亚胺键难以在肝脏水解释放出NCTD,其主要以末端烷基氧化的方式进行Ⅰ相代谢.
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野百合碱在5种肝微粒体中的体外代谢研究
目的 研究野百合碱在5种不同肝微粒体中的体外代谢.方法 通过对肝微粒体蛋白浓度和孵育时间等条件的考察优化野百合碱与肝微粒体的反应体系,用HPLC-MS定性/定量检测孵育体系中的野百合碱及代谢产物,分析比较野百合碱在经地塞米松诱导的F344大鼠、F344大鼠、人、SD大鼠、ICR小鼠肝微粒体中代谢率和代谢产物的差异.结果 体系的优选条件为肝微粒体质量浓度2 mg/mL,孵育时间90 min,野百合碱在地塞米松诱导的F344大鼠、F344大鼠、人、SD大鼠、ICR小鼠肝微粒体代谢率分别为9.91％,5.45％,0.25％,1.01％,4.25％.在5种肝微粒体中均检测到两个代谢产物:野百合碱-N-氧化物和DHP[(+/-)6,7-dihydro-7-hydroxy-1-hydroxymethyl-5H-pyrrolizine].结论 野百合碱在地塞米松诱导的F344大鼠、F344大鼠、SD大鼠、人及ICR小鼠肝微粒体均可发生代谢,但代谢率有一定差异.
关键词： 野百合碱 体外代谢 液相色谱/串联质谱 野百合碱-N-氧化物 DHP -
芬苯达唑前药的体外代谢研究
以人工胃液、人工肠液和小鼠肝匀浆为体外模型,采用高效液相色谱法,对合成的芬苯达唑前药MPT在上述3种生物基质中的代谢进行定量研究,绘制代谢曲线,并测定其对细粒棘球蚴原头节的杀伤作用.结果表明,芬苯达唑前药在人工胃液、人工肠液和小鼠肝匀浆中均可发生代谢,在肝脏匀浆中代谢为有活性的芬苯达唑,代谢率为7.92％.在10 μg/ml芬苯达唑前药的体外作用下,细粒棘球蚴原头节死亡率为45.9％.
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高效液相色谱法测定体外大鼠肠道菌液中大豆苷及其代谢物
目的 建立HPLC法测定体外大鼠肠道菌液中的大豆苷及其代谢物,研究大鼠肠道菌群对大豆苷的代谢情况.方法 采用大鼠离体粪便温孵法,将大豆苷与大鼠肠道菌群培养液进行厌氧温孵.温孵样品采用甲醇沉淀蛋白处理后进行HPLC法分析,色谱条件:色谱柱为Diamonsil C18柱;流动相为0.2％ 乙酸水溶液与甲醇,梯度洗脱;检测波长为260 nm;柱温为25℃;进样量为10μl.结果 大豆苷及其代谢物大豆苷元分别在98.0～490、57.6～288μg/ml浓度范围内线性良好,高、中、低3个浓度的相对回收率在96.6％ ～114.0％ 之间,相对标准偏差小于9.9％,表明本法的准确度和精密度符合要求.大豆苷在肠道菌液中代谢生成大豆苷元,其消除半衰期为37.6 min.结论 所建立的HPLC法适合同时测定体外大鼠肠道菌液中的大豆苷及其代谢物,大豆苷在体外代谢的主要途径为糖苷键断裂转化成对应苷元.
